控制番茄果实形状的基因及克隆方法和应用与流程

文档序号：18603629发布日期：2019-09-03 23:03阅读：3233来源：国知局

本发明涉及植物技术领域，尤其涉及一种控制番茄果实形状的基因及其应用。

背景技术：

果实形状是育种重点关注的农艺性状。其中，对于以鲜果为食用器官的蔬菜作物，果实形状更是重要的商品性状。目前，植物中对于果实形状的研究大致可以分作两类，一类是以水稻的颖果、拟南芥的角果等干果为代表的研究，另一类则聚焦番茄为代表的肉质果实。

在水稻中，颖果的形状往往与米粒的形状一致，因此，颖果的外观品质一直受到育种家的高度关注。中国的学者很早就注意到水稻外形可能与稻米的品质关联，并据此将中国的栽培稻粗略地分为籼稻和粳稻。一般而言，籼稻粒形窄而长，粳稻则短而圆。在分子生物学层面，近年来水稻中鉴定了一系列基因可以通过影响细胞周期机制改变细胞分化进程，进而改变稻粒形状，影响稻米品质，如gw2、qsw5、gs5、gw8、gs3，glw7和gl7/gw7等。

模式植物拟南芥中的研究表明角果的发育取决于顶端分生组织动态变化，其中研究较多且较为清晰的调控机制被称作clv-wus反馈回路(theclv-wusfeedbackcircuit)，核心基因包括clv1、clv2、clv3和wus等。其中clv3编码一种小分子的多肽，与clv1结合位点结合后失去了对wus的转录抑制活性，使wus正常表达，而wus的转录后又会促进clv3的表达，进而“反馈”调节自身的活性。这样的一种动态平衡使得顶端分生组织正常生长，打破这种平衡最终会使拟南芥的器官发生变化(gallietal.,2016；kondoetal.,2006；schoofetal.,2000；zhouetal.,2015)。

番茄是世界栽培最广的果蔬之一，同时也是研究肉质果实生长发育的模式植物。如图1所示的番茄果形图，经过多年以来的自然突变和人为驯化，番茄中积累了极其众多的果形变异，暗示了其巨大的育种潜力以及背后庞大的调控网络。番茄果实的生长发育涉及多个复杂的调控网络，番茄果实形状的发生与决定是果实发育的关键节点。研究番茄果形调控，一方面可以为培育高产优质的番茄新品种奠定基础，另一方面也对其它肉质果实的生长发育调控机制具有重要的指导意义。根据外形大体上可以将番茄的果实形状分为：扁平形(flat)、矩形(rectangular)、椭圆形(ellipsoid)、倒卵形(obovoid)、圆形(round)、牛心形(oxheart)、长形(long)和心形(heart)八种(gustavoetal.,2011)。khambanonda(1950)在研究辣椒果实时首次提出用“果型指数”描述果实形状，即果型指数＝果实纵径/果实横径，用于量化果实形状便于遗传分析。一般可以把果型指数大于1的番茄统称为长圆果，包括上述矩形、椭圆形、倒卵形、牛心形和长形果实。

作为蔬菜食用时，我国市场偏好大果、扁果，而作为鲜食水果时，则需要更多种多样的果形(马兆红，2017)。garcía等(2013)的研究表明，长圆果形的番茄与扁圆形的相比在机械化收割方面有着先天优势，因而加工番茄的品种多为长圆形或椭圆形。

目前，番茄中仅克隆到数个果形调控基因，包括sun、ovate、fas和lc等，其中对扁平果形的研究较为清楚，番茄扁平果形往往伴随着更大的尺寸和更多的心室数，经研究表明此过程同样受clv-wus反馈回路所调控，其中克隆到的基因有与拟南芥wus同源的lc，lc突变导致心室数增加，果实扁平化(munosetal.,2011)。xu等(2015)发现番茄中与clv1同源的fab以及可以修饰clv3同源的fin。fab与fin突变为fab和fin时，果实变扁，进一步研究表明fin编码的阿拉伯糖基转移酶对slclv3的一系列阿拉伯糖基化修饰对顶端分生组织的正常发育至关重要，fin突变会打破clv-wus反馈回路的动态平衡，进而导致果实变扁。此外，研究表明fas编码的yabby2的突变可以带来比lc更加扁平的果形(congetal.,2008)。

目前对于扁平果形的研究较为深入，但对于长圆果只鉴定了sun、ovate、ofp20、trm5数个调控基因。

其中，sun编码一个属于iqd家族的钙结合蛋白(xiaoetal.,2008)，是由于10号染色体上一个24.7kb的区域通过反转录转座子的作用复制到了7号染色体的短臂上，新的染色体环境使得区域内原本表达量极低的sun表达量升高，作用于花芽分化和果实发育时期，使子房或果实的细胞沿近-远轴向生长的同时抑制其横向增粗，最终导致果实呈长形(jiangetal.,2009)。目前，对于sun如何调控果实伸长的分子机理仍不清楚，需要进一步研究。

ovate主要调控梨形、倒卵形果实，编码一类ovatefamilyprotein(ofp)的蛋白，编码区的提前终止会导致番茄果实纵向变长(liuetal.,2002)。ovate特异调控果实的近-远轴向的生长，突变后近远轴向的生长显著快于横向生长，使得子房开花之前果型指数大于1且在后续果实膨大中变为梨形或倒卵形(vanderknaapetal.,2014)。在植物中，ofp往往具有转录抑制活性(liuetal.,2015；wangetal.,2007)，而在番茄中以ovate为钓饵进行酵母双杂交钓库发现其与多个tonneau1recruitingmotif(trm)超家族的蛋白互作，trms据已有报道与tonneau1a(ton1a)、ton1b以及ton2/fass互作，在植物早前期带的形成和微管微丝排布方面起着关键作用(vanderknaapetal.,2014)。值得一提的是在水稻中发现的osspl16-gw7模块可以调控水稻颖果的粒长，其中的gw7即编码一类trm蛋白(wangetal.,2015)。wu等(2018)报道了ovate、ofp20与trm5三者互作调控微管微丝的排列方式，进而决定番茄果实的形状，进一步通过对瓜类果实形状、马铃薯块茎形状形成的分子机制研究，发现大多数植物器官形状的形成都取决于ofp家族和trm家族蛋白的动态变化。

也就是，目前虽然已对于番茄扁圆类型的果形有了初步了解，但对长圆形果实调控基因知之甚少，且同时调控圆形、扁圆、椭圆形果实的基因也未见报道。

技术实现要素：

基于此，有必要提供一种控制番茄果实形状的基因及其克隆方法和应用。该基因可以实现调控番茄形成椭圆果实、圆形果实、扁圆果实，可以在改变番茄果形方面及培育新品种进行应用。

本发明解决上述技术问题的技术方案如下：

一种控制番茄果实形状的基因，所述基因的cdna核苷酸序列如seqidno:1或seqidno:2所示。

一种权利要求1所述的控制番茄果实形状的基因编码的蛋白，所述mel蛋白的氨基酸序列如seqidno:3或seqidno:4所示。

一种含上述所述的控制番茄果实形状的基因的表达载体。

在其中一个实施例中，所述表达载体为p35s-mel超量表达载体，其构建方法采用如seqidno:5和seqidno:6所示的引物序列。

在其中一个实施例中，所述表达载体为mel-rnai表达载体，其构建方法采用如seqidno:7和seqidno:8所示的mel-rnai引物。

在其中一个实施例中，所述表达载体为pmel-mel表达载体，其构建方法采用如seqidno:9和seqidno:10所示的mel自启动子+grna全长引物。

上述所述的控制番茄果实形状的基因、上述所述的蛋白或者上述任一项所述的表达载体在改良番茄果形或者培育番茄新品种中的应用。

一种控制番茄果实形状的基因的克隆方法，包括如下步骤：

采用母本la0963、父本la1589杂交得番茄la0963×la1589f1，番茄la0963×la1589f1自交得到番茄la0963×la1589f2群体；

从番茄la0963×la1589f2植株选取果实为圆形的番茄植株和果实为椭圆形的番茄植株各25-35株，分别混合提取rna进行bsr-seq，确定目的基因位于5号染色体上；

在5号染色体上开发亲本间存在多态性的分子标记，所述分子标记包括ch5-2、5u2-3、5u2-1、5d-19、ch5-20、5d-2、5d3-1、5d-8、ch5-9、ch5-10；其中，ch5-2的序列如seqidno:11和seqidno:12所示；5u2-3的序列如seqidno:13和seqidno:14所示；5u2-1的序列如seqidno:15和seqidno:16所示；5d-19的序列如seqidno:17和seqidno:18所示；ch5-20的序列如seqidno:19和seqidno:20所示；5d-2的序列如seqidno:21和seqidno:22所示；5d3-1的序列如seqidno:23和seqidno:24所示；5d-8的序列如seqidno:25和seqidno:26所示；ch5-9的序列如seqidno:27和seqidno:28所示；ch5-10的序列如seqidno:29和seqidno:30所示；

进一步扩大番茄la0963×la1589f2植株群体，通过分子标记分析1500-1700株f2单株的表型及基因型，利用其中极端表型的单株将目标基因定位于分子标记5d-19和ch5-20之间，区间大小约159k，获取包括solyc05g012710、solyc05g012720、solyc05g012730、solyc05g012740、solyc05g012750、solyc05g012760、solyc05g012770、solyc05g012780、solyc05g012790、solyc05g012800、solyc05g012810、solyc05g012820、solyc05g012830、solyc05g012840、solyc05g012850、solyc05g012860、solyc05g012870的17个orf；

分别提取母本la0963和父本la1589的叶片总rna，用反转录试剂盒反转录成cdna，对区间内的17个orf分别以亲本为模板进行pcr扩增，pcr产物进行sanger测序，比对亲本以及参考基因组之间的序列，得solyc05g012790为mel候选基因。

在其中一个实施例中，在对区间内的17个orf分别以亲本为模板进行pcr扩增的过程，所采用的扩增引物分别为：solyc05g012710对应的扩增引物序列如seqidno:31和seqidno:32所示；solyc05g012720对应的扩增引物序列如seqidno:33和seqidno:34所示；solyc05g012730对应的扩增引物序列如seqidno:35和seqidno:36所示；solyc05g012740对应的扩增引物序列如seqidno:37和seqidno:38所示；solyc05g012750对应的扩增引物序列如seqidno:39和seqidno:40所示；solyc05g012760对应的扩增引物序列如seqidno:41和seqidno:42所示；solyc05g012770对应的扩增引物序列如seqidno:43和seqidno:44所示；solyc05g012780对应的扩增引物序列如seqidno:45和seqidno:46所示；solyc05g012790对应的扩增引物序列如seqidno:47和seqidno:48所示；solyc05g012800对应的扩增引物序列如seqidno:49和seqidno:50所示；solyc05g012810对应的扩增引物序列如seqidno:51和seqidno:52所示；solyc05g012820对应的扩增引物序列如seqidno:53和seqidno:54所示；solyc05g012830对应的扩增引物序列如seqidno:55和seqidno:56所示；solyc05g012840对应的扩增引物序列如seqidno:57和seqidno:58所示；solyc05g012850对应的扩增引物序列如seqidno:59和seqidno:60所示；solyc05g012860对应的扩增引物序列如seqidno:61和seqidno:62所示；solyc05g012870对应的扩增引物序列如seqidno:63和seqidno:64所示。

本发明的有益效果是：

与现有技术相比，本发明通过研究获取到控制番茄果实形状的基因的cdna核苷酸序列如seqidno:1或seqidno:2所示。该基因可以实现调控番茄形成椭圆果实、圆形果实、扁圆果实，可以在通过克隆技术改变番茄果形方面及培育新品种进行应用，满足多样化的果形需求。

附图说明

图1为现有番茄的果形图；

图2为本实施方式的父本la1589、母本la0963以及番茄la0963×la1589f1植株的果实表型图；其中，a对父本la1589的果形图，b为番茄la0963×la1589f1植株的果形图，c为母本la0963的果形图；

图3为本实施方式中bsr-seq的结果图；

图4为本实施方式中对目的基因的精确定位图；

图5为本实施方式中mel/mel基因序列比对图；

图6为本实施方式中mel/mel氨基酸序列比对图；

图7为本实施方式中的mel蛋白的模型结构示意图；

图8为本实施方式中背景材料以及转基因植株的果形图。

具体实施方式

以下对本发明进行举例描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。

本实施方式提供一种控制番茄果实形状的基因的克隆方法，包括如下步骤：

s1，群体构建：

采用母本la0963(s.lycopersicum，mel突变体，引自美国番茄遗传资源中心，果实表型为椭圆形或方形，如图2中的c图所示)、父本la1589(s.pimpinellifolium，野生型，果实表型为正圆形果，如图2中的a图所示)杂交得到番茄la0963×la1589f1植株，其果形为圆形，如图2中的b图所示。

番茄la0963×la1589f1自交收种，得到番茄la0963×la1589f2植株，分离群体。

s2，图位克隆：

对番茄la0963×la1589f2植株群体中共261株的果形进行调查，其中圆果199株，长椭圆果62株。

选取番茄la0963×la1589f2植株群体中，选取果实为圆形的番茄植株和果实为椭圆形的番茄植株各30株，分别混合提取rna进行bsr-seq。结果见图3，从图中发现目的基因位于5号染色体。

请进一步结合图4，在5号染色体上开发亲本间存在多态性的分子标记，包括ch5-2、5u2-3、5u2-1、5d-19、ch5-20、5d-2、5d3-1、5d-8、ch5-9、ch5-10，分子标记信息见下表1：

表1分子标记信息

进一步将番茄la0963×la1589f2植株群体扩大，通过分子标记分析1641株f2单株的表型及基因型，利用其中864株极端表型的单株(fsi≤0.9和≥1.02)将mel定位于标记5d-19(3个交换单株)和ch5-20(2个交换单株)之间，区间大小约159k，预测共有包括solyc05g012710、solyc05g012720、solyc05g012730、solyc05g012740、solyc05g012750、solyc05g012760、solyc05g012770、solyc05g012780、solyc05g012790、solyc05g012800、solyc05g012810、solyc05g012820、solyc05g012830、solyc05g012840、solyc05g012850、solyc05g012860、solyc05g012870的17个orf，基因注释见下表2：

表2候选区间基因序列号

s3，确定候选基因：

分别提取母本la0963和父本la1589的叶片总rna，用反转录试剂盒(hisccriptiistrandcdnasynthesiskit,vazyme公司)反转录成cdna，对区间内17个orf分别以亲本为模板进行pcr扩增，pcr产物并进行sanger测序，利用http://multalin.toulouse.inra.fr/multalin/multalin.html比对亲本以及参考基因组之间的序列，结合生物信息学分析预测各差异的基因功能，将第9号orf(即solyc05g012790)列为mel候选基因。

其中，对区间内17个orf分别以亲本为模板进行pcr扩增所采用的引物序列见下表3：

表3候选区间基因引物

s4，序列分析：

分别以母本la0963和父本la1589的cdna为模板扩增mel基因序列(solyc05g012790)，分别得突变型la0963的mel基因的cdna序列和野生型la1589的mel基因的cdna序列。

其中，野生型mel基因的cdna序列全长如seqidno:1所示：

atgaggaagcatggatggcaacttccctatcatcctctccaggtggtagctgttgctgtgtttctggcactgggatttgctttctatgtcttctttgcaccttttgtgggaaagaaattgtttcagtatattgtgatggggctttatactcctcttataattagtgcatttggcttgtatatctggtgcgctgctgctgatcctgctgatccaggagtttttagatccaagaagtatattaagaagctagaccacgaaaagcaagttcaacttaaagaatctaaattagggtgcgagacgaattcttctatacaagatgctaatgctgcatcgattggggaaaatgcatctggaaaaagcaacaaaggagctgaaccagctgcagatcacaatgaaactgaacagaaaattacagctactcgtgaacgatctttctcttccggattgttggctctactaccttgtgctcttatcagcaactgcacaggcagacatgaggagtcttctcagcaacagttgagtgaagatggcatgttctactgcagtttgtgtgaagtagaggtatttaaatacagcaagcattgcagagtatgtgacaagtgcgtcgatcagtttgaccatcattgcaggtggataaacaactgtatagggaaaaggaactatcgcaagttctttgcgctcatggtttcagccctcctgctgcttatacttcagtggtcaactggaattcttgtactaatctgctgctttatcgagaagaagaaattttctgcggaaatcacctccaaattaggaagcagtttctccattgttccttttgttattgtagtggctgtctgtaccatcttggccatgatagcaaccctgccactagctcaacttttcttctttcacatacttctcataaagaagggaattagcacctatgactacatcattgctctcagagatcaagagcaacaaggagttgcaggtcagcaaagtccacaaatgtctactgttagctccctaactggattaagcagtgcaagctccttcaatactttccatcgagcagcatggtgcacaccacctcgcctttttgttgaggatcagtatgatgtagttcctcctgatacagtatcggtcagttcacttgggaaaaggtcaatggcggatgaacctatcaagaaaaagaatccagctgccgtgaagattagcccatggacactagcacgattaaatgcggaggatgtttcaaaagctgctgctgaagcaaggaaaaaatcgaaaattcttcagtcagtggtgagaaacaaagaaccttacattcttgaaacaaatagcagtttaggaagtagcgggcgtcgcatggtgcctaggcttgataacaatagaaggagagctagtaaacgagttagactccctgcagagttaccctttgaaaccatgagtaaaattcccaatgatatagctcaaaacagcagaagacccatgctaactgagtcatcaagcagtttagctccccttcagcttgaagcacggagtgatttccgaacaacccgaggactgtccacctcaggtgttgttgttgcttcttcacctgagagtagtttggactctcctgacattcacccactccggatgtcatcctcaggagttgaagatgctgcacgtcttgtaggtcacctatcatctggaatgactcttcaaaaggatacaccattgtctagatcaactagtgatggatacgaggcatctggtggggaggatagtgatcgtgtgcctacccgaattgtgcaaaggtcaacaaggtggagtagcattctttttggttctgatcaacaagatgatagagtcagaagattgatggtcccgtcttcatcaacccaggctaacatcaggaagcattaa。

突变型mel基因的cdna序列全长如seqidno:2所示：

atgaggaagcatggatggcaacttccctatcatcctctccaggtggtagctgttgctgtgtttctggcactgggatttgctttctatgtcttctttgcaccttttgtgggaaagaaattgtttcagtatattgtgatggggctttatactcctcttataattagtgcatttggcttgtatatctggtgcgctgctgctgatcctgctgatccaggagtttttagatccaagaagtatattaagaagctagaccacgaaaagcaagttcaacttaaagaatctaaattagggtgcgagacgaattcttctatacaagatgctaatgctgcatcgattggggaaaatgcatctggaaaaagcaacaaaggagctgaaccagctgcagatcacaatgaaactgaacagaaaattacagctactcgtgaacgatctttctcttccggattgttggctctactaccttgtgctcttatcagcaactgcacaggcagacatgaggagtcttctcagcaacagttgagtgaagatggcatgttctactgcagtttgtgtgaagtagaggtatttaaatacagcaagcattgcagagtatgtgacaagtgcgtcgatcagtttgaccatcattgcaggtggataaacaactgtatagggaaaaggaactatcgcaagttctttgcgctcatggtttcagccctcctgctgcttatacttcagtggtcaactggaattcttgtactaatctgctgctttatcgagaagaagaaattttctgcggaaatcacctccaaattaggaagcagtttctccattgttccttttgttattgtagtggctgtctgtaccatcttggccatgatagcaaccctgccactagctcaacttttcttctttcacatacttctcataaagaagggaattagcacctatgactacatcattgctctcagagatcaagagcaacaaggagttgcaggtcagcaaagtccacaaatgtctactgttagctccctaactggattaagcagtgcaagctccttcaatactttccatcgagcagcatggtgcacaccacctcgcctttttgttgaggatcagtatgatgtagttcctcctgatacagtatcggtcagttcacttgggaaaaggtcaatggcggatgaacctatcaagaaaaagaatccagctgccgtgaagattagcccatggacactagcacgattaaatgcggaggatgtttcaaaagctgctgctgaagcaaggaaaaaatcgaaaattcttcagtcagtggtgagaaacaaagaaccttacattcttgaaactatagcagtttaggaagtagcgggcgtcgcatggtgcctaggcttgataacaatagaaggagagctagtaaacgagttagactccctgcagagttaccctttgaaaccatgagtaaaattcccaatgatatagctcaaaacagcagaagacccatgctaactgagtcatcaagcagtttagctccccttcagcttgaagcacggagtgatttccgaacaacccgaggactgtccacctcaggtgttgttgttgcttcttcacctgagagtagtttggactctcctgacattcacccactccggatgtcatcctcaggagttgaagatgctgcacgtcttgtaggtcacctatcatctggaatgactcttcaaaaggatacaccattgtctagatcaactagtgatggatacgaggcatctggtggggaggatagtgatcgtgtgcctacccgaattgtgcaaaggtcaacaaggtggagtagcattctttttggttctgatcaacaagatgatagagtcagaagattgatggtcccgtcttcatcaacccaggctaacatcaggaagcattaa。

请进一步结合图5，经序列比较，发现与野生型la1589完整的mel基因序列相比，突变体la0963中的mel基因序列在atg后第1322位的一个a碱基缺失导致移码。

其中，野生型mel蛋白序列如seqidno:3所示：

metarglyshisglytrpglnleuprotyrhisproleuglnvalvalalavalalavalpheleualaleuglyphealaphetyrvalphephealaprophevalglylyslysleupheglntyrilevalmetglyleutyrthrproleuileileseralapheglyleutyriletrpcysalaalaalaaspproalaaspproglyvalpheargserlyslystyrilelyslysleuasphisglulysglnvalglnleulysgluserlysleuglycysgluthrasnserserileglnaspalaasnalaalaserileglygluasnalaserglylysserasnlysglyalagluproalaalaasphisasngluthrgluglnlysilethralathrarggluargserpheserserglyleuleualaleuleuprocysalaleuileserasncysthrglyarghisglugluserserglnglnglnleusergluaspglymetphetyrcysserleucysgluvalgluvalphelystyrserlyshiscysargvalcysasplyscysvalaspglnpheasphishiscysargtrpileasnasncysileglylysargasntyrarglysphephealaleumetvalseralaleuleuleuleuileleuglntrpserthrglyileleuvalleuilecyscyspheileglulyslyslyspheseralagluilethrserlysleuglyserserpheserilevalprophevalilevalvalalavalcysthrileleualametilealathrleuproleualaglnleuphephephehisileleuleuilelyslysglyileserthrtyrasptyrileilealaleuargaspglngluglnglnglyvalalaglyglnglnserproglnmetserthrvalserserleuthrglyleuserseralaserserpheasnthrphehisargalaalatrpcysthrproproargleuphevalgluaspglntyraspvalvalproproaspthrvalservalserserleuglylysargsermetalaaspgluproilelyslyslysasnproalaalavallysileserprotrpthrleualaargleuasnalagluaspvalserlysalaalaalaglualaarglyslysserlysileleuglnservalvalargasnlysgluprotyrileleugluthrasnserserleuglyserserglyargargmetvalproargleuaspasnasnargargargalaserlysargvalargleuproalagluleuprophegluthrmetserlysileproasnaspilealaglnasnserargargprometleuthrgluserserserserleualaproleuglnleuglualaargserasppheargthrthrargglyleuserthrserglyvalvalvalalaserserprogluserserleuaspserproaspilehisproleuargmetserserserglyvalgluaspalaalaargleuvalglyhisleuserserglymetthrleuglnlysaspthrproleuserargserthrseraspglytyrglualaserglyglygluaspseraspargvalprothrargilevalglnargserthrargtrpserserileleupheglyseraspglnglnaspaspargvalargargleumetvalproserserserthrglnalaasnilearglyshis。

突变型mel蛋白序列如seqidno:4所示：

进一步结合图6，发现与野生型la1589完整的mel蛋白序列相比，突变体la0963中的mel蛋白序列中氨基酸序列在443位提前终止。

s5，功能分析：

以mel氨基酸序列在uniprot(https://www.uniprot.org/)中进行proteinblast。

请进一步结合图7，结果表明mel氨基酸序列属于dhhc家族，含有保守的氨基酸残基c-x2-c-x9-hc-x2-c-x2-c-x4-dhhc-x5-c-x4-n-x3-fmotif，基因注释为棕榈酰胺转移酶(palmitoyltransferase)，n端包含4个跨膜结构域，一个保守的dhhc催化结构域，预测功能为蛋白质翻译之后的棕榈酰胺化修饰。

s5，mel基因功能验证：

(1)p35s-mel超量表达载体及其遗传转化：

利用primerpremier5软件设计如seqidno:5和seqidno:6所示的mel特异引物序列，详见下表4。以alisacraig(ac)cdna为模板，用高保真dna聚合酶(phantamaxsuper-fidelitydnapolymerase,vazyme公司)扩增mel全长cdna，切胶回收扩增产物；同时用xbai和xhoi双酶切phellsgate8载体，切胶回收载体骨架；将切胶回收的两组产物进行同源重组连接(重组酶exnaseii,vazyme公司)，热激转化trans-t1大肠杆菌，该表达载体以35s启动子启动，挑单克隆测序获得正确的p35s-mel超量表达载体。

利用农杆菌介导法将p35s-mel载体转入mel突变体la0963，获得mel基因超表达的转基因植株。其中，遗传转化方法详见欧阳波等报道的农杆菌介导法(2002)。

(2)mel-rnai表达载体的构建及其遗传转化：

利用ncbi网站cdserch预测mel基因的保守结构域，在mel基因的非保守结构域设计如seqidno:7和seqidno:8所示的mel-rnai引物序列，详见下表4。以alisacraig(ac)cdna为模板，用高保真dna聚合酶(phantamaxsuper-fidelitydnapolymerase,vazyme公司)扩增mel-rnai片段，切胶回收扩增产物，与phellsgate2质粒进行bp重组(bp酶购自vazyme公司)，热激转化trans-t1大肠杆菌，挑单克隆测序获得正确的mel-rnai表达载体。

利用农杆菌介导法将mel-rnai载体转入alisacraig，获得mel基因干涉转基因植株，遗传转化方法同实施例2的遗传转化方法。

(3)pmel-mel表达载体的构建及其遗传转化：

利用primerpremier5软件设计如seqidno:9和seqidno:10所示的mel启动子+gdna全长引物，详见下表4。以alisacraiggdna为模板，用高保真dna聚合酶(phantamaxsuper-fidelitydnapolymerase,vazyme公司)扩增mel启动子(atgupstream3040bp)+gdna全长，切胶回收扩增产物；同时用xbai和saci双酶切phellsgate8载体，切胶回收载体骨架；将切胶回收的两组产物进行同源重组连接(重组酶exnaseii,vazyme公司)，热激转化trans-t1大肠杆菌，挑单克隆测序获得正确的pmel-mel表达载体(mel自启动子表达载体)。

利用农杆菌介导法转化mel突变体la0963获得mel功能互补转基因植株，遗传转化方法同实施例2的遗传转化方法。

表4mel候选基因(solyc05g012790)载体构建的引物序列

分别对mel基因功能验证中获得的转基因t0植株提取总dna，质粒为阳性对照，非转基因背景材料的dna为阴性对照，通过pcr检测，鉴定出p35s-mel超量表达阳性植株9株，mel基因干涉转基因阳性植株18株，pmel-mel转基因阳性植株5株。

请进一步结合图8，对上述转基因植株的果实形状进行观察发现，在la0963背景中p35s-mel超量表达转基因植株或功能互补pmel-mel转基因植株都能使原来椭圆果变为扁圆、圆形果，而mel超量植株果型指数显著低于pmel-mel转基因植株的果型指数。在alisacraig(ac)背景mel-rnai干涉基因植株，使果实由原来圆形变为果型指数大于1的椭圆形。

由此可以看出，采用mel/mel基因能够调控番茄果实的形状，并可以在改变番茄果形方面及培育新品种进行应用。

以上实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110>华中农业大学

<120>控制番茄果实形状的基因及其克隆方法和应用

<160>64

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>1893

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

atgaggaagcatggatggcaacttccctatcatcctctccaggtggtagctgttgctgtg60

tttctggcactgggatttgctttctatgtcttctttgcaccttttgtgggaaagaaattg120

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tcatcaacccaggctaacatcaggaagcattaa1893

<210>2

<211>1892

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2