本发明涉及病毒悬浮培养领域。
背景技术：
鸡新城疫(newcastledisease，nd)是对养禽业危害最大的病毒性传染病之一，该病被世界动物卫生组织(oie)列为a类传染病，给世界各国的养禽业造成了巨大损失。系统的分子流行病学调查结果显示，近年来我国nd流行毒株以基因vii型为主，与我国目前广泛使用的疫苗株lasota和clone30等存在明显差异，虽然鸡群在整个饲养期内进行过多次常规疫苗免疫，但仍有感染强毒株引起流行的可能性，临床上主要表现为非典型性nd的发生，证实目前所使用疫苗的免疫保护力不足，因此开发免疫原性更好、与目前流行株更匹配的疫苗已经成为nd疫苗研发的趋势和当务之急。
目前，生产鸡新城疫疫苗的主要方法是通过接种9～11日龄的易感鸡胚培养病毒，然后收获鸡胚液制备疫苗，需要大量的易感鸡胚，成本较高，病毒产量易受鸡胚的来源、品质等因素影响，且鸡胚液中存在大量杂蛋白，制备出的疫苗纯度差。病毒繁殖过程中，鸡胚需先在孵化箱孵化9～11日、然后逐胚接种病毒、再在孵化箱培养4～5日、逐个收胚，才能制备出病毒液，生产周期长，工作繁重，导致能源的极大消耗。同时，在收获病毒后，产生大量带毒废胚体，需通过高压灭菌或其他灭菌方法处理，造成大量废弃物，且如果处理不彻底，存在散毒风险。因此急需研制出一种工艺简单、安全易控、成本低廉的方式用于生产新城疫疫苗。
细胞是增殖病毒的良好介质，已有报导使用mdck细胞、df1细胞、vero细胞、st细胞、marc-145细胞、bhk细胞、mdbk细胞来制备新城疫病毒液，但病毒滴度较低，不能用于大规模生产。另外，还有报到使用eb66细胞制备新城疫病毒液，虽然制备的病毒液滴度可以达到制备疫苗的标准，但其生产过程采用二阶培养法，即细胞接毒后需先吸附培养1h，再补加2倍于原有生长培养基体积的新鲜生产培养基培养，过程复杂，容易造成污染。
鸭胚视网膜细胞(age1.cr.pix细胞，以下简称age1细胞)，是德国probiogen公司从美洲鸭的胚胎视网膜中分离的细胞，转染人5型腺病毒e1基因和pix基因后，永生化制备的细胞系。目前尚未见该细胞用于基因vii型新城疫病毒培养的报道。
技术实现要素：
本发明的目的在于，提供一种新的基因vii型新城疫病毒培养方法。
本发明的技术方案包括：
dmem培养基在增加细胞聚团率中的用途。
如前述的用途，所述dmem培养基是无血清dmem培养基。
如前述的用途，它是将dmem培养基加入到细胞悬液中，使dmem培养基被稀释至原浓度的10％～20％；优选的，为10％。
一种使用悬浮细胞培养新城疫病毒的方法，包括：
培养age1.cr.pix细胞至密度为(8～12)×106/ml时，接种新城疫病毒，加入无血清dmem培养基，使dmem培养基浓度被稀释至原浓度的10％～20％；每日添加终浓度为8～16u/ml的胰酶，在温度为33～37℃条件下培养，收毒即可。
如前述的使用悬浮细胞培养新城疫病毒的方法，接种病毒时的细胞密度为8.0×106/ml。
如前述的使用悬浮细胞培养新城疫病毒的方法，加入dmem培养基后，dmem培养基浓度被稀释至原浓度的10％。
如前述的使用悬浮细胞培养新城疫病毒的方法，所述胰酶添加量为终浓度16u/ml。
如前述的使用悬浮细胞培养新城疫病毒的方法，所述培养温度是35℃。
如前述的使用悬浮细胞培养新城疫病毒的方法，所述收毒时间为接毒后72h。
如前述的使用悬浮细胞培养新城疫病毒的方法，所述新城疫病毒为基因vii型新城疫病毒。
本发明以age1细胞为宿主细胞，通过合理添加无血清dmem培养基增加细胞聚团率，结合合理的工艺参数(温度、细胞密度、接毒量、收毒时间、胰酶添加量)使新城疫病毒lgeid50值达到9以上，其ha效价达到11log2。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过具体实施方式对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
具体实施方式
实施例1摇瓶中使用悬浮细胞培养新城疫病毒的方法
取3个250ml的摇瓶培养age1细胞，当细胞密度培养至8.0×106/ml，按照0.0001moi接种基因vii型新城疫病毒asg10株病毒，同时分别添加体积比(体积占添加后的总体积的比例，下同)为10％的无血清dmem培养基，以及添加终浓度为16u/ml的胰酶溶液，每日添加一次相同剂量的胰酶溶液，将培养温度调至35℃，8％co2条件下培养72h，收毒，冻融3次，测定ha(血凝实验)效价及病毒含量。
实施例2生物反应器中使用悬浮细胞培养新城疫病毒的方法
将age1细胞放大传代至7l的生物反应器中，培养液体积为4～5l，ph值设置为7.15，溶氧值设置为60％，转速设置为150r/min，37℃培养。当细胞密度为8.0×106/ml以上时，接种新城疫病毒asgl0株病毒，同时添加体积比为10％的无血清dmem培养基，以及添加终浓度为16u/ml的胰酶溶液，每日添加一次相同剂量的胰酶溶液，将培养温度调至35℃，培养72h，收获病毒液。共制备3批新城疫病毒。结果表明，收获病毒的ha效价为11～12log2，病毒含量为109.2～109.5eid50/0.1ml。结果详见表1。
表1新城疫病毒在7l生物反应器中的培养
以下将以实验例的形式对本发明有益效果做进一步说明。
实验例1asg10株病毒最佳接种细胞密度试验
取3个250ml的摇瓶培养age1细胞，分别培养至细胞密度约为4.0×106/ml、8.0×106/ml，1.2×106/ml，然后将细胞密度精确调整为4.0×106/ml、8.0×106/ml，1.2×106/ml，即当细胞密度未能达到要求密度时，继续培养，当细胞密度大于要求时，按一定比例稀释至要求密度。然后将细胞体积均调整为80ml/瓶，接种新城疫病毒asg10株病毒，同时添加体积比为10％的无血清dmem培养基，以及添加终浓度为16u/ml的胰酶溶液，放入摇床，160r/min、35℃、8％co2培养。每天添加一次相同剂量的胰酶溶液，72h后，收毒，冻融3次，测定其ha效价及病毒含量。
结果表明，接种新城疫病毒时，细胞密度为8.0×106/ml时，ha效价可达到11log2，病毒含量最高，为109.1eid50/0.1ml，所以接种新城疫病毒时，细胞的最佳接种密度为8.0×106/ml。结果详见表2。
表2新城疫病毒最佳接种细胞密度试验结果
实验例2asg10株病毒最佳接种量试验
取3个250ml的摇瓶培养age1细胞，当细胞密度培养至8.0×106/ml，分别以0.001moi、0.0001moi、0.00001moi接种新城疫病毒asg10株病毒，同时添加体积比为10％的无血清dmem培养基，以及添加终浓度为16u/ml的胰酶溶液，放入摇床，160r/min、35℃、8％co2培养。每天添加一次相同剂量的胰酶溶液，72h后，收毒，冻融3次，测定其ha效价及病毒含量。
结果表明，新城疫病毒以0.0001moi接种，ha效价可达到10log2，收获的病毒含量略高，为108.9eid50/0.1ml，所以将新城疫病毒的最佳接种量定为0.0001moi。结果详见表3。
表3新城疫病毒最佳接种量试验结果
实验例3asg10株病毒最佳培养温度试验
取3个250ml的摇瓶培养age1细胞，当细胞密度培养至8.0×106/ml，按照0.0001moi接种新城疫病毒asg10株病毒，同时添加体积比为10％的无血清dmem培养基，以及添加终浓度为16u/ml的胰酶溶液，放入摇床，分别以33℃、35℃、37℃培养，摇床转速为160r/min，co2浓度为8％培养。每天添加一次相同剂量的胰酶溶液，72h后，收毒，冻融3次，测定其ha效价及病毒含量。
结果表明，新城疫病毒接种后，以35℃与37℃培养，ha效价均可达到11log2，但以35℃培养，收获的病毒含量略高，为109.2eid50/0.1ml，所以将新城疫病毒培养的最佳温度定为35℃。结果详见表4。
表4新城疫病毒最佳培养温度试验结果
实验例4asg10株病毒最佳收毒时间试验
取1个250ml的摇瓶培养age1细胞，当细胞密度培养至8.0×106/ml，按照0.0001moi接种新城疫病毒asg10株病毒，同时添加体积比为10％的无血清dmem培养基，以及添加终浓度为16u/ml的胰酶溶液，放入摇床培养，每天添加一次相同剂量的胰酶溶液，160r/min、35℃、8％co2培养，分别在接种后48h、72h、96h取样，冻融3次，测定ha效价及病毒含量。
结果表明，新城疫病毒接种后，培养48h，ha效价即可达到9log2，到72h，ha可达到12log2，但到96h，ha效价略有下降，病毒产量结果也显示，新城疫病毒培养72h，产量略高于48h，可达到109.5eid50/0.1ml，所以将新城疫病毒接种后最佳的收毒时间定为72h。结果详见表5。
表5新城疫病毒最佳收毒时间试验结果
实验例5胰酶最佳添加量试验
取3个250ml的摇瓶培养age1细胞，当细胞密度培养至8.0×106/ml，按照0.0001moi接种新城疫病毒asg10株病毒，同时添加体积比为10％的无血清dmem培养基，以及添加终浓度分别为8u/ml、16u/ml、24u/ml的胰酶溶液，放入摇床培养，每天添加一次相同剂量的胰酶溶液，160r/min、35℃、8％co2培养72h后，收毒，冻融3次，测定ha效价及病毒含量。
每天添加胰酶终浓度的量为16u/ml时，收获病毒的ha效价及病毒含量最高，ha效价可达11log2，病毒含量为109.3eid50/0.1ml。结果详见表6。
表6胰酶最佳添加量试验结果
实验例6对比dmem添加试验
发明人偶然发现，无血清dmem有利于细胞聚集成团，呈肉眼可见的团块，细胞聚集成团进一步有利于病毒吸附细胞，以及病毒在细胞之间相互传播，从而促进病毒增殖。本实验例的目的是寻找适用于本发明新城疫病毒培养的最适dmem添加量。
取3个250ml的摇瓶培养age1细胞，当细胞密度培养至8.0×106/ml，按照0.0001moi接种新城疫病毒asg10株病毒，同时分别添加体积比为0％、10％、20％的无血清dmem培养基，以及添加终浓度为16u/ml的胰酶溶液，每日添加一次相同剂量的胰酶溶液，将培养温度调至35℃，8％co2条件下培养72h，收毒，冻融3次，测定细胞聚团率、ha效价及病毒含量。
通过dmem不同添加量试验，表明添加10％的dmem时，收获病毒的ha效价为11log2，病毒含量为109.3eid50/0.1ml。结果详见表7。
表7对比dmem添加试验结果
实验例7细胞增殖新城疫病毒的安全性研究
1.对鸡脑内致病指数(icpi)的检测
取1日龄spf鸡10只，经脑内注射10倍稀释的新城疫细胞毒0.05ml。另取10只以同样方法注射稀释病毒用的生理盐水各0.05ml。接种后，每日观察记录雏鸡的临床表现，分正常(活动灵活，行动无共济失调现象)、发病(包括麻痹、卧地不起，但不包括只表现迟钝的鸡)和死亡。观察8日，计算正常、发病、死亡鸡的总数，根据不同的权值(正常为0，发病为1，死亡为2)累计总分数。icpi为累计总分除以正常、发病和死亡鸡的累计总数的平均值。
结果显示，新城疫细胞毒的icpi指数为0.3，在0.1～0.4之间，为新城疫弱毒，结果详见表8。
表8脑内致病指数(icpi)检测结果
2.对spf鸡的安全性检测
取2～7日龄spf鸡10只，每只鸡各滴鼻接种5倍稀释的新城疫细胞毒病毒液0.05ml，另取10只同日龄spf鸡不接种作对照，在同样条件下分别饲养管理，连续观察10日。结果，新城疫细胞毒接种2日龄spf鸡10只，观察10日，接毒组和对照组均未出现死亡或任何临床症状。结果详见表9。
表9新城疫细胞毒对spf鸡的安全性检测
实验例8新城疫细胞毒与鸡胚毒的免疫原性研究
分别在新城疫细胞毒和鸡胚毒中加入终浓度为0.1％甲醛溶液，37℃灭活24小时，将灭活完全的半成品加入吐温-80配制水相，然后按油相∶水相＝2∶1的比例，分别制备成细胞毒油乳剂灭活疫苗和鸡胚毒油乳剂灭活疫苗。
将20只35日龄spf鸡随机平均分为2组，其中1组经颈部皮下注射新城疫细胞毒的油乳剂灭活疫苗，另一组同样方式免疫新城疫鸡胚毒的油乳剂灭活疫苗，均为20μl/只，另取5只鸡不免疫作为对照。免后21日、28日，分别采集试验鸡血分离血清，用asg10株hi抗原检测血清hi抗体。免后28日，每只鸡肌肉注射鸡新城疫病毒sg10株0.2ml(含105.0eld50)，进行攻毒，观察14日。攻毒后第5日采集泄殖腔拭子，接种10日龄spf鸡胚进行病毒分离，对病毒分离阴性的样品，盲传一次后再进行判定。以免疫攻毒鸡不发病、不死亡且病毒分离阴性判为保护。
结果，35日龄spf鸡免后21日、28日，细胞毒疫苗免疫组hi抗体均高于鸡胚毒疫苗免疫组。攻毒后观察14日，对照鸡全部死亡，免疫鸡均未出现新城疫临床症状。但攻毒后第5日采集泄殖腔拭子，接种10日龄spf鸡胚，进行病毒分离，鸡胚毒疫苗免疫组的病毒分离率要高于细胞毒疫苗免疫组，表明细胞毒疫苗免疫组的保护率要高于鸡胚毒疫苗免疫组，可见，新城疫细胞毒免疫原性良好，且攻毒保护率高于鸡胚毒疫苗。结果见表10。
表10新城疫细胞毒免疫原性试验结果
注：“/”表示无此项。
综上，本发明以age1细胞为宿主细胞，通过合理添加无血清dmem培养基增加细胞聚团率，结合合理的工艺参数(温度、细胞密度、接毒量、收毒时间、胰酶添加量)使新城疫病毒lgeid50值达到9以上，其ha效价达到11log2。