一种希氏乳杆菌菌种及其应用的制作方法

本发明涉及微生物发酵技术领域，尤其涉及一种希氏乳杆菌菌种及其应用。

背景技术：

近年来，随着全球气候变暖和葡萄采摘时成熟度的增加，导致一些地区葡萄原料的潜在酒精含量不断升高。而酒精是抑制苹果酸-乳酸发酵细菌（malolacticbacteria，mlb）生长和苹果酸-乳酸发酵（malolacticfermentation，mlf）进行的主要因素之一，目前生产中用于用于葡萄酒苹果酸-乳酸发酵的主要是酒球菌属的酒酒球菌（oenococcusoeni），通常情况下，酒精含量超过14%（v/v）时o.oeni就会生长困难，这使得很多高酒精度葡萄酒的mlf越来越难，在一些地区，由于酒精含量的增加而导致的mlf缓慢甚至停滞的发生越来越频繁。而mlf是酿造高品质葡萄酒必不可少的工艺。因此提高苹果酸-乳酸菌的抗逆性特别是抗酒精性能是葡萄酒微生物学研究的重点领域之一。

葡萄酒酿造发达的国家都非常重视此方面的研究。我国自上世纪90年代开始开展对mlf的研究，但由于对优良苹果酸-乳酸发酵菌种在生产上应用的重视程度不够，我国对mlb资源的研究与开发利用至今仍很落后。国内虽有研究者对本土mlb资源的多样性及抗逆性开展了研究，但多集中在o.oeni上，由于o.oeni自身条件的限制，很难在高酒精葡萄酒中顺利完成mlf。

而近年来随着全球气候变暖，葡萄采摘时成熟度不断增加，葡萄原料的潜在酒精含量也不断升高，在很多产区葡萄酒酒精度经常会超过14%（v/v）。使用o.oeni对葡萄酒进行mlf失败的风险越来越高。

技术实现要素：

有必要提出一种希氏乳杆菌（lactobacillushilgardii）菌种。

还有必要提出一种希氏乳杆菌菌种的应用。

一种希氏乳杆菌菌种（lactobacillushilgardiq19），所述菌种于2019年3月22日保藏于位于中国北京的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（cgmcc），保藏编号为cgmccno.17430。

希氏乳杆菌（lactobacillushilgardiq19）在葡萄酒发酵中的应用。

希氏乳杆菌（lactobacillushilgardiq19）在高酒精度的葡萄酒发酵中的应用，所述高酒精度为酒精含量14%-19%。优选的，可以用于酒精含量为19%以下的葡萄酒的发酵。较为优选的是用于酒精含量为14%、15%、16%、17%、19%的葡萄酒的发酵。

从本发明可以得出，l.hilgardiiq19具有完成mlf的能力，且与商业o.oeni具有相同或更快的mlf发酵速率，而且本实验室筛选的l.hilgardiiq19对高酒精度具有良好的耐受性，它可以在酒精含量高达19%（v/v）的mrs-aj培养基中存活并增殖。

虽然o.oeni在发酵性能上具有一定的优势，如对低ph和高so2有较高的耐受性，但也有一些的缺点，例如对高酒精度的耐受性差，同时o.oeni作为异型乳酸发酵细菌，分解苹果酸的过程中会产生乙酸，所以一定会使葡萄酒的挥发酸含量升高，而l.hilgardii是同型乳酸发酵细菌，分解苹果酸的过程中不会产生乙酸，从而在发酵苹果酸的过程中不会产生挥发酸。此外，实验表明：l.hilgardiiq19对低ph和高so2有很好的耐受性，且mlf后产生的挥发性物质的种类更多、挥发性物质的总量更高，这些研究结果表明l.hilgardiiq19具有很好的商业化应用价值。

附图说明

图1-图3为l.hilgardiiq19、o.oeni31-dh和o.oenisd-2a在酒精含量为15、17、19%的mrs培养基中的生长曲线。

图4-6为l.hilgardiiq19、o.oeni31-dh和o.oenisd-2a在ph为3.1、3.3、3.6的mrs培养基中的生长曲线。

图7-9为l.hilgardiiq19、o.oeni31-dh和o.oenisd-2a在so2含量为20、40、60mg/l的mrs培养基中的生长曲线。

图10、11为o.oeni31-dh和l.hilgardiiq19在模拟酒和葡萄酒中的菌体生长和消耗苹果酸的情况。

具体实施方式

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将结合实施例和实验方案进行说明。

1、mlb的分离

从宁夏贺兰山东麓产区青铜峡子产区采收赤霞珠葡萄，经除梗，破碎后装入180l无菌罐中，进行自然酒精发酵，发酵温度控制在27～30℃，酒精发酵结束后皮渣分离，进行mlf，温度控制在18～20℃。mlf过程中每隔48小时取样。样品梯度稀释后在mrs-aj固体培养基（mrs培养基加20%苹果汁）平板上28℃于co2培养箱培养5～7天。将培养基上的mlb进行分离纯化，记录菌落特征及数量，并通过革兰氏染色等对mlb进行初步鉴定。

2、mlb的培养及分子生物学鉴定

将分离纯化后的mlb接种在mrs-aj液体培养基中，28℃静置培养72h，离心收集菌体，提取dna，以此dna为模板进行16srrna的pcr扩增，最后对扩增产物进行测序分析，对mlb进行鉴定。

3、mlb酒精、ph及so2耐受性实验

在无菌操作条件下，将制备好的含不同酒精（梯度设置为15%，17%，19%，v/v）、ph（梯度设置为3.1，3.3，3.6）、so2（梯度设置为20mg/l，40mg/l，60mg/l）的mrs-aj培养基分装到50ml一次性离心管中备用。

将预先培养好的o.oeni和l.hilgardii以大约10⁷cfu/ml浓度的接种量分别接种到制备好的50ml含不同酒精、ph及so2的新鲜mrs-aj培养基中，每个处理3个重复。

接种后置于28℃恒温培养箱培养。每隔24h或48h取样一次。每次取样200µl于一次性灭菌96孔板上（分光光度计专用），测定样品在abs600的吸光值，最后绘制细菌的生长曲线。7d后abs600≤初始接种吸光值视为在此条件下不生长。

4、菌株的鉴定及酒精、ph、so2耐受性结果分析

对经过上述“3、mlb酒精、ph及so2耐受性实验”筛选分离的菌株进行了表型鉴定及16srrna序列分析，得到其中一株分离株：l.hilgardiiq19。

以商业菌株o.oeni31-dh和由西北农林科技大学筛选出的对酒精耐受性较好的酒酒球菌菌株o.oenisd-2a作为对照，对其进行了酒精、ph、so2耐受性分析。参见图1-9。

图1-图3的结果表明：在含15%，17%，19%（v/v）酒精的培养基中，o.oeni31-dh和o.oenisd-2a均不能生长，而l.hilgardiiq19却可以在所有酒精梯度培养基中生长。

图4-6的结果表明：ph胁迫试验结果显示：l.hilgardiiq19及两株对照菌株均能在ph3.1,3.3,3.6的mrs培养基中存活并生长，表明l.hilgardiiq19具有较高的耐低ph能力。

图7-9的结果表明：so2胁迫试验结果表明：l.hilgardiiq19和商业菌株o.oeni31-dh能在含40mg/lso2的mrs培养基中存活并生长，且l.hilgardiiq19比商业菌株o.oeni31-dh具有更好的so2耐受性，o.oenisd-2a的so2耐受性则较差。

5、mlb在葡萄酒中的发酵实验、理化指标测定及发酵后葡萄酒香气分析

经过酒精耐受性实验，筛选出一株能够在酒精含量高达19%（v/v）的mrs-aj培养基中存活并增殖的菌株l.hilgardii，命名为q19。

将经过酒精发酵而未进行mlf的赤霞珠干红葡萄酒通过孔径为0.22µm的过滤膜过滤，将筛选出的本土优势菌种l.hilgardiiq19以10⁷cfu/ml接入到100ml的无菌酒中，三个重复；

将外购的抗逆性较强的商业o.oeni31-dh以10⁷cfu/ml接入到100ml的无菌酒中为对照，三个重复。

两个处理都置于20℃培养箱静置培养，每隔72h取样测定l-苹果酸含量，并用chin-yi等提出的稀释点接平板计数法进行计数，绘制生长曲线，待l-苹果酸含量降至0.1g/l以下时，加60mg/l的二氧化硫终止发酵，然后测定各处理葡萄酒的基本理化指标。利用气相色谱三重四级杆质谱联用仪对发酵后的葡萄酒挥发性物质进行分析。

筛选的本土l.hilgardii菌株q19具有mlf能力，能够在酒精发酵结束后完成mlf，与商业酒酒球菌菌株o.oeni31-dh具有相近的发酵速率，发酵结束后葡萄酒的ph、乙酸、柠檬酸、多酚、花青素、l-乳酸及总糖含量正常，并且发酵结束后葡萄酒的香气种类和数量显著增加。

表1干红葡萄酒的发酵参数

注：ck为未进行苹果酸-乳酸发酵的原始酒样。

6、希氏乳杆菌q19的酿酒特性分析

以商业菌株o.oeni31-dh为对照，对l.hilgardiiq19在模拟酒及葡萄酒（含酒精14%（v/v），ph3.6，游离so220mg/l）中的发酵特性进行了研究。

结果显示：在模拟酒中，商业菌株o.oeni31-dh生长更快但消耗苹果酸的速度差别不大；在葡萄酒中，l.hilgardiiq19的生长情况更好，消耗苹果酸的速度与o.oeni31-dh大致相同。

l.hilgardiiq19的序列表：

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以上所揭露的仅为本发明较佳实施例而已，当然不能以此来限定本发明之权利范围，本领域普通技术人员可以理解实现上述实施例的全部或部分流程，并依本发明权利要求所作的等同变化，仍属于发明所涵盖的范围。

序列表

<110>宁夏大学

<120>一种希氏乳杆菌菌种及其应用

<160>1

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>1283

<212>dna

<213>希氏乳杆菌(lactobacillushilgardii)

<400>1

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