太岁组织中菌类存在的鉴定方法及菌类对太岁形成必需性的评定方法与流程

本发明涉及生物技术领域，具体地说涉及一种太岁组织中菌类存在的鉴定方法及菌类对太岁形成必需性的评定方法。

背景技术：

太岁是一种在中国古籍中有记载，现代又不断被发现的神秘物体，其在生物界的地位一直在探索之中。由于太岁多发现于土层中，无叶绿素等光合作用色素，因此，揭示其生物分类归属基本都是从研究其菌类构成入手。

从1992年发现的现代首例太岁被鉴定为粘菌起，以后发现的太岁就一直被解释成粘菌复合体，但至今却没有一例用分离粘菌培养成太岁或其类似物的验证性报道，更多研究者转而更多关注其它菌类在太岁中的存在情况。通过培养方法分离到的菌类有细菌、粘细菌、真菌、酵母，通过分子方法获知的菌类有古菌、放线菌。目前，在细菌（包含放线菌、衣原体、立克次氏体）、古细菌、真菌（包含酵母）、支原体等微生物5大类菌中，太岁中已经检出了4大类，仅支原体的存在情况没有报道。

检测到的某大类菌是否均存在于太岁组织的任何部位，已获知的太岁中菌类信息的研究中，不论是培养法还是非培养法，在测试取样时，基本都是取自太岁组织内部的单独样品，其结果能否完全代表太岁整体情况尚不可知。另外，培养方法分离到的菌类，还存在样品污染和操作污染的问题。换言之，自现代太岁发现26年来，对太岁中存在的菌类大类尚没有彻底明确，当然也没有准确的测试方法。

若用培养法完成已检测到菌类的多位点重复验证，和证明未检测到菌类的存在情况，工作量浩繁周期长，还面临古菌、粘菌、支原体培养难、纯化难、易污染，甚至不生长等多个障碍。若用非培养方法完成上述工作，理论上比培养方法简便，但也面临如下难题：

第一，无适合太岁组织特性的材料处理方法。太岁组织难以被彻底破碎，导致其中菌类裂解释放dna的机会差别很大，获得的菌类基因信息就会片面。

第二，无适合去除太岁中多糖、聚乙烯醇等多羟基类物质（均呈多糖反应，文中统称为多糖）干扰的方法。太岁中多糖类物质含量极高，提取dna的去多糖阶段，多糖类物质呈絮团状沉降，需要重复多次才能去除掉。伴随多糖类物质的去除，dna也损失巨大，往往是提取失败，因而形成了一个奇怪现象，即太岁在涂板培养时出菌很多（尤其是细菌），却提取不到dna。

第三，目前没有用一个样本全部说明各大类菌存在与否的非培养方法。此问题的关键是提取不到太岁中所含菌类的全部基因组，这除有上述第一、第二条原因外，还由于不同菌类提取dna的方法不同，往往顾此失彼，不能用同一个样本同时提取到。

第四，目前没有对某类菌在太岁整体水平上的存在状况做出评价的方法。即是当发现某类菌在太岁中存在时，不能辨别出是外界感染，还是机会性存在，还是真正存在。只有真正存在的菌类，对太岁形成才是必需的，研究这类菌，才能为破解太岁之谜服务。

技术实现要素：

本发明的目的之一就是提供一种太岁组织中菌类存在的鉴定方法，以解决现有技术无法用一个样本获得各大类菌全部基因信息的问题。

本发明的目的之二就是提供一种菌类对太岁形成必需性的评定方法，以弥补现有技术的空白。

本发明的目的之一是通过以下技术方案实现的：一种太岁组织中菌类存在的鉴定方法，包括以下步骤：

a、测定在水浴10min时能够使太岁组织块软化成泥并溶解的温度；

b、称取≥0.6克的太岁组织块加入到水中，然后在溶解温度下进行水浴保温处理，得到太岁组织溶解液；

c、使用滤膜孔径为0.22µm的一次性针头滤器过滤步骤b所得的太岁组织溶解液，得到太岁组织滤液和富集有菌体的滤膜；

d、ctab法提取滤膜上菌体的dna，得到太岁组织菌体dna溶液；

e、选取细菌类、古细菌类、真菌类、粘菌类和支原体类的已知菌作为这5大菌类鉴定的各自的阳性对照菌，每个阳性对照菌的湿菌体量≥0.1克，将阳性对照菌按照与太岁组织块步骤b~d相同的处理方法进行处理，得到支原体阳性对照菌滤液和细菌类、古细菌类、真菌类、粘菌类各自阳性对照菌的dna溶液；

f、五大菌类存在的鉴定：

f-1、支原体类的鉴定：以太岁组织滤液和支原体阳性对照菌滤液为模板，进行支原体通用引物扩增，同时以rt-pcr级别水为阴性对照，扩增产物用琼脂糖凝胶电泳进行检验，在阴性对照无目标条带的前提下，若支原体阳性对照菌有目标条带，表明该方法适用于太岁组织中支原体存在的鉴定，若太岁组织滤液扩增的产物无目标条带，表明对应的取样部位无支原体存在，若有目标条带，表明对应的取样部位有支原体存在；

f-2、细菌类、古细菌类、真菌类或粘菌类的鉴定：以太岁组织菌体dna溶液和4大菌类阳性对照菌dna溶液为模板，进行各大菌类的通用引物扩增，同时以rt-pcr级别水为阴性对照，扩增产物用琼脂糖凝胶电泳进行检验，在阴性对照无目标条带的前提下，若4大菌类阳性对照有目标条带，表明该方法适用于太岁组织中细菌类、古细菌类、真菌类和粘菌类的鉴定，若太岁组织菌体dna溶液的扩增产物无某大菌类目标条带，表明对应的取样部位无该大菌类存在，若有目标条带，表明取样部位有该大菌类存在。

步骤a中，溶解温度的测定过程为：将若干太岁组织块1加入到水中，并置于温度可调的水浴锅中；梯度升高水浴锅的温度，测出在水浴10min时，能够使太岁组织块1完全软化成泥并溶解的温度；太岁组织块1为肉眼能够观察到其在水中相态变化的组织切块。

温度可调的水浴锅应有小于等于0.5℃的精确度，并有温度数显功能。

步骤b中，将太岁组织切分为比太岁组织块1粒度更小的太岁组织块2，将若干太岁组织块2加入到水中，并置于水浴锅中，在溶解温度下保温，使太岁组织块2在10min内溶解，从而得到太岁组织溶解液。

水的量应能淹没太岁组织切块2，并与后续一次性针头滤器的容积等量，此时，在太岁组织重量不变情况下，溶液浓度最低，便于过滤。一次性针头滤器为用注射器推压过滤的滤器，滤膜封装在里面，已经灭菌，用一次即丢弃。

使用一次性针头滤器过滤太岁组织溶解液，多糖等物质存在于滤液中，实现了其和菌体的物理分离。同时，把5大类菌分在了两相：支原体没有细胞壁，且具有高度多形性，能通过滤器，存在于液相的滤液中，其余4大类菌富集在固相的滤器滤膜上。

步骤c中，过滤完后，用预热到溶解温度的热水冲洗滤膜，减少多糖类物质的残留。

经单个滤器过滤的太岁组织溶解液中溶解的太岁组织量≤滤器对该太岁组织的最大滤过量，太岁组织取样量较大时，可分组制备溶解液，并应用若干个滤器进行过滤，最后将滤膜合并后进行dna提取。

步骤d中，滤膜上提取dna的具体过程为：

d-1、打开滤器，先缓慢将滤器中压住滤膜的塑料封边去除，然后用无菌镊子夹取滤膜，有菌的面朝上，放于无菌皿上，将滤膜切成小块，之后置于离心管内；

d-2、在离心管中加入液氮，用锥形玻璃杵快速研磨；

d-3、将研磨碎的滤膜应用ctab法提取dna，所提取的dna作为后续菌类存在鉴定的模板；

d-4、应用琼脂糖凝胶电泳对提取产物进行检验。

步骤d中，在提取dna时，加入溶菌酶，以同时获得革兰氏阳性、革兰氏阴性细菌dna。

步骤e中，支原体鉴定的阳性对照菌选取的是猪鼻支原体（m.hyorhinis）；细菌类鉴定的阳性对照菌选取的是假单胞菌（pseudomonassp.）；古细菌类鉴定的阳性对照菌选取的是盐场内湖古菌（h.salinusmccc4k00021）；真菌类鉴定的阳性对照菌选取的是镰刀菌（fusariumsp.）；粘菌类鉴定的阳性对照菌选取的是钙皮菌（didymiumsp.）。

一次性针头滤器有不同的直径规格，规格不同，微孔数量不同，过滤物质的量会不同，在实际操作过程中需要进行测定，用足其过滤能力，尽可能增加单次过滤富集的菌量。

选定一次性针头滤器的规格后，需测定其最大滤过量，过程为梯度增加太岁组织切块的重量，在溶解温度下，用与一次性针头滤器的容积等量的蒸馏水振荡溶解并过滤，通过观察其能否顺利过滤完全，以能够顺利过滤完全的最大太岁组织重量表示最大滤过量。在制备太岁组织溶解液时，单次过滤对应的太岁组织重量应不超过其最大滤过量，此时的切块要远小于测定溶解温度时的切块大小。试管入水浴前后要振荡，以避免溶化的太岁粘壁，水浴时间在10min以内，尽量减少对菌体的破坏。

当确定某太岁组织的溶解温度后，需检测高温对菌体的破坏力，因细菌类菌体小且受热后易破坏，可直接进行菌体pcr，故仅用细菌类的检测结果作代表。确认方法是采用细菌通用引物对滤液进行扩增的方法，检查通过滤器的滤液中是否含有细菌dna或是否含有能通过滤膜的菌体。

太岁取样重≥0.6克时，其提取物即菌体dna溶液就可用通用引物扩增的方法检测到菌类的存在。

由于扩增所需dna浓度低于琼脂糖凝胶电泳显示dna条带所需的浓度，故当用琼脂糖凝胶电泳检测提取物未出现dna条带时，表明dna浓度偏低，可用增加滤膜数量的方法解决，即加大在原滤膜用样品取样处的取样量，按原滤膜选用的滤过量，将样品分成多份，分别制成溶解液过滤，获得的多份滤膜合在一起提取dna。

本发明还提供了应用上述鉴定方法评定某类菌对太岁形成必需性的方法，具体为：应用上述的太岁组织中菌类存在的鉴定方法对太岁的若干取样位点的组织进行鉴定，若所有取样位点均含有某一类菌，则表明该类菌为普遍存在，其对太岁的形成具有必需性。

取样位点数目≥5个，各取样位点之间的距离≥3cm。

本发明操作简单，通过预先测定太岁组织的溶解温度，能够使太岁组织彻底分散，同时通过物理去除多糖类物质，避免了dna提取过程中多糖类物质的干扰，适用于在热水中能够溶解的太岁。

应用本发明，可以在保证太岁中菌类信息真实全面基础上，测定出5大类菌的存在状况和存在必需性，准确获得太岁中菌类构成信息，为更快更准地探明其生物属性奠定基础。

附图说明

图1是太岁内部组织8个取样部位提取的dna凝胶电泳结果图，图中，m：marker；1-8：8个取样部位dna。

图2是8个取样部位dna的支原体扩增结果图，图中，m：marker；1：阴性对照；2：阳性对照；3-10：8个取样部位dna扩增产物。

图3是8个取样部位dna的细菌扩增结果图，图中，m：marker；1：阴性对照；2：阳性对照；3-10：8个取样部位dna扩增产物。

图4是8个取样部位dna的古细菌扩增结果图，图中，m：marker；1：阴性对照；2：阳性对照；3-10：8个取样部位dna扩增产物。

图5是8个取样部位dna的真菌扩增结果图，图中，m：marker；1：阴性对照；2：阳性对照；3-10：8个取样部位dna扩增产物。

图6是8个取样部位dna的粘菌扩增结果图，图中，m：marker；1：阴性对照；2：阳性对照；3-10：8个取样部位dna扩增产物。

具体实施方式

下面以收集于河南省三门峡市的一个太岁为例，对本发明做进一步详细叙述。该太岁形状似尖圆柱体，重量约20千克，手感如硬橡皮，外表呈红褐色，内部组织浅红渐变至白色，尖端部分外表有明显的蜂窝状褶皱。

实施例1太岁组织溶解温度测定

1、测定溶解温度

采用试管水浴锅法测定，试管用于装太岁组织切块和水，水浴锅提供溶化热源。

试管选用18*18mm规格，装水量为与后续步骤的一次性针头滤器容量匹配，定为10ml。装此量水后，水位高占试管长1/3。

水浴锅为电加热自动温控型，控温精度为0.5℃，其水位要略高于试管的水位。

太岁组织切块大小为边长3～5mm的方块，每管投量0.4克（湿重，下同）。

通过观察得知，该太岁在自然温度下为固体，故测定温度从50℃起步，以5℃的梯度递升。

测定过程为：将装好太岁组织切块和水的试管入浴，静止放置10min。观察不到切块软化迹象，遂升温到55℃再测。如此递进，发现在85℃时，切块能完全软化成泥状，已观察不到切块痕迹和切块间隙，振荡后可形成浅红色带粘性的溶解液。因此，被测太岁的溶解温度为85℃。

2、选择滤器规格

选用millex牌一次性针头滤器，微孔大小0.22µm，滤器直径33mm。

3、测定滤器的最大滤过量

将太岁组织切成约1.5mm的块或碎屑。以0.1克为起始量梯度递增，在85℃条件下振荡溶解成溶解液，完全溶解后即停止水浴。由于振荡的原因，用时约为6min。

将溶解液进行注射过滤，当太岁组织切块重量升至0.8克时，再用力推滤器，也不能顺利过滤完全。因此，该滤器对该太岁的最大滤过量为0.7克。

实施例2、太岁组织中菌类信息的提取

1、制备太岁组织溶解液

称取太岁内部组织0.6克，切成边长约1.5mm的块或碎屑，装入加有10ml无菌蒸馏水的试管。在实施例1测的溶解温度下，即85℃下水浴，试管在入浴前后振荡，约在6min时就能完全溶化成浅红色带粘性的溶解液。

2、滤除溶解液中多糖

溶化好的太岁溶解液马上倒入装有0.22µm一次性针头滤器过滤的10ml注射器针管内，推压过滤。用10ml灭菌离心管保留滤液。

过滤完后，将注射器活塞杆拔出，加上预热至溶化温度的无菌水，再推水过膜。

3、提取4大类菌dna

按下述步骤进行：

（1）取膜切碎用微型车床车去滤器连接部分，打开滤器，无菌镊夹取滤膜，有菌面朝上，放在无菌皿上，切成小块，置于离心管内。

（2）液氮研磨离心管中加入液氮，用锥形玻璃杵快速研磨。

（3）提取将研磨碎的滤膜视同菌体，ctab法提取dna。提取的dna，即菌体dna溶液作为4大类菌的模板，用于后续鉴定方法检验。

（4）提取物检测琼脂糖凝胶电泳，在约23000bp处出现条带，表明已提取到太岁中菌类dna。

ctab法提取过程如下：

①小离心管内加入450µl65℃预热的2%ctab抽提液，加溶菌酶（50mg/ml）5µl，混匀，37℃保温20min。

②60℃水浴30min，浴后室温放置5min。

③加蛋白酶k（20mg/ml）5µl，37℃处理30min。

④加氯仿一异戊醇(24:1)450µl，上下颠倒5次充分混匀，静置5min；12000转离心10min；将上清液(约400µl)转移至另一离心管。视多糖情况可二次加氯仿一异戊醇，其用量与上清液等量。

⑤加入上步上清液4倍体积的1%ctab沉淀液，上下颠倒混匀后静置60min。

⑥12000转离心10min，弃上清液。

⑦400µl1mnaci洗离心管沉淀，上下颠倒5次后静置5min，加入1000µl冷无水乙醇，上下颠倒5次，静置5min。

⑧12000转离心10min，弃上清液。

⑨加70%酒精400µl，振摇5次洗沉淀，12000转离心10min，弃上清液后风干。

⑩沉淀溶于30µlte溶液中，即为太岁中4大类菌dna提取物。

实施例35大类菌的鉴定及其检验

1、阳性对照菌的选取和处理

选取细菌类、古细菌类、真菌类、粘菌类和支原体类的已知菌作为这5大菌类鉴定的各自的阳性对照菌，其中，支原体类鉴定的阳性对照菌选取猪鼻支原体（m.hyorhinis）；细菌类鉴定的阳性对照菌选取假单胞菌（pseudomonassp.）；古细菌类鉴定的阳性对照菌选取盐场内湖古菌（h.salinusmccc4k00021）；真菌类鉴定的阳性对照菌选取镰刀菌（fusariumsp.）；粘菌类鉴定的阳性对照菌选取钙皮菌（didymiumsp.）。

将每个阳性对照菌≥0.1克的湿菌体（支原体阳性菌为活菌种100µl），装入加有10ml无菌蒸馏水的试管中，按照与太岁组织块实施例2相同的处理方法进行处理，即将阳性对照菌同样在太岁组织的溶解温度下水浴保温约6min，然后进行过滤，其中支原体通过滤膜保留在滤液中，其他4类菌各自富集在滤膜上，然后进行dna提取，最终得到了支原体阳性对照菌滤液和细菌类、古细菌类、真菌类、粘菌类各自阳性对照菌的dna溶液。

2、支原体存在的鉴定方法及其鉴定方法检验

以经实施例2操作获取的含支原体（假定含有）滤液和经本实施例步骤1获取的支原体阳性对照菌滤液为模板，以rt-pcr级别水为阴性对照，进行通用引物扩增，以证明对太岁组织中支原体类信息提取和鉴定方法的可行性，并同时证明实施例2太岁组织取样处是否有支原体的存在。

扩增引物与条件：引物为支原体16srdna通用引物（gpo3，mgso）。反应体系25μl，引物用量各1μl，模板用量2μl，pcr反应条件：94℃5min,(94℃30s,72℃1min,)×30，72℃10min。目标条带大小288bp。

检验结果：扩增产物经琼脂糖凝胶电泳，阴性对照无目标条带，阳性对照菌有目标条带，表明上述支原体类信息提取和鉴定方法适用于支原体在太岁中存在时的鉴定；太岁组织滤液扩增的产物无目标条带，表明滤液取样部位无支原体存在。

3、4大类菌存在的鉴定方法及其鉴定方法检验

以经实施例2操作获取的含4大类菌（假定含有）的dna溶液，和经本实施例步骤1获取的细菌类、古细菌类、真菌类、粘菌类等4大类菌各自阳性对照菌dna溶液为模板，以rt-pcr级别水为阴性对照，进行各大类菌各自通用引物扩增，以证明对太岁组织中各大类菌信息提取和鉴定方法的可行性，并同时证明实施例2太岁组织取样处是否有4大类菌的存在。

由于4大类菌所用通用引物各不相同，扩增条件和产物大小也均不同，具体操作细节按菌类分述如下：

细菌类阳性菌为一株假单胞菌（pseudomonassp.），用细菌16srdnav3-v4区通用引物（341f，805r）扩增，反应体系50µl，引物用量各2μl，模板用量2μl，pcr反应条件：94℃5min；（94℃30s，45℃20s，65℃30s），6个循环；（94℃20s，55℃20s，72℃30s），21个循环，72℃5min。目标条带大小500bp。

检验结果：扩增产物经琼脂糖凝胶电泳，阴性对照无目标条带，阳性对照有目标条带，表明上述细菌类信息提取和鉴定方法适用于细菌在太岁中存在时的鉴定；太岁dna扩增的产物有目标条带，表明提取该太岁dna的取样部位有细菌存在。

古细菌类阳性菌为盐场内湖古菌（h.salinusmccc4k00021），用古细菌16srdna通用引物（21f，958r）扩增，反应体系50µl，引物用量各2μl，模板用量2μl，pcr反应条件：95℃5min；（95℃45s，60℃45s，72℃60s），30个循环；72℃10min。目标条带大小900bp。

检验结果：扩增产物经琼脂糖凝胶电泳，阴性对照无目标条带，阳性对照有目标条带，表明上述古细菌类信息提取和鉴定方法适用于古细菌在太岁中存在时的鉴定；太岁dna扩增的产物有目标条带，表明提取该太岁dna的取样部位有古菌存在。

真菌类阳性菌为一株镰刀菌（fusariumsp.），用真菌18srdna通用引物（ns1，ns8）扩增，反应体系50µl，引物用量各2μl，模板用量2μl，pcr反应条件：95℃5min；（94℃1min，55℃1min，72℃2min），30个循环；72℃10min。目标条带大小1800bp。

检验结果：扩增产物经琼脂糖凝胶电泳，阴性对照无目标条带，阳性对照有目标条带，表明上述真菌类信息提取和鉴定方法适用于真菌在太岁中存在时的鉴定；太岁dna扩增的产物有目标条带，表明提取该太岁dna的取样部位有真菌存在。

粘菌类阳性菌为一株钙皮菌（didymiumsp.），用粘菌18srdna通用引物（phys5，phys4）扩增，反应体系50µl，引物用量各2μl，模板用量2μl，pcr反应条件：94℃5min，（94℃1min，59℃1min，72℃1min30s)，30个循环；最后72℃再延伸10min。目标条带大小777～1445bp。

检验结果：扩增产物经琼脂糖凝胶电泳，阴性对照无目标条带，阳性对照有约1100bp目标条带，表明上述粘菌类信息提取和鉴定方法适用于粘菌在太岁中存在时的鉴定；太岁dna扩增的产物无目标条带，表明该提取太岁dna的取样部位无粘菌存在。

实施例4评定某大类菌普遍存在的方法

评定方法为应用实施例2~3的方法对多个取样位点的样品进行鉴定（本实施例为8个）。

从太岁内部组织取样时，位点间距离均大于3cm。取样后的处理过程与实施例2~3一样，每个位点取样重量大于等于0.6克，切成小于1.5mm的块和碎屑，85℃振荡溶解于无菌蒸馏水中，0.22µm孔径的滤器过滤，滤液保存在10ml灭菌离心管中；车出滤膜，ctab法提取dna，保藏在30µlte中。

将8个位点的样品提取的dna进行琼脂糖凝胶电泳，在约23000bp处出现条带，表明已提取到太岁中菌类dna，结果如图1所示。

在用滤液和提取的dna扩增时，按实施例3的操作设置相同的阳性对照菌和阴性对照菌，阳性菌dna（支原体为滤液）的获得过程与太岁组织的dna和滤液一样。8个位点的扩增产物琼脂糖凝胶电泳的结果如下：

支原体类阴性对照无288bp目标条带，阳性对照有目标条带，8个位点滤液均无目标条带，表明太岁组织中支原体非普遍存在，其对太岁形成无必需性，具体如图2所示。

细菌类阴性对照无500bp目标条带，阳性对照有目标条带，8个位点dna均有目标条带，表明太岁组织中细菌普遍存在，其对太岁形成有必需性，具体如图3所示。

古细菌类阴性对照无900bp目标条带，阳性对照有目标条带，8个位点dna均有目标条带，表明太岁组织中古细菌普遍存在，其对太岁形成有必需性，具体如图4所示。

真菌类阴性对照无1800bp目标条带，阳性对照有目标条带，8个位点dna均有目标条带，表明太岁组织中真菌普遍存在，其对太岁形成有必需性，具体如图5所示。

粘菌类阴性对照无约1100bp目标条带，阳性对照有目标条带，8个位点滤液均无目标条带，表明太岁组织中粘菌非普遍存在，其对太岁形成无必需性，具体如图6所示。