本发明属于天然产物药物领域，具体涉及一种微生物来源的炭皮苯酞类化合物、组合物、制备方法及其用途。
背景技术：
老年痴呆是一种由脑部疾病引起的、以进行性认知功能障碍和记忆损害为特征的中枢神经系统退行性疾病综合征，其表现为智力(包括记忆力、学习能力、方向辨认能力、语言能力、理解能力以及判断力)上的减退。一般常见的老年痴呆有阿尔茨海默病(alzheimer’sdisease，ad)、血管性痴呆病(vasculardementia，va)、路易体痴呆病(dementiawithlewybodies，dlb)以及额颞痴呆(frontotemporaldementia，ftd)等。在所有的痴呆患者中，阿尔茨海默病患者占50～70％，是老年痴呆中最常见的类型。
目前已经上市治疗老年痴呆症的药物主要以乙酰胆碱酯酶抑制剂和n-甲基-d-天门冬氨酸受体拮抗剂(nmda)为主。ad病因及发病机制极尚不清楚，目前通过提高乙酰胆碱水平来提高胆碱能神经传递仍然是目前ad最有效的治疗手段。脑中的乙酰胆碱主要有乙酰胆碱酯酶水解，因此，ache抑制剂是被研究的最多且临床上最为普遍认同的一线治疗ad药物，如他克林、多奈哌齐、雷司替明和加兰他敏。但市面上天然产物来源的药物报道较少。
技术实现要素：
本发明的一个目的是提供一种微生物来源的炭皮苯酞类化合物或其药学上可接受的盐，一种炭皮苯酞类化合物或其药学上可接受的盐，其结构式如式(i)所示：
式中，
r1表示h、任选取代的c1-c14烷基、任选取代的c1-c14烷硫基、任选取代的c1-c14烷氧基、或c1-c14链烯基；
r2表示h、任选取代的c1-c14烷基、任选取代的c1-c14烷硫基、任选取代的c1-c14烷氧基、或c1-c14链烯基；
r3表示h、任选取代的c1-c14烷基、任选取代的c1-c14烷硫基、任选取代的c1-c14烷氧基、或c1-c14链烯基；
进一步地，式(i)中，r1表示h、c1-c14烷基、卤代c1-c14烷基、c1-c14烷硫基、卤代c1-c14烷硫基、c1-c14烷氧基、卤代c1-c14烷氧基或c1-c14链烯基；
r2表示h、c1-c14烷基、卤代c1-c14烷基、c1-c14烷硫基、卤代c1-c14烷硫基、c1-c14烷氧基、卤代c1-c14烷氧基或c1-c14链烯基；
r3表示h、c1-c14烷基、卤代c1-c14烷基、c1-c14烷硫基、卤代c1-c14烷硫基、c1-c14烷氧基、卤代c1-c14烷氧基或c1-c14链烯基；
进一步地，式(i)中，r1表示h、c1-c6烷基、c1-c6烷硫基、c1-c6烷氧基或c1-c6链烯基；r2表示h、c1-c6烷基、c1-c6烷硫基、c1-c6烷氧基或c1-c6链烯基；r3表表示h、c1-c6烷基、c1-c6烷硫基、c1-c6烷氧基或c1-c6链烯基；
优选的，r1、r2、r3各自独立地选自h、甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、乙烯基；
进一步地，r1为甲基、r2为甲基、r3为甲基；或r1为h、r2为甲基、r3为甲基，即具有以下结构式的化合物：
本发明还公开了如上所述的炭皮苯酞类化合物或其药学上可接受的盐的制备方法，具体为：培养能够产生如式(i)所示的炭皮苯酞类化合物的微生物，用柱层析方法分离微生物的发酵液，经洗脱、后处理得到所述炭皮苯酞类化合物；
进一步地，所述微生物为炭皮属真菌69-8-7-1，保藏号为：cgmccno.17776。
进一步地，s1：将炭皮属真菌69-8-7-1接种于培养基中进行菌种培养，得到发酵物；
s2：将s1所得发酵物用乙酸乙酯浸泡提取2-4次，合浓缩至干得粗提物；
s3：s2所得粗提物经硅胶柱洗脱，再经柱层析梯度洗脱得到4个馏分，取所需馏分过中低压液相ods柱层析，再经梯度洗脱得9个馏分，取所需馏分进行反相hplc制备并进行洗脱，得如式(i)化合物；
再进一步地，s1所述的操作包括以下步骤：将所述菌株在pdb培养基上培养3～7d，然后接种至含大米培养基的容器中静止培养得发酵物；
再进一步地，s2所述的乙酸乙酯提取次数为3次；
再进一步地，s3所述的操作具体包括以下步骤：
粗提物经硅胶柱，经环己烷和甲醇洗脱，得到环己烷部分c和甲醇部分w；然后对甲醇部分w进行中低压ods柱层析，依次用体积比为20:80、50:50、70:30和100:0的甲醇-水梯度洗脱得到4个馏分(w1、w2、w3、w4)；再将体积比70:30甲醇-水洗脱得到的子馏分w2过中低压液相ods柱层析，依次用体积比10:90,15:85,20:80,25:75,30:70,35:65,40:60,45:55,50:50,100:0的甲醇-水梯度洗脱，得到w2-1,w2-2,w2-3,w2-4,w2-5,w2-6,w2-7,w2-8和w2-9共9个子馏分；将子馏分w2-9进行反相hplc制备，使用乙腈-水-甲酸流速为8ml/min进行洗脱，得到w2-9-1,w2-9-2,w2-9-3,w2-9-4,w2-9-5,w2-9-6,w2-9-7,w2-9-8和w2-9-9共9个子馏分；将子馏分w2-9-9经过反相hplc制备，使用乙腈-水-甲酸流速为3ml/min进行洗脱，得到式(ii)化合物炭皮苯酞a，所获得化合物纯度为95％；将子馏分w2-8经过反相hplc制备，使用乙腈-水-甲酸流速为3ml/min进行洗脱，得到w2-8-1,w2-8-2,w2-8-3,w2-8-4和w2-9-5共5个子馏分；将子馏分w2-8-3经过反相hplc制备，使用乙腈-水-甲酸流速为3ml/min进行洗脱，得到式(iii)化合物炭皮苯酞b。
本发明还公开了一种药物组合物，包括如上所述的炭皮苯酞类化合物或其药学上可接受的盐中的至少一种；
优选的，所述药物组合物还包括药学上可接受的载体；
进一步地，所述药物组合物中式(i)所示的炭皮苯酞类化合物或其药学上可接受的盐的含量为药物组合物重量的1-90％；
进一步地，所述药物组合物的剂型为口服制剂或注射剂；
优选的，所述口服制剂选自普通片剂、分散片、肠溶片、颗粒、胶囊、滴丸、散剂、口服液或乳剂，所述注射剂为小水针剂、输液剂或冻干粉针；
本发明还公开了如上所述的炭皮苯酞类化合物或其药学上可接受的盐或如上所述的药物组合物在制备预防和/或治疗老年痴呆药物中的应用；
进一步地，所述老年痴呆选自阿尔茨海默病、血管性痴呆病、路易体痴呆病或额颞痴呆。
在上述化合物结构式的定义中，所使用的专业术语均具有如下含义：
c1-c14烷基：碳原子数为1-14的直链或支链烷基，例如甲基、乙基、丙基、异丙基或叔丁基；
c1-c14烷氧基：碳原子数为1-14的直链或支链烷基，经氧原子键连接到结构上；
c1-c14烷硫基：碳原子数为1-14的直链或支链烷基，经硫原子键连接到结构上；
c1-c14链烯基：碳原子数为1-14的直链烯基，例如乙烯基；
任选取代的：由任意取代基作为基团进行取代。
所述的药学上可接受的盐可以为本发明的炭皮苯酞类化合物与化学上可接受的酸进行反应制得的盐，其中化学上可接受的酸可以是无机酸(如盐酸、硫酸、硝酸或氢溴酸等)或有机酸(如乙酸、丙酸、丙二酸、丁酸、乳酸、甲磺酸、乙磺酸、苯磺酸、对甲苯磺酸、马来酸，苯甲酸、琥珀酸、苦味酸、酒石酸、柠檬酸、富马酸等)；所述的药学上可接受的盐也可以为本发明的炭皮苯酞类化合物与化学上可接受的碱进行反应制得的盐，其中化学上可接受的碱可以是无机碱(如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化钙、碳酸钠、碳酸钾、碳酸氢钠或碳酸氢钾)或有机碱(如三甲胺、三乙胺、吡啶等)；
进一步地，所述的药学可接受的盐可以为钾盐、钠盐、铵盐、钙盐、吡啶盐或胆碱盐。
本发明所述的化合物是通过炭皮属真菌(biscogniauxiasp.)(菌株编号：69-8-7-1)发酵、分离得到。该菌株从采自中国云南紫溪山的网裂梅地衣中分离，经分类学研究鉴定为炭皮菌biscogniauxiasp.，其its和5.8srrna基因序列的genbank登录号为mk696224，该生物材料已于2019年5月7日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，代码为：cgmcc，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，结果是：存活；保藏号为：cgmccno.17776。
本发明的另一个目的是提供一种治疗和/或预防老年痴呆的药物组合物，其包括式(ii)和/或式(iii)所示的c-6位连有1,3-二氧己环的苯酞类化合物炭皮苯酞a和b或其药学上可接受的盐及药学上可接受的载体。
在一个实施方式中药物组合物中含有的活性成份(即本发明化合物)的量可以根据患者的病情、医生诊断的情况特定的加以应用，活性化合物的量或浓度在一个较宽的范围内调节，通常，活性化合物的量范围为组合物的1％～90％(重量)。
尽管本发明的化合物可以不经任何配制直接给药，但所述的各种化合物优选以与药学上可接受的辅料制备成药物制剂使用。药学上可接受的辅料包括稀释剂、润滑剂、粘合剂、崩解剂、稳定剂、溶剂等。
本发明所述稀释剂包括但不限于淀粉、微晶纤维素、蔗糖、糊精、乳糖、糖粉、葡萄糖等；所述润滑剂包括但不限于硬脂酸镁、硬脂酸、氯化钠、油酸钠、月桂醇硫酸钠、泊洛沙姆等；所述粘合剂包括但不限于水、乙醇、淀粉浆、糖浆、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、海藻酸钠、聚乙烯吡咯烷酮等；所述崩解剂包括但不限于淀粉泡腾混合物即碳酸氢钠和枸橼酸、酒石酸、低取代羟丙基纤维素等；所述稳定剂包括但不限于多糖如金合欢胶、琼脂、藻酸、纤维素醚和羧甲基甲壳酯等；所述溶剂包括但不限于水、平衡的盐溶液等。
在一个实施方案中，所述药物制剂包括口服制剂与注射制剂。
在一个实施方案中，所述口服制剂为固体口服制剂、液体口服制剂，药剂学可接受的口服剂固体制剂包括，但不限于普通片剂、分散片、肠溶片、颗粒、胶囊、滴丸、散剂等，口服液体制剂有口服液、乳剂。
在一个实施方案中，所述注射剂包括，但不限于小水针、输液、冻干粉针等。
所述制剂可以根据本领域常规的工艺制备而成。
综上所述，由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果是：
本发明相对于现有技术，具有以下的优点和有益效果：本发明所示的炭皮苯酞a和b是新的微生物来源的炭皮苯酞类化合物；本发明通过生物活性测试实验表明炭皮苯酞a和b具有抗老年痴呆症活性，可作为制备预防或治疗神经退行性疾病的药物。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。现在已知的或进一步开发的本发明的变化被认为落入本文中描述的和以下要求保护的本发明范围之内。
下列实施例中，质谱仪为美国waters公司生产的waterssynaptg2tof质谱仪。超导核磁共振仪为brukerav-400和brukerav-600。薄层色谱用硅胶gf254和柱色谱硅胶(200-300目)均为青岛海洋化工厂产品。反相ods填料50μm为日本ymc公司产品。中低压液相色谱仪为上海利穗电子科技有限公司产品。液相分离所使用色谱柱为phenomenexgeminic8column(21.2×250mm,5μm)，phenomenexbiphenylcolumn(10.0mm×250mm,5μm)和ymc-packods-acolumn(10.0mm×250mm,5μm)。液相色谱用乙腈为色谱纯，水为双重蒸馏水，其他试剂均为分析纯。
实施例1
炭皮属真菌69-8-7-1大量发酵及其样品前处理方法：
(1)炭皮属真菌69-8-7-1经pda斜面活化后接种于pdb培养基，在25℃下以200r.min-1震荡培养5d制备种子液，再按照5ml/瓶接种量把种子液接种到20瓶装有大米培养基的三角烧瓶中，25℃，静止培养48d，得到发酵物。所述大米培养基由以下组分组成：大米70g/瓶，纯净水105l/瓶。
(2)将发酵物加入乙酸乙酯进行浸泡提取3次，将提取液减压浓缩至干，得到粗提物(30.5g)。
实施例2
炭皮苯酞a和炭皮苯酞b的制备：
粗提物经硅胶柱，经环己烷和甲醇洗脱，得到环己烷部分c(9.6g)和甲醇部分w(16.5g)；然后对甲醇部分w进行中低压ods柱层析，依次用体积比为20:80、50:50、70:30和100:0的甲醇-水梯度洗脱得到4个馏分(w1、w2、w3、w4)；再将体积比70:30甲醇-水洗脱得到的子馏分w2(2.4g)过中低压液相ods柱层析，依次用体积比10:90,15:85,20:80,25:75,30:70,35:65,40:60,45:55,50:50,100:0的甲醇-水梯度洗脱，得到w2-1,w2-2,w2-3,w2-4,w2-5,w2-6,w2-7,w2-8和w2-9共9个子馏分。将子馏分w2-9(871.4mg)进行反相hplc制备(phenomenexgeminic8column)，使用乙腈-水-甲酸(35:65:0.1,v/v/v)流速为8ml/min进行洗脱，得到w2-9-1,w2-9-2,w2-9-3,w2-9-4,w2-9-5,w2-9-6,w2-9-7,w2-9-8和w2-9-9共9个子馏分。将子馏分w2-9-9经过反相hplc制备(phenomenexbiphenylcolumn)，使用乙腈-水-甲酸(35:65:0.1,v/v/v)流速为3ml/min进行洗脱，得到式(ii)化合物炭皮苯酞a(tr:32.5min,6.8mg)，所获得化合物纯度为95％。将子馏分w2-8(464.0mg)经过反相hplc制备(ymc-packods-acolumn)，使用乙腈-水-甲酸(35:65:0.1,v/v/v)流速为3ml/min进行洗脱，得到w2-8-1,w2-8-2,w2-8-3,w2-8-4和w2-9-5共5个子馏分。将子馏分w2-8-3(15.4mg)经过反相hplc制备(phenomenexbiphenylcolumn)，使用乙腈-水-甲酸(30:70:0.1,v/v/v)流速为3ml/min进行洗脱，得到式(iii)化合物炭皮苯酞b(tr:19.5min,5.8mg)，所获得化合物纯度为95％。
所获得化合物的理化常数如下：
炭皮苯酞a:白色无定型粉末；[α]25.0d+1.3(c0.5,meoh)；uv(meoh)λmax(logε)223(4.30),256(1.28),301(0.65)nm；ir(kbr)νmax3065,2956,2890,1734,1688,1587,1453,1392,1272,1209,959,and879cm-1；esi-ms(negative)m/z351[m+h]+；hresims(positive)m/z351.1457[m+h]+(calcd.forc18h23o7,351.1444)；确定该化合物的分子式为c18h22o7；13c和1hnmr见表1。
炭皮苯酞b:白色无定型粉末；[α]25.0d+0.2(c0.4,meoh)；uv(meoh)λmax(logε)220(4.25),251(1.17),295(0.62)nm；ir(kbr)νmax3443,3016,2948,1759,1659,1504,1389,1246,1100,1006,and885cm-1；esi-ms(negative)m/z337[m+h]+；hresims(positive)m/z337.1279[m+h]+(calcd.forc17h21o7,337.1287)；确定该化合物的分子式为c17h20o7；13c和1hnmr见表1。
表1炭皮苯酞a和b的13cnmr及1hnmr数据和归属
acd3od为测试溶剂(1hnmrfor400mhz,13cnmrfor100mhz).
bcd3od为测试溶剂(1hnmrfor600mhz,13cnmrfor150mhz).
c难以识别的重叠信号或多重峰信号均未在列表中标明
*这个信号可以在hsqc中观察得到
#数据无法在nmr中观查到
实施例3
化合物的乙酰胆碱酯酶活性测试方法
(1)实验原理
ache催化基质碘化硫代乙酰胆碱水解，生成乙酸和碘化硫代胆碱。碘化硫代胆碱与5,5-硫代-双-2-硝基苯甲酸(5,5-dithio-bis-2-nitrobenzoicacid，dtnb)反应，生成黄色阴离子5-硫基-2-硝基苯甲酸，后者在405nm处有最大吸收，测定其在单位时间内的最大生成量，即可反映ache的活性。
(2)实验用的溶液和试剂的配制
分别称取2.622gnah2po4·h2o和21.714gna2hpo4·7h2o，将它们混合加水至1000ml，用hcl调节ph至7.40，即可配置成1mol/l磷酸盐缓冲液(pb)。称取27.4mgdtnb，用100mlpb溶解后配成浓度为0.7mm的dtnb，避光，贮于4℃以下。将8.7mg碘化硫代乙酰胆碱(atch)溶于10mlpb配成浓度为3mm的atch，-20℃保存。将8.5ml的浓盐酸加水至100ml可得1nhcl。称取3.3mgache加入到2.4585ml去离子水中，即得1u/mlache母液。将阳性药石杉碱甲(hupa)和受试单体化合物配成2×10-2m的母液。
(3)实验分组
实验共分为5组，包括受试药物(单体化合物，浓度1×10-4m)，阳性化合物，溶剂对照，空白对照和阴性对照组，所有受试药物组、空白对照组和溶剂对照组皆为3个重复，其它组皆为1个重复。
(4)实验步骤
将20μl0.2u的ache和40μl的0.2mm测试样品分别加入到96微孔板中，再将20μl3mm的atch加入到各孔中。将96微孔板放入37℃孵育30分钟，加入10μl1n的hcl到各个孔中终止反应。然后将120μl0.7mm的dtnb加入到各个孔中。将96微孔板放入酶标仪中，在405nm波长下检测荧光强度。
ache抑制百分比计算如下：i％＝[(e-s)/e]×100。s和e分别是加了测试样品和没加测试样品的ache孵育培养液。
具体实验结果如表3
表3炭皮苯酞a和b的乙酰胆碱酯酶抑制活性结果
本发明内容仅仅举例说明了要求保护的一些具体实施方案，其中一个或更多个技术方案中所记载的技术特征可以与任意的一个或多个技术方案相组合，这些经组合而得到的技术方案也在本申请保护范围内，就像这些经组合而得到的技术方案已经在本发明公开内容中具体记载一样。