突变型HOXB4重组蛋白质及其制备方法与用途与流程

文档序号：22117742发布日期：2020-09-04 15:47阅读：408来源：国知局

本发明关于突变型hoxb4重组蛋白质及其制备方法及用途，对脱氧核醣核酸结合区域的三个特定位置进行点突变所得的突变构体，可提高与脱氧核醣核酸的结合能力以及增生造血干细胞的效果。

背景技术：

脐带血是指胎儿血液循环的一部分，在母体怀孕期间，通过胎盘与母体进行氧气及养分交换，于婴儿出生时，留存于脐带与胎盘的血。脐带血富含原始干细胞，其功用与骨髓相当，是人体制造血液及免疫系统的主要来源。

造血干细胞是未分化的血液细胞，具有自我更新的能力，并且有制造血液与免疫系统的能力，如运输氧气的红血球、抵抗感染的白血球、帮助凝血的血小板、以及产生抗体的淋巴球等。目前，造血干细胞除了用来治疗许多血液疾病、免疫缺陷与肿瘤等疾病外，造血干细胞移植被广泛应用于为重建因放射治疗、化学治疗而损伤的造血、免疫机能，可再制造出新的血液与免疫系统而延续病患生命。

脐带血中的造血干细胞及前驱细胞的浓度比其在骨髓内多10-20倍，增生能力也较好。除此之外，其配对要求较低，非亲属间骨髓移植要求六个白血球抗原皆符合，脐带血干细胞移植则只要四或五个抗原相同即可。

然而，可采集的脐带血干细胞数量有限，若使用于幼儿时期尚可，若使用于成人，则稍显不足。过去研究显示同位序列基因(homeoboxgene)hoxb4对于造血干细胞自我更新的调控十分重要，可维持它在骨髓中的群集大小。

加拿大蒙特娄大学〈universityofmontreal〉的盖·萨瓦格(guysauvageau)博士及其团队针对骨髓中干细胞数目受限的情况进行研究，其团队是最早利用人类及老鼠的细胞株证明hox基因会在血球细胞表现。其中hoxb4蛋白质已最常被用于作为活体外造血干细胞(hsc)增生的有效刺激剂。

为了提升hoxb4蛋白质用于造血干细胞增生刺激剂的效果，已有数个研究致力于利用点突变或序列片段删除技术以改进该蛋白质的稳定度。例如专利公告号为8039436b2的美国专利中揭示了将hoxb4氨基酸序列第6、7、23及28个氨基酸中至少一个取代为亲脂性氨基酸，以及删除氨基酸序列第31至35的氨基酸，都有助于降低该蛋白质经由泛素(ubiquitin)的标记而被蛋白酶体(proteasome)水解的影响。而专利公告号为9783783b2的美国专利则揭示了对hoxb4上的lexe模体(motif)进行点突变(氨基酸序列第175、176及178个氨基酸)，可有效降低cul4所媒介的蛋白质水解。然而，目前尚未有研究揭露突变型hoxb4蛋白质具有更佳的脱氧核醣核酸(dna)结合能力。

hoxb4同时为一dna结合蛋白质，在结构上包含有一dna键结区域，先前已委托中国台湾的弘光科技大学的陈晔博士通过x-ray射线晶体技术解出hoxb4的dna键结区域的结构(图1)。其结构与蛋白质数据库中名称为1b72的hoxb1蛋白质结构(图2)相似。根据hoxb4蛋白质的dna键结区域与dna键结的仿真三维结构图，位于结合区域序列上第47、48与59个氨基酸在dna键结扮演重要的角色(图3a、图3b)。这三个位置分别为精氨酸(arginine,r)、麸酰氨酸(glutamine,q)与赖氨酸(lysine,k)，其对应在hoxb4全长序列分别为第204、205及216个氨基酸，为求一致性，将以r204、q205与k216使用于后续描述。

于是，本发明通过基因工程技术，针对hoxb4蛋白质的dna结合区域的上述所提三个特定位置，进行氨基酸变异，以聚合酶连锁反应进行质体点突变，进而改变其蛋白质阶段的氨基酸。经由本发明所制得的单一突变点重组蛋白质与双突变点重组蛋白质与dna结合能力皆有所提升，且双突变点重组蛋白质的干细胞增生能力优于野生型hoxb4蛋白质。

技术实现要素：

基于以上的目的，本发明针对hoxb4蛋白质的dna结合区域的上述所提三个特定位置，进行氨基酸变异，以聚合酶连锁反应进行质体点突变，以得到相较于野生型hoxb4蛋白质，具有与dna分子更好的结合能力，以及更佳的干细胞增生能力。

于是，本发明的一方面关于一种突变hoxb4(homeoboxb4)蛋白质，其包含如下氨基酸序列：于序列编号2所表示的氨基酸序列或与其具有至少95％的一致性的氨基酸序列中，相当于序列编号2所表示的氨基酸序列的第204、205及216位置的至少一位置的氨基酸为经变异者，且与包含该序列编号2所表示的氨基酸序列或与其具有至少95％的一致性的氨基酸序列的野生型hoxb4蛋白质相比，该突变hoxb4蛋白质具有更高的与dna的结合能力。

于本发明的一些具体实施例，上述的突变hoxb4蛋白质，其中相当于序列编号2所表示的氨基酸序列的第204、205及216位中至少一位置的氨基酸经变异为中性或带正电的氨基酸。

于本发明的一些具体实施例，上述的hoxb4蛋白质，其中至少包含以下任一种的变异：相当于序列编号2所表示的氨基酸序列的第204位置的精氨酸经变异为组氨酸(histidine；his；h)或赖氨酸(lysine；lys；k)；相当于序列编号2所表示的氨基酸序列的第205位置的麸酰氨酸经变异为组氨酸(h)或精氨酸(arginine；arg；r)；及相当于序列编号2所表示的氨基酸序列的第216位置的赖氨酸经变异为组氨酸(h)或精氨酸(r)。

于本发明的其他具体实施例，上述的hoxb4蛋白质，其中相当于序列编号2所表示的氨基酸序列的第205及216位置的氨基酸分别经变异为组氨酸(h)及精氨酸(r)。

本发明的又一方面，关于一种重组蛋白质包含上述的hoxb4蛋白质及一细胞穿透胜肽(cell-penetratingpeptide)。

于本发明的一些具体实施例，所述的重组蛋白质，其中该细胞穿透胜肽为一转录活化因子(trans-activatoroftranscription,tat)。

于本发明的其他具体实施例，所述的重组蛋白质，其中该转录活化因子包含序列编号4所表示的序列。

本发明的又一方面，关于一种细胞扩增的方法，包含将促进细胞扩增的有效量的上述hoxb4蛋白质投于目标细胞，以使细胞扩增。

于本发明的一些具体实施例，上述的方法，为在体外将促进细胞扩增的有效量的hoxb4蛋白质投于至目标细胞。

于本发明的一些具体实施例，上述的方法，其中该目标细胞为前驱细胞造血干细胞、及/或由该等分化诱导而成的细胞。

于本发明的一些具体实施例，上述的方法，其中该目标细胞为一造血干细胞。

于本发明的一些具体实施例，上述的方法，其中该造血干细胞的来源为脐带血。

于本发明的一些具体实施例，上述的方法，其中该造血干细胞的来源为外围血。

于本发明的一些具体实施例，上述的方法，其中该造血干细胞的来源为骨髓。

本发明相较于野生型的hoxb4，具有相当或较高的dna结合能力及促进造血干细胞增生的效果。

附图说明

图1为经x-ray射线晶体技术解出的hoxb4蛋白质的dna键结区域的结构；

图2为hoxb1蛋白质与pbx1及dna键结的结构图(蛋白质数据库proteindatabankid:1b72)；

图3a为hoxb4蛋白质的dna键结区域与dna键结的仿真三维结构图；键结区域序列上的第47位置精氨酸arginine(r)、48麸酰氨酸glutamine(q)与dna键结扮演重要角色；

图3b为hoxb4蛋白质的dna键结区域与dna键结的仿真三维结构图；键结区域序列上的第59位置离氨酸lysine(k)与dna键结扮演重要角色；

图4为tat-hoxb4野生型重组蛋白质氨基酸序列，其中以黑色底线表示hoxb4全长序列，框示表示dna键结区域，并以粗体表示欲进行变异的氨基酸位置；

图5为ptat-ha-hoxb4质体的目标dna序列，其中以框示表示dna键结区域，并以粗体表示欲进行变异的编码序列位置；

图6为野生型/突变型tat-hoxb4重组蛋白质可于大肠杆菌表现系统经由iptg诱导产制，箭头所指为目标蛋白质电泳位置；

图7为经纯化的突变型tat-hoxb4重组蛋白质；

图8列示以表面电浆共振生物传感器量测野生型与突变型tat-hoxb4蛋白质与dna结合情形；

图9列示以野生型与突变型tat-hoxb4体外增生造血干细胞的比较结果，以其cd34+细胞数量的测量值表示。对照组以牛血清蛋白(bovineserumalbumin,bsa)处理。

具体实施方式

除非另有定义，本说明书所使用的所有技术以及科学术语与属于本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同。

“干细胞”是一种多能或多潜能细胞，具有自我更新及分化成不同种类细胞的能力。干细胞自然存在于动物体内，通过分化的潜能，提供动物所需的各种细胞来源。当干细胞分裂，其子代细胞仍具有干细胞特性，亦或者走向分化下游的路径，成为成熟的成体细胞。

“造血”细胞是指涉及造血过程(亦即前驱细胞形成成熟血液细胞的过程)的一种细胞。对成人而言，造血发生在骨髓。在发育早期的不同发育阶段，造血发生在不同的地点；原始血液细胞出现于卵黄囊，后来，血液细胞在肝、脾和骨髓形成。造血是经历复杂调控的过程，包括激素(例如红血球生成素)，生长因子(例如集落刺激因子)和细胞因子(例如介白素)。

本发明针对hoxb4的dna键结区域的上述所提三个特定位置，进行氨基酸变异(如图4)，其主要是利用基因工程技术，以聚合酶连锁反应进行质体点突变，进而改变其蛋白质阶段的氨基酸。

下列实施例用以说明本发明的技术内容及可达成的功效，并非意欲用以限制本发明。凡依本发明所作的任何均等变化及修饰，在发明的范围及精神内，皆属于本发明专利保护范围的范畴。

实施例

实施例1点突变质体构建

使用ptat-ha-hoxb4质体作为模板(如图5)，利用聚合酶连锁反应(polymerasechainreaction,pcr)针对特定位置精氨酸204、麸酰氨酸205与赖氨酸216进行site-directedmutagenesis(定点突变)扩增反应。以下列设计引子(如表1)分别各进行两种氨基酸突变：组氨酸(h)/赖氨酸(k)或h/精氨酸(r)，经由选殖与定序确认后，制得的新质体分别命名为ptat-ha-hoxb4_精氨酸204组氨酸、ptat-ha-hoxb4_精氨酸204赖氨酸、ptat-ha-hoxb4_麸酰氨酸205组氨酸、ptat-ha-hoxb4_麸酰氨酸205精氨酸、ptat-ha-hoxb4_赖氨酸216组氨酸及ptat-ha-hoxb4_赖氨酸216精氨酸。双点突变则以ptat-ha-hoxb4_麸酰氨酸205组氨酸作为模板，利用表一的赖氨酸216精氨酸引子组进行定点突变扩增反应，新质体命名为ptat-ha-hoxb4_麸酰氨酸205组氨酸_赖氨酸216精氨酸。

表1利用聚合酶连锁反应进行定点突变扩增反应的设计引子组

实施例2野生型与点突变型tat-hoxb4重组蛋白质的表现纯化比较

将(1)ptat-ha-hoxb4_精氨酸204组氨酸；(2)ptat-ha-hoxb4_精氨酸204赖氨酸；(3)ptat-ha-hoxb4_麸酰氨酸205组氨酸；(4)ptat-ha-hoxb4_麸酰氨酸205精氨酸；(5)ptat-ha-hoxb4_赖氨酸216组氨酸；(6)ptat-ha-hoxb4_赖氨酸216精氨酸；ptat-ha-hoxb4_麸酰氨酸205组氨酸_赖氨酸216精氨酸分别转型至大肠杆菌菌株bl21(de3)plyss(novagen)。经转型后的大肠杆菌细胞于37℃以150rpm旋转震荡培养过夜。将过夜培养液以1:50稀释至新鲜培养液，起始od600值约为0.05，并于37℃以200rpm旋转震荡生长，直至od600值为0.7-0.8，接着以1mm异丙基硫代-b-d-半乳糖(iptg)于37℃以200rpm旋转震荡进行诱导蛋白质表现3小时。iptg诱导作用对大肠杆菌细胞表现蛋白质的影响，以十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds-pageelectrophoresis)分析的结果如图6。

诱导作用后，将细胞离心收集，并以缓冲液a(8m尿素，20mmhepes,100mmnacl,ph8.0)回溶菌体。将此细胞悬浮液以高压差均质机frenchpress挤压三次，并将细胞裂解产物以18,000rpm于4℃离心30分钟使其澄清，并收取上清液。将上清液调整至含有10mm咪唑(imidazole)的缓冲液，并将样品加至histrap亲和性管柱(gehealthcare)，将结合的蛋白质以含有50、100、150、300、500及1000mm咪唑的缓冲液a进行溶析。收集含有突变型hoxb4的溶析样品，加至hitrapsp阳离子交换层析管柱，并以不含咪唑与尿素的缓冲液b(20mmhepes,1mnacl,ph8.0)利用梯度进行溶析。收集含有目标蛋白质突变型tat-hoxb4的溶析样品，并以透析方式进行蛋白质再折叠，利用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds-pageelectrophoresis)进行分析的结果如图7。将再折叠蛋白质样品分装，并以液态氮急速冷冻后，保存于-80℃。

经由点突变后的质体所表现的蛋白质，其理论分子量大小及等电点与野生型tat-hoxb4(hoxb4_野生型)差异极微小，如表2。

表2野生型/突变型tat-hoxb4的等电点与分子量列表

实施例3野生型与点突变型tat-hoxb4重组蛋白质与脱氧核醣核酸dna结合的能力

利用surfaceplasmonresonance(spr)表面电浆共振生物传感器量测tat-hoxb4蛋白质与dnahoxb4bindingconsensusdnasequence(结合共有dna序列:5’-ctgcgatgattgatgaccgc-3’)间的动态结合与解离过程，比较野生型tat-hoxb4(序列编号32)与突变型tat-hoxb4(包含单一突变精氨酸204组氨酸(序列编号34)、精氨酸204赖氨酸(序列编号36)、麸酰氨酸205组氨酸(序列编号38)、麸酰氨酸205精氨酸(序列编号40)、赖氨酸216组氨酸(序列编号42)、赖氨酸216精氨酸(序列编号44)以及双点突变麸酰氨酸205组氨酸_赖氨酸216精氨酸(序列编号46))与dna结合的能力。由图8的数据可知，除了tat-hoxb4_赖氨酸216组氨酸的结合能力与野生型tat-hoxb4相似外，其他单一突变的tat-hoxb4重组蛋白质与dna结合能力皆有1.39-1.89倍的增强现象，而双点突变重组蛋白质tat-hoxb4_麸酰氨酸205组氨酸_k216精氨酸与dna的结合能力为野生型hoxb4的50倍。以此方法量测的重组蛋白质与dna的结合能力，单一突变型以tat-hoxb4_精氨酸204赖氨酸最强，tat-hoxb4_麸酰氨酸205精氨酸次之。双点突变重组蛋白质tat-hoxb4_麸酰氨酸205组氨酸_赖氨酸216精氨酸与dna结合能力远优于任一单一点突变重组蛋白质以及野生型hoxb4。

实施例4野生型与点突变型tat-hoxb4重组蛋白质对于体外造血干细胞增生的能力

将人类脐带血中的红血球通过于4℃下于含有0.1wt％碳酸氢钠的0.83wt％氯化铵(ph7.0)中进行溶解而去除。将经收集的白血球部分与磁珠结合的特定抗体与细胞共同培养后，通过stemsep管柱分离方式进行磁性细胞分离程序以收集带cd34+细胞，并除去表现成熟人类白血球细胞的部分。取特定密度的细胞于六孔盘培养，并于早晚加入特定浓度的牛血清蛋白(bsa)或野生型或突变型tat-hoxb4重组蛋白质，连续进行4天，于第5天以flow(lin/cd34染色加正向与侧向散射光)计数干细胞数量并进行分析。

由图9的结果证明，根据本发明所制得的单一点突变tat-hoxb4重组蛋白质对于脐带血干细胞的增生能力，以tat-hoxb4_麸酰氨酸205组氨酸最佳，与野生型tat-hoxb4相当，tat-hoxb4_赖氨酸216精氨酸次之。而根据此结果更进一步进行双点突变的重组蛋白质tat-hoxb4_麸酰氨酸205组氨酸_赖氨酸216精氨酸对于造血干细胞优于前述两者，且略优于野生型tat-hoxb4。

综合上述，由本案实施例的dna键结能力及干细胞增生实验数据显示，经由本发明所制得的单一突变点重组蛋白质与dna结合能力提升1.4～1.9倍，且hoxb4_麸酰氨酸205组氨酸具有与野生型tat-hoxb4重组蛋白质相当的干细胞增生能力。而根据单一突变点重组蛋白质的干细胞增生能力分析数据，选择于麸酰氨酸205与赖氨酸216两位置进行双点氨基酸突变tat-hoxb4_麸酰氨酸205组氨酸_赖氨酸216精氨酸，此双点突变重组蛋白质的dna结合能力与野生型tat-hoxb4相比提升50倍。经本发明方法制得的突变型双点突变重组蛋白质tat-hoxb4_麸酰氨酸205组氨酸_赖氨酸216精氨酸重组蛋白质，同样可用于干细胞增生，且干细胞增生能力优于野生型tat-hoxb4。

以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非用来限定本发明专利实施的范围；即大凡依本发明专利申请保护范围所作的均等变化与修饰，皆应仍属于本发明专利涵盖的保护范围内。

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