海带α型碳酸酐酶基因Sjα-CA3及其编码蛋白和应用的制作方法

文档序号：18304531发布日期：2019-07-31 10:50阅读：473来源：国知局

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及海带α型碳酸酐酶基因sjα-ca3及其编码蛋白和应用。

背景技术：

海带(saccharinajaponica)对co2的吸收有助于缓解温室气体及水体酸化，占海水总无机碳含量的90％左右，是海水无机碳的主要形式；而co2所占的比例不足无机碳总量的1％，但海带等大型海藻的光合作用效率却远远高于陆地植物(gao&mckinley，1994)。这是因为多数海藻存在一种无机碳浓缩机制(ccm)，可以增加1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(rubisco)周围的co2浓度，使藻体能固定更多的co2以提高其光合作用效率。在ccm中，碳酸酐酶(carbonicanhydrase，ca)是一个不可缺少的组分，ca是一种含锌金属酶，能够有效地催化与co2之间的可逆反应，有助于将co2运输到rubisco周围。到目前为止，已经报道的ca有8种亚型，它们分别是α-ca、β-ca、γ-ca、δ-ca、ε-ca、ζ-ca、η-ca和θ-ca，其中，前三者广泛分布在植物、动物、真细菌和古细菌中。

技术实现要素：

本发明的主要目的在于提供海带α型碳酸酐酶基因sjα-ca3。

本发明的另一目的在于提供上述基因sjα-ca3的编码蛋白。

本发明的目的之三在于提供上述基因sjα-ca3与表达载体构建获得的重组蛋白rsjα-ca3。

本发明的目的之四在于提供上述基因sjα-ca3、和/或其编码蛋白、和/或其重组蛋白rsjα-ca3在培育高产转基因海带作物上的用途。

本发明在海带高通量测序得到一条长为774bp的contig序列基础上，利用cdna末端快速扩增(rapidamplificationofcdnaends，race)等技术获得该基因的cdna全长序列如seqidno:1所示，它长1469bp，包括332bp的5′-非翻译区(un-translatedregion，utr)，297bp且具有明显polya尾的3′-utr和840bp的开放阅读框(openreadingframe，orf)；它编码一个由279个氨基酸组成的蛋白如seqidno:3所示，相对分子质量为31.19kd，等电点为4.85。经tmhmm和ipsort预测，该蛋白在n端开始的第11ile-33arg位氨基酸具有一段强疏水性的跨膜区，同时存在长度为33个氨基酸的信号肽，酶切后的成熟蛋白由246个氨基酸组成，相对分子质量为27.52kd，等电点为4.61。通过在ncbi网站中进行同源性搜索和比对，发现该蛋白属于α-ca家族，它与海带基因sjα-ca1(genbank登录号：aef33616.1)所编码的蛋白序列具有47％的一致性，与基因sjα-ca2的编码蛋白序列具有49％的一致性，基因sjα-ca2的cdna序列如seqidno:5所示，其dna序列如seqidno:6所示，基因sjα-ca2编码蛋白的氨基酸序列如seqidno:7所示，且基于34个ca的氨基酸序列所构建的邻接和最大似然聚类图也显示，该ca与其它物种的α-ca聚为一支，因此将该基因命名为sjα-ca3。

将基因sjα-ca3不含有信号肽的orf序列连接至表达载体pet-32a中，然后导入大肠杆菌(escherichiacoli)表达菌株bl21中，经过诱导表达和亲和层析纯化，获得重组蛋白rsjα-ca3，其氨基酸序列如seqidno:4所示。用电极法和分光光度计法对重组蛋白rsjα-ca3进行检测，发现它具有将co2水合成以及将乙酸对硝基苯酯酯化成对硝基苯酚的功能，证明sjα-ca3基因为α-ca基因家族的成员。

本发明的上述技术方案采用的主要操作包括：

1)在温度17±1℃、光照强度40μmolphotons/(m²·s)和光周期16h/8h(光照/黑暗)的条件下培养海带配子体，收集海带配子体细胞，并提取总rna和基因组dna。

2)在海带高通量测序所得到一条长为774bp的contig序列的基础上设计引物，利用race技术获得该基因5′-和3′-末端的cdna序列，经拼接和重新设计引物验证，获得该基因的cdna全长序列。

3)将sjα-ca3与搜索到的其他ca的氨基酸序列利用mega6软件进行聚类分析，它与其他的α-ca聚为一支。经序列比对，发现它与sjα-ca1(genbank登录号：aef33616.1)所编码的蛋白只有47％的序列一致性，与基因sjα-ca2的编码蛋白只有49％的序列一致性，故将其命名为sjα-ca3。

4)根据sjα-ca3全长的cdna序列设计引物，利用海带配子体基因组dna作为模板进行pcr扩增，经拼接和重新设计引物验证，得到sjα-ca3的dna全长序列如seqidno:2所示。

5)根据sjα-ca3不含叶绿体转运肽的orf序列和克隆质粒pmd19-t及表达质粒pet32a多克隆位点序列设计带酶切位点的引物，利用pcr方法构建携带目的基因的克隆质粒pmd19t/sjα-ca3。

6)利用核酸内切酶ecori和xhoi分别对pmd19t/sjα-ca3和pet32a进行双酶切，回收目的片段，再用t4连接酶连接得到含目的片段的重组质粒pet32a/sjα-ca3。

7)将测序正确的重组表达质粒pet32a/sjα-ca3利用热激法转化到大肠杆菌bl21感受态细胞中，筛选到含有目的基因的转基因菌株et32a/sjα-ca3。将该转基因菌株接种到lb液体培养基中进行放大培养，当菌液在600nm的光密度(od600)值达到0.6～0.8时，加入1mm的异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(iptg)继续培养以诱导目的蛋白的表达。

8)收集菌体并破碎，利用bio-scale^tmminiprofinity^tmimaccartridges蛋白亲和层析纯化预装柱纯化到目的基因sjα-ca3的重组蛋白rsjα-ca3。

9)利用十二烷基硫酸钠(sds)聚丙烯酰胺凝胶电泳(page)电泳技术对目的重组蛋白进行电泳，然后从凝胶上分离出目的条带，使用胰蛋白酶(trypsin)对蛋白质样品进行酶解，再使用液相色谱-质谱-质谱(nanolc-qe)联用对酶解后的多肽样品进行分析，以鉴定重组蛋白的氨基酸序列。

10)利用纯化后并得到复性的rsjα-ca3分别构建体外的co2水合反应和乙酸对硝基苯酯酯化反应体系，分别用电极法和分光光度计法测定rsjα-ca3的酶活性。结果表明rsjα-ca3既具有co2的水合酶活性，也具有酯酶活性，进而从功能上鉴定sjα-ca3基因的编码蛋白。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

本发明首次从海带中分离得到海带α型碳酸酐酶基因sjα-ca3，通过基因克隆获得sjα-ca3的cdna和dna序列，然后利用原核表达获得它的重组蛋白rsjα-ca3，最后利用电极法和分光光度计法分别检测rsjα-ca3在co2水合反应的酶活性和酯酶反应活性，证明增加sjα-ca3的基因表达量有助于提高海带产量。

附图说明

图1是sjα-ca3的cdna及dna扩增产物电泳图；m：d2000分子量标准；泳道1：α-ca基因片段扩增产物；泳道2：5′-race的pcr产物；泳道3：3′-race的pcr产物；泳道4～6：基因sjα-ca3的dna分段扩增产物；泳道7：空白对照。

图2是sjα-ca3的基因结构示意图；灰色线是非翻译区，黑色线为内含子，黑色框为外显子。

图3是基于ca的氨基酸序列所构建的聚类图；箭号所指示的是本发明的基因；每个物种拉丁名后面的括号内信息表示该物种的ca蛋白序列号；在节点处斜杠前后的数据，分别为邻接法(nj)和最大似然法(ml)的靴带值。

图4是重组表达质粒pet32a/sjα-ca3构建过程中相关产物的电泳图；m1：d2000分子量标准；m2：markeriv分子量标准；泳道1：带有酶切位点的引物扩增sjα-ca3的pcr产物；泳道2：pmd19t/sjα-ca3的双酶切产物；泳道3：pet32a的双酶切产物；泳道4：pet32a/sjα-ca3的双酶切产物。

图5是重组蛋白诱导表达产物的电泳及western印迹图谱；m：蛋白质分子量标准品；泳道1～8：分别为经iptg诱导0h、1h、2h、3h、4h、5h、6h和7h的全菌蛋白；泳道9、11：空载对照；泳道10：经iptg诱导4h的全菌蛋白。

图6是pet32a质粒图谱(上)及多克隆位点区域的序列(下)。

图7是rsjα-ca3一个肽段的质谱图(上)及这个肽段在sjγ-ca3中的位置(下)；下划线表示质谱检测到的肽段序列，其中，红色字母表示上述质谱图所检测到的且在sjα-ca3中对应的氨基酸序列。

图8是sjα-ca3重组表达及其纯化产物的电泳与western印迹图谱；m：蛋白质分子量标准品；泳道1：空载对照；泳道2：沉淀蛋白；泳道3：上清蛋白；泳道4～6：分别对应于用含250mm、5mm、10mm咪唑的洗脱缓冲液洗脱的产物；泳道7：用含250mm咪唑的洗脱缓冲液洗脱的产物。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明进一步说明。

1、材料

海带配子体材料自制，在温度为17±1℃、光照强度为40μmolphotons/(m²·s)和光/暗比为16h/8h的条件下培养。所用培养基为pes(starr&zeikus，1993)，每两个星期换一次培养基。

大肠杆菌克隆菌株dh5α、表达菌株bl21(de3)和增强型hrp-dab底物显色试剂盒购自天根生化科技有限公司。

表达载体pet32a购自鼎国生物公司。

taqdna聚合酶、限制性核酸内切酶ecori和xhoi、t4dna连接酶、ta克隆载体pmd19-t购自takara公司。

bio-scale^tmminiprofinity^tmimaccartridges蛋白亲和层析纯化预装柱购自bio-rad公司。

质粒提取试剂盒、胶回收试剂盒、十六烷基三甲基溴化铵(ctab)法植物基因组dna提取试剂盒均购自北京艾德莱生物科技有限公司。

预染的蛋白质分子量标准购自thermoscientific公司。

抗聚his标签抗体和辣根过氧化物酶(hrp)标记羊抗兔igg购买于上海友科生物科技有限公司。

trizol试剂、smart^tmracecdna扩增试剂盒购自clontech公司。

氨苄青霉素钠(amp)、卡那霉素(kan)、异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(iptg)、5-溴-4-氯-3-吲哚-β-d-半乳糖苷(x-gal)均购自上海生工生物公司。

2、方法

(1)将0.1g刚离心收集的新鲜藻细胞置预冷的研钵中，加入液氮充分研磨。

(2)按照试剂盒的说明，利用ctab法提取基因组dna，-80℃保存备用；利用trizol试剂法，按照试剂盒的说明，抽提总rna，-20℃保存备用。

(3)利用反转录试剂盒对rna进行反转录(rt)pcr反应合成cdna。

①去除基因组dna反应。pcr反应体系包含2μl的5×基因组dna去除酶缓冲液、1μl的基因组dna去除酶、总rna的量最大为500ng，然后加无rna酶的去离子h2o至10μl。pcr反应条件为42℃保持2min，冷却至4℃保存。

②cdna合成。pcr反应体系包含10μl的上述pcr反应液、4μl无rna酶去离子h2o、4μl的5×primescript缓冲液、1μl的primescript^rtenzymemixi及1μl的rtprimermix。pcr反应条件为37℃保持15min、85℃保持5s、冷却至4℃保存，即完成cdna的合成反应。

(4)将在海带高通量测序所得到的一条长为774bp的contig序列，利用ncbi进行blastx搜索，发现它与海带基因sjα-ca1(genbank登录号：aef33616.1)所编码的蛋白具有47％的序列一致性，与基因sjα-ca2所编码的蛋白具有49％的序列一致性。

根据该contig序列设计1对引物α774f(gtcggaagcgcaccaagtta)和α774r(gcccaacgagtcaaccatcat)，以上述合成的cdna为模板进行pcr扩增，反应产物经琼脂糖凝胶电泳并纯化、克隆及测序，以验证该contig序列。pcr反应体系包含1μl的cdna、12.5μl的2×taqpcrmastermix及上、下游引物各1μl，最后加去离子h2o至25μl。pcr反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性45s，58.3℃退火45s，72℃延伸1min，运行35个循环；72℃延伸10min，10℃保存。pcr产物经胶回收后连接至pmd19-t载体，然后利用热激法转化大肠杆菌dh5α感受态细胞，蓝白斑筛选后挑取阳性克隆，进行菌落pcr验证，将验证后含有目的片段的阳性克隆菌液送至上海生工生物工程有限公司测序，以验证目的片段的序列。

(5)根据验证的contig序列设计基因特异引物，并利用race技术分别获得该基因的5′-和3′-末端的cdna序列。

①使用smart^tmracecdna扩增试剂盒先合成5′-race和3′-race的cdna第一链。

5′-race的cdna第一链合成。pcr合成体系包含1.75μl的无rna酶去离子h2o，1μl总rna，1μl的5′-racecdsprimera。pcr反应条件为72℃保持3min，42℃反应2min后冷却至4℃保存。取出并短暂离心后加入2μl的5×第一链缓冲液，1μl的二硫苏糖醇(dtt)(20mm)，1μl的dntp(10mm)，1μl的smartscribe反转录酶，1μl的smarteriia，0.25μl的rna酶抑制剂。pcr反应条件为42℃保持90min，72℃保持10min，冷却至4℃保存；取出后加入100μl的tricine-edta溶液(10mmtricine-naoh，0.1mmedta，ph8.0)进行稀释后，于-20℃冰箱保存备用。

3′-race的cdna第一链合成。pcr合成体系包含2.75μl的无rna酶的去离子h2o及1μl的3′-racecdsprimera，其他的反应组成及反应条件与5′-race的cdna第一链合成反应一致。反应后同样稀释、保存备用。

②5′-race与3′-race的pcr反应。

5′-race采用巢式pcr反应。第一轮的pcr反应体系包含12.5μl的2×taqpcrmastermix，9.5μl的无rna酶去离子h2o，1μl5′-race的cdna第一链反应液作为模板，1μl的引物5gsp1(gcacgcacctccgttctcgtgctcgg)，1μl的引物upm(试剂盒自带)。反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性45s、63.9℃退火45s及72℃延伸2min，最后72℃延伸10min；40个循环。第二轮pcr的反应包含1μl第一轮pcr产物作为模板，引物为5ngsp(gagaagttgagctcctcgctcgagcac)和试剂盒中的nup，其他组分同第一轮反应。反应条件为94℃预变性5min；94℃变性45s、61.5℃退火45s和72℃延伸2min，最后72℃延伸10min；共40个循环。

3′-race也采用巢式pcr反应。第一轮的pcr反应体系基本与5′-race的第一轮pcr反应体系相同，只是模板为3′-race的cdna第一链反应液，同时，基因特异性引物为3gsp1(tccgggagagcaccaatggatggtgaac)。反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性45s、69.3℃退火45s及72℃延伸2min，最后72℃延伸10min；40个循环。第二轮pcr反应体系包含1μl第一轮pcr产物作为模板，引物为3ngsp(ccgagcacgagaacggaggtgcgtgc)和试剂盒中的nup，其他组分同第一轮反应。反应条件为94℃预变性5min；94℃变性45s、66.4℃退火45s和72℃延伸2min，最后72℃延伸10min；共40个循环。

第二轮pcr反应后的产物经上述相同的胶回收、连接、转化、蓝白斑筛选和测序等过程，从而获得sjα-ca3的5′-及3′-末端的cdna序列。

(6)sjα-ca3的dna全长序列获得

根据sjα-ca3的cdna序列设计3对引物，这些引物(对应的退火温度)分别为α1f(tggctgcggatgcacgacatacaa)和α1r(acggtccagctggcgtctctc)(66.0℃)、α2f(gagagacgccagctggaccgt)和α2r(caccatgtggatctcggcgtcgt)(64.3℃)、α3f(acgacgccgagatccacatggtg)和α3r(gctccacacactcacaccaactaacc)(64.3℃)，以基因组dna作为模板进行pcr反应。pcr反应体系包含1μl的cdna、12.5μl的2×taqpcrmastermix及上、下游引物各1μl，最后加去离子h2o至25μl。pcr反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性45s，在相应的退火温度退火45s，72℃延伸2min，运行35个循环；72℃延伸10min，10℃保存。反应产物经上述相同的胶回收、连接、转化、蓝白斑筛选和测序，拼接后获得sjα-ca3的dna全长序列。

(7)对获得的sjα-ca3经tmhmm和ipsort预测其跨膜区，经signalp及chlorop分别预测其信号肽、转运肽。运用ncbi中的blastserver(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)对已获得的序列进行同源性搜索。利用mega6软件中的最大似然法(ml)和邻接法(nj)进行聚类分析。

(8)带酶切位点的目的基因开放阅读框(orf)序列克隆

根据sjα-ca3不含有叶绿体转运肽的orf序列及克隆质粒pmd19-t和表达质粒pet32a多克隆位点的序列设计带酶切位点的引物ecori-αf(gaattctcgtttgcgaaaaaacatcacga，小写字母为ecori酶切位点)和xhoi-αr(ctcgagttatacgactgatacgtagtgg，小写字母为xhoi酶切位点)，利用pcr技术扩增sjα-ca3的去除转运肽的orf片段。25μl的反应体系包括1μl的cdna、12.5μl的2×taqpcrmastermix、9.5μl的去离子h2o、1μl的上游引物及1μl的下游引物。pcr反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性45s，60.0℃退火45s，72℃延伸1min，运行35个循环；72℃延伸10min，10℃保存。pcr产物经过胶回收、ta克隆，以构建携带目的片段的克隆质粒pmd19t/sjα-ca3，然后送上海生工生物工程公司测序确保目的片段序列的准确性。

(9)重组表达质粒pet32a/sjα-ca3的构建

从测序正确的菌液中抽提质粒pmd19t/sjα-ca3，用限制性内切酶ecori和xhoi分别对其及表达质粒pet32a进行双酶切反应，37℃反应4h。酶切反应体系包含2μl的10×h缓冲液(500mmtris-hcl，100mmmgcl2，10mmdtt，1mnacl，ph7.5)、6μl的pmd19t/sjα-ca3或pet32a、1μl的ecori、1μl的xhoi及10μl去离子h2o。胶回收酶切后的目的片段，并用t4dna连接酶将酶切后的sjα-ca3片段与pet32a片段连接得到重组表达载体pet32a/sjα-ca3。连接反应体系为：3μl的目的基因片段、7.5μl的pet32a大片段、1μl的t4连接酶及2.5μl的t4缓冲液，然后加去离子h2o至25μl。将连接后的产物转化到大肠杆菌dh5α感受态细胞，按照上述方法进行菌落pcr验证和测序。

(10)重组表达质粒的提取与转化

利用质粒提取试剂盒从测序正确的菌液中抽提重组表达质粒pet32a/sjα-ca3，经双酶切反应验证后，将pet32a/sjα-ca3利用热激法转化至大肠杆菌bl21(de3)感受态细胞。培养并吸取转化的菌液进行pcr验证，并将验证后携带目的基因的菌液送至上海生工生物工程公司测序。

(11)重组蛋白的诱导表达与检测

将测序正确的携带重组质粒pet32a/sjα-ca3的表达菌株按1:1000(菌液:lb液体培养基)的比例接种于lb液体培养基，在37℃下、以180转/min(rpm)的转速活化培养10～12h。再按1:100(活化菌液:lb液体培养基)的比例，将活化的转基因菌液接种于lb液体培养基，放大培养至菌液的od600值为0.6～0.8，加iptg至终浓度为1mm，在37℃下、以180rpm的转速继续震荡培养，以诱导目的蛋白的表达。

取培养4h的菌液在4℃下、以7000rpm的转速离心5min，并将沉淀的菌体用1×磷酸缓冲液(pbs，含0.137mnacl、2.7mmkcl、10mmna2hpo4、2mmkh2po4，ph7.4)重悬。取50μl重悬全菌与2×蛋白上样缓冲液(100mmtris-hcl，ph6.8，200mm的dtt，4％sds，20％甘油，0.2％溴酚蓝)以1:1的比例混合，沸水中煮10min留样备用。将重悬的样品在液氮中反复冻融3次并超声破碎至溶液透亮。在4℃下、以14000rpm的转速离心10min。收集上清并用1×pbs按10:1(菌液:1×pbs)的比例重悬沉淀，分别留样保存。利用十二烷基硫酸钠(sds)聚丙烯酰胺凝胶电泳(page)检测重组蛋白的诱导表达情况。

(12)重组蛋白rsjα-ca3的western免疫印迹

在将蛋白样品进行sds-page电泳时，将事先剪好的与凝胶块大小一样的硝酸纤维素膜(nc)用去离子h2o浸泡1h，95％乙醇处理6s，然后放入转膜缓冲液(将30.2g的tris和144g的gly溶解于去离子h2o中并定容至1000ml)中至少平衡10min。待电泳结束后，在电转仪上，由下至上分别放入事先用转膜缓冲液平衡过的海绵垫、三层滤纸、电泳凝胶、nc膜、三层滤纸、海绵垫，使nc膜与正极相连。于4℃冰箱中在100v电压下转膜120min。转膜结束后，将nc膜取出用丽春红染色，观察蛋白是否成功转到膜上，然后用1×tbst(含0.137m的nacl、2.7mm的kcl、0.025m的tris和0.05％的tween20，ph7.4)溶液在室温下用摇床洗3次，每次10min。清洗后，将nc膜立即浸入含5％脱脂奶粉的1×tbst封闭液中，室温下孵育60min。将抗聚his标签的商用抗体作为一抗，用封闭液按1:6000(一抗:封闭液)的比例稀释一抗。将标记好的nc膜放入，室温孵育60min后，用1×tbst在摇床上洗3次，每次10min。用1×tbst按1:8000的比例稀释hrp标记的羊抗兔igg，室温下在摇床中孵育60min后，再用1×tbst洗3次，每次10min。用增强型hrp-dab底物显色试剂盒在暗室中进行显色，并拍照记录。

(13)重组蛋白rsjα-ca3的分离与纯化

根据his标签能够与金属离子发生亲和作用的原理，利用bio-scale^tmminiprofinity^tmimaccartridges蛋白亲和层析纯化预装柱来分离和纯化与组氨酸标签融合表达的重组蛋白rsjα-ca3。

①新的1ml预装层析柱分别用5倍(即5×)于层析柱柱床体积(columnvolume，cv)的超纯水、5×cv的20％的乙醇和5×cv的超纯水以2ml/min左右流速清洗层析柱。经过这样处理的层析柱即可用于后续的蛋白纯化。

②用至少5×cv的洗脱缓冲液1(6m尿素、5mm咪唑、50mmkh2po4、300mmkcl，ph8.0)平衡层析柱，流速控制在1ml/min以内。

③将自转基因菌液中制备的包涵体先用20～30ml1×pbs配制的2m尿素冰浴洗涤包涵体1h，在4℃下、以14000rpm的转速离心10min，洗去杂蛋白；再用1×pbs配制0.1％的tritonx-100，在冰浴条件下搅拌洗涤包涵体30min，在4℃下、以14000rpm的转速离心10min，去除脂类和膜蛋白；接着用10ml的8m尿素溶解包涵体，再用滤膜过滤一次，以防止堵塞柱子，然后以1ml/min的流速通过层析柱。

④再用16×cv的洗脱缓冲液1以1ml/min的流速清洗层析柱。

⑤然后，依次用16×cv的洗脱缓冲液2(含10mm咪唑，其他组分同缓冲液1，以下的洗脱缓冲液都如此，均省略)、洗脱缓冲液3(含250mm咪唑)以1ml/min的流速再次清洗层析柱，分别留样，4℃保存备用。

(14)重组蛋白rsjα-ca3的质谱鉴定与复性

吸取50μl每一梯度的洗脱液与2×蛋白上样缓冲液等体积混合后于沸水中煮10min，-20℃留样保存，利用sds-page进行电泳检测。从sds-page上分离出目的条带，使用胰蛋白酶(trypsin)对蛋白质样品进行酶解，然后使用液相色谱-质谱-质谱(nanolc-qe)联用对酶解后的多肽样品进行分析。采集多肽和多肽碎片的质量电荷比，通过搜索蛋白质质谱数据库解析氨基酸序列，并与目的基因所编码蛋白进行序列比对，以鉴定重组蛋白是否为目的蛋白。

将洗脱下来经过电泳检测的重组目的蛋白，用100×体积的缓冲液(0.05mtris-hcl，150mmnacl，1mmgsh，0.2mmgssg，1mmedta，4m尿素，arg0.4m，5％甘油，ph8.0)在4℃下透析24h；之后依次在尿素浓度为2m、1m、0m的透析缓冲液中透析12h以复性；在4℃下、以10000rpm的转速离心30min，取上清，测定蛋白浓度并浓缩，利用sds-page电泳检测，置4℃冰箱保存备用。

(15)重组蛋白rsjα-ca3的水合酶活性测定

①co2饱和水溶液的制备：将co2通入到0℃的去离子h2o中，持续通气1h。

②巴比妥混合液的配制：巴比妥0.184g，巴比妥钠1.030g，加去离子h2o至100ml，调ph至8.4，放在冰水混合物中备用。

③酶活性检测：将0.675ml纯化的rsjα-ca3(用50mmtris-hcl，ph8.0，将蛋白浓度调至0.743mg/ml)溶液加入到5ml巴比妥钠的缓冲液中，测定ph值；然后加入3ml的co2饱和水，测定下降一个ph单位(即ph自8.4降至7.4)所需要的时间(min)，整个过程要保持在冰水混合物中。

④酶活性计算：若1个酶活性单位(u)定义为(t0-t)/t(haglundetal.，1992)，其中，t0和t分别代表加入50mm的tris-hcl和蛋白酶液后下降一个ph单位所用的时间(min)，那么，rsjα-ca3的比活力即可用“(t0-t)/t/mg蛋白质”来计算。

(16)rsjα-ca3的酯酶活性测定

①对硝基苯酚(p-np)标准曲线的绘制：先配制含10％乙腈的tris缓冲液，然后用该缓冲液配制5μm、10μm、20μm、30μm、40μm、50μm、60μm、70μm、80μm、90μm、100μm、200μm、500μm等不同梯度浓度的p-np溶液。

②3mm乙酸对硝基苯酯(p-npa)配制(需现配现用)：取0.0136g的p-npa，用乙腈溶解并定容至25ml。

③操作步骤：0.839ml的重组蛋白用0.05ml的tris-hcl稀释(空白对照组是直接加入0.839ml的tris-hcl缓冲液)，然后加入0.05ml的p-npa迅速混合，用紫外分光光度计检测反应起始时405nm处的od值，并每隔3min反应时间记录其od405值，根据实验组和对照组的od405变化情况来确定其酯酶活性。

④酶活性计算：若一个酶活性单位(u)定义为在0℃下、每min产生1μmol的p-np(bhaktaetal.，2016)，那么，rsjα-ca3的比活力即可用“(c-c0)×v/t/g蛋白质”来计算；其中，c、c0分别代表加酶液和不加酶液体系中p-np的浓度(μm)，v为总反应体积(ml)，t为反应时间(min)。

3、结果

(1)根据一条长为774bp的contig序列设计引物α774f和α774r，以海带配子体的cdna为模板，扩增得到一条大小为583bp的产物(图1泳道1)。利用race技术分别获得616bp长5′-race的pcr产物(图1泳道2)和770bp长3′-race的pcr产物(图1泳道3)。经与验证的583bp片段拼接，并重新设计引物扩增、克隆与测序后，可知sjα-ca3的cdna全长序列大小为1469bp(序列1，不含polya尾巴)，包括一个长为840bp的orf区、332bp的5′-非翻译区(utr)以及297bp的3′-utr。

sjα-ca3编码一个由279个氨基酸组成的前体蛋白，相对分子质量为31.19kd，等电点为4.85。经tmhmm和ipsort预测，在n端开始的第10his-32val位氨基酸具有一段强疏水性的跨膜区。signalp的预测结果显示，sjα-ca3无信号肽；但经chlorop预测，可知它具有由33个氨基酸构成的叶绿体转运肽。这样，酶切后的成熟蛋白由246个氨基酸组成，相对分子质量为27.52kd，等电点为4.61。

基于sjα-ca3的全长cdna序列设计3对引物(α1f和α1r、α2f和α2r以及α3f和α3r)，以海带基因组dna为模板进行pcr扩增，产物的大小在1400bp～2400bp之间(图1泳道4～6)，经测序、拼接和验证，可知该基因的dna全长序列大小为5485bp(序列2)。

将该dna序列与其对应的cdna序列进行比对，发现sjα-ca3在其orf中存在6个内含子，它们的大小自5′-端开始依次为1391bp、356bp、545bp、605bp、486bp、633bp，从而将该基因的orf分隔成7个外显子(图2)。

(2)将自ncbi中同源搜索获得的33条不同物种ca的氨基酸序列与sjα-ca3用邻接法(nj)和最大似然法(ml)进行聚类分析。结果(图3)显示，34条序列明显地被聚成3大支，分别对应于α-ca(nj和ml的靴带值分别99％/81％)、β-ca(nj和ml的靴带值分别为100％/97％)和γ-ca(nj和ml的靴带值分别为99％/87％)。本研究自海带中所克隆的ca基因在聚类图中位于α-ca分支，与海带α型碳酸酐酶基因sjα-ca1和sjα-ca2很接近，表明sjα-ca3应属于α-ca家族。

(3)基于sjα-ca3不含叶绿体转运肽的orf序列和克隆质粒pmd19-t及表达质粒pet32a多克隆位点的序列，设计带酶切位点的引物ecori-αf/xhoi-αr，以海带配子体的cdna为模板，扩增sjα-ca3不带有叶绿体转运肽的orf序列(图4泳道1)，并连接至克隆质粒pmd19-t上构建pmd19t/sjα-ca3；再用ecori和xhoi分别双酶切pmd19t/sjα-ca3及表达质粒pet32a(图4泳道2和3)，连接目的片段以构建含目的基因的重组表达质粒pet32a/sjα-ca3。提取该表达质粒，经ecori和xhoi双酶切反应，其产物经电泳检测(图4泳道4)显示，该质粒是由目的基因(大小741bp)和载体序列(大小5866bp)的片段构成，表明已成功构建了pet32a/sjα-ca3的重组表达质粒。

(4)将pet32a/sjα-ca3转化大肠杆菌bl21的感受态细胞中，获得转基因细胞系et32a/sjα-ca3。经放大培养及添加iptg进行不同时间的诱导培养，收集全菌，sds-page的电泳结果(图5泳道1～8)显示，与空载的菌体(图5泳道9)相比，转目的基因的菌体产物中出现大小约为60kd的新条带，且随着iptg诱导时间的延长，该条带越来越明显，至诱导4h及以上时(图5泳道5、6和7)，该条带相应产物的量相近。这些诱导表达产物的电泳结果表明，该条带可能就是目的基因的表达产物，但它的大小(约为60kd)比重组蛋白的理论分子量(包含27.52kd由目的基因编码的蛋白及17.60kd如图6所示由表达质粒pet32a中his标签、trx标签等及多克隆位点碱基所编码的多肽)大了约15kd。

为了证明这条60kd是重组的目的蛋白，首先由于是运用表达质粒pet32a中的his标签融合表达目的蛋白，可利用商业提供的抗聚his标签的抗体，对自转基因细胞系中提取的总蛋白进行western免疫印迹，以确定表达的是否目的蛋白。western印迹结果(图5泳道10)显示在目的蛋白大小相近处只出现一条信号，而空载中无此信号(图5泳道11)，说明该蛋白具有his标签且是融合表达的目的蛋白；印迹所对应的分子量大小约为60kd，与sds-page的电泳结果(图5泳道1～8)一致。

其次，从sds-page上分离约60kd的目的条带，经酶解上样至trap柱，利用液相色谱-质谱-质谱联用，采集多肽和多肽碎片的质荷比，并搜索蛋白质谱数据库，检测到4个肽段(图7)共75个氨基酸，虽只占目的蛋白总长度(246个氨基酸)的30.49％，但每个肽段均与sjα-ca3所编码蛋白的相应片段完全匹配。这个结果表明重组的就是目的基因sjα-ca3所编码的蛋白。

(5)将添加iptg诱导培养4h的et32a/sjα-ca3，反复冻融以破碎细胞，分别提取上清和沉淀中的蛋白，经sds-page电泳，发现重组蛋白可存于上清和沉淀(图8泳道2和3)中，但主要以包涵体的形式表达于沉淀(图8泳道2)中。利用bio-scale^tmminiprofinity^tmimaccartridges蛋白亲和层析纯化预装柱，对自包涵体中提取的蛋白用含不同浓度咪唑的洗脱缓冲液进行纯化(图8泳道4、5和6)。其中，用含250mm咪唑的洗脱缓冲液洗脱下来的蛋白(图8泳道4)，经sds-page电泳和染色，在目的蛋白大小处只显现一条带而无杂带；同时，利用抗聚his标签的抗体对纯化的rsjα-ca3进行western印迹，结果在约60kd处只显现唯一印迹(图8泳道7)。结果表明，经过亲和层析，已纯化到重组蛋白rsjα-ca3。

(6)自包涵体中纯化的蛋白因构象折叠错误而无酶活性，因此在进行活性检测之前，必须对纯化的重组蛋白进行复性。将经过尿素梯度透析而复性的rsjα-ca3在体外构建co2的水合反应(即)体系，利用电极法测定可知，需要约1.5min的时间，反应体系中的ph就从8.4下降到7.4；而在不加rsjα-ca3的体系中，约需要2.1min的时间，ph才能下降到7.4。这个结果表明rsjα-ca3具有加速co2的水合反应能力，从而使反应体系在指定的时间内形成更多的h⁺。通过计算可知，rsjα-ca3的水合反应比活力为0.82±0.087u/mg蛋白(3次重复试验的平均值±标准差)。

鉴于α-ca还具有酯酶活性，本发明还构建体外将p-npa酯化成p-np的反应体系，来检测rsjα-ca3的酯酶活性。在加入rsjα-ca3的实验组中，od405值会随着时间的延长不断地增加，当反应时间到达60min时，od405值就不再发生明显的变化，也就是说此时在这个体系中几乎不产生新的p-np，表明加入的rsjα-ca3能使p-npa逐渐酯化从而生成p-np。通过计算可知，rsjα-ca3的酯酶比活力为2.157±0.007u/g蛋白(3次重复试验的平均值±标准差)。这样，通过重组蛋白的酶活性检测，鉴定了sjα-ca3编码蛋白的功能。

序列表

<110>上海海洋大学

<120>海带α型碳酸酐酶基因sjα-ca3及其编码蛋白和应用

<141>2019-05-21

<160>7

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>1496

<212>dna

<213>2ambystomalateralexambystomajeffersonianum

<400>1

tggctgcggatgcacgacatacaacgcgttcgcttatataggtattctgcacgtctaaat60

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<212>dna

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