与紫菜薹薹色基因连锁的分子标志物及其用途的制作方法

本发明涉及分子辅助育种，特别涉及与紫菜薹薹色基因连锁的indel分子标志物及其用途。

背景技术：

白菜类蔬菜(brassicarapal.)属于十字花科(cruciferae)芸薹属(brassica)，包含许多重要的蔬菜和油用作物，在我国已有两千多年的栽培历史；遗传资源极其丰富，包括大白菜、小白菜、芜菁、菜薹等多个亚种和变种；是我国分布最广，种植面积最大的蔬菜作物之一，在农业生产中占有举足轻重的地位。紫菜薹和菜心是两种不同的白菜类作物，其中紫菜薹的叶脉和叶片都会呈现紫色而菜心的叶片呈现绿色，这主要是两类不同白菜作物中的花青素含量不同导致的。

伴随着生活水平的逐步提高，人们对蔬菜的营养品质愈加重视。花青苷和黄酮醇苷作为重要的黄酮类植物次生代谢产物，广泛存在于水果和蔬菜中。研究表明这两类物质不仅对于植物的生长发育至关重要，而且具有抗氧化、抗肿瘤和改善心血管等有益于健康的功效。因此富含这两类活性物质的果蔬越来越受到消费者的青睐。此外研究白菜类作物中花青苷的自然变异特点和遗传机制，为进一步克隆关键基因，改良白菜类蔬菜的营养品质和培育富含花青苷白菜新品种提供理论依据，为挖掘和利用重要的基因资源奠定基础。

随着分子生物学技术的发展，人们对该薹色基因相关的分子标记，基因定位以及基因表达分析做了大量的研究工作。此外，在芸薹属含花青苷的蔬菜中，由于遗传背景复杂，花青苷合成调控通路存在差异，调控基因并不相同。现有研究显示，在rbr品种白菜、紫叶小白菜、紫芜菁、与红叶芥菜杂交的白菜等中分别初定位了紫色控制基因，这些基因分别位于a09、a03、a07与a02等染色体上，物理位置存在很大差异(burdzinskietal.,2007；wangetal.,2014；hayashietal.,2010；zhangetal.,2013)。而在紫色花椰菜突变体以及羽衣甘蓝的定位研究中，紫色基因定位到了c06染色体上r2r3家族的myb转录因子bomyb2(chiuetal.,2010；yanetal.,2018)。关于紫菜薹中薹色基因的定位，郭宁等人利用qtl的方法，以白菜1.5版本的基因组作为参考序列，最终定位在a09号染色体上第6068769-8028904处(guonetal.,2015)。这些研究暗示紫色性状在不同物种中并非由相同的基因控制。此外，在不同变种中紫色调控基因的遗传机制也存在差异，在不同研究中发现有的表现为质量性状，由单基因控制，有的则为数量性状，存在主效位点。这些研究说明，在芸薹属中花青苷的合成与调控具有高度的复杂性。

技术实现要素：

本发明提供根据紫菜薹和菜心的重测序数据以及后代f2群体混池的测序数据确定的一种缺失或/插入突变，其为与紫菜薹薹色基因相关的一种核酸序列长短多态性。至少部分地基于此完成了本发明。具体地，本发明包括以下内容。

本发明的第一方面，提供一种合成的寡核苷酸，所述寡核苷酸包含紫菜薹a07号染色体的薹色基因的特有序列。

在某些实施方案中，所述寡核苷酸包含下述seqidno:3所示的序列：

5’-gggaatcgatccaactttgtttc(a)n-3’，其中(a)n为polya序列，n为25-110之间自然数。优选地，合成的寡核苷酸的长度为95-130bp。

在某些实施方案中，所述寡核苷酸除了包含seqidno:5所示的序列外，进一步包含其他序列，其他序列的实例包括紫菜薹薹色基因第25181252位上游的序列，和紫菜薹薹色基因第25181356位下游的序列。优选地，其他序列的实例为seqidno:4所示的序列和seqidno:5所示的序列。

本发明的第二方面，提供一种用于鉴定植物是否包含紫菜薹的方法，其包括在待鉴定植物的dna中检测是否存在位于紫菜薹a07号染色体的薹色基因的特有序列的步骤。

在某些实施方案中，该方法包括以下步骤：

(1)从待鉴定植物样品中提取样品dna的步骤；

(2)利用正反向引物通过pcr从所述样品dna中扩增含有所述特有序列的核酸的步骤，其中所述正向引物能够特异性结合至第一靶序列区，所述反向引物能够特异性结合至第二靶序列区，所述第一靶序列区为从紫菜薹薹色基因第25181155位起至第25181272位至之间的任何连续区域，所述第二靶序列区为从紫菜薹薹色基因第25181360位起至第25181690位至之间的任何连续的区域；和

(3)通过电泳检测样品pcr产物的长度来鉴定所述植物。

优选地，进一步包括(4)利用所述正反向引物通过pcr从对照dna中扩增含有所述特有序列的核酸的步骤；和(5)将所述样品pcr产物的长度与所述对照pcr产物的长度进行比较的步骤。

在某些实施方案中，所述对照dna为来自紫菜薹的dna和/或来自菜心的dna。

本发明的第三方面，提供用于鉴定植物中薹色基因的基因型的方法，其包括检测待鉴定植物dna中位于紫菜薹a07号染色体的薹色基因的特有序列的含量的步骤。

在某些实施方案中，该方法包括以下步骤：

(1’)从待鉴定植物中提取样品dna的步骤；

(2’)在相同条件下利用正反向引物通过pcr从所述样品dna和对照dna中扩增含有所述特有序列的核酸的步骤，其中所述正向引物能够特异性结合至第一靶序列区，所述反向引物能够特异性结合至第二靶序列区，所述第一靶序列区为从紫菜薹薹色基因第25181155位起至第25181272位至之间的任何连续区域，所述第二靶序列区为从紫菜薹薹色基因第25181360位起至第25181690位至之间的任何连续的区域，所述对照dna为来自纯合型紫菜薹植物的dna和/或来自杂合型紫菜薹植物的dna；和

(3’)将所述样品pcr产物的含量与所述对照pcr产物的含量进行比较的步骤。

本发明的第四方面，提供基因片段作为分子标记物在紫菜薹育种中的用途，其中，所述基因片段包含位于紫菜薹薹色基因第25181252-25181356位之间的序列。

附图说明

图1为紫菜薹与菜心的薹色基因在白菜3.0版本基因组上的比对结果。

图2为紫菜薹dna和菜心dna的pcr扩增产物电泳结果图。

具体实施方式

现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为具体公开了该范围的上限和下限以及它们之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。除非另有说明，否则“％”为基于重量的百分数。

除非另作说明，否则本发明中的基因位置是指相对于白菜3.0版本而言的位置。

本发明的“紫菜薹”是指十字花科(cruciferae)芸薹属(brassica)的一种白菜类蔬菜(brassicarapal.)。白菜类蔬菜的实例包括大白菜、小白菜、芜菁、菜薹等多个亚种和变种。

本发明的“变种”是指一个种在学术期刊上最初被发表时，是没有种下等级(即变种、亚种、变型)的，后来随着人们对这个种的了解逐步全面、深入，发现在这个种内有一些植株个体或群体具有与最初发表这个种时所认识的该种的特征不同的变异，并且变异明显而稳定，值得把它们单独划分出来以示区别，植物学家便会给这个具有变异的类型命名，并根据不同情况，将其发表为这个种内的变种。相对而言，具有原来特征，没有发生明显变异的类型就称为这个变种的原变种。

本发明的“核酸”包括脱氧核糖核酸(即dna)和核糖核酸(即rna)。本发明中优选为dna。本发明的核酸还包括编码蛋白质的核酸和非编码蛋白的核酸。本发明优选为编码蛋白质的核酸。

本发明中，“能够特异性结合”是指在严格条件下正向引物的序列与第一靶序列区结合，和/或反向引物的序列与第二靶序列区结合，而不需dna的其他部分结合。其中，第一靶序列区是指从紫菜薹薹色基因第25181155位起至第25181272位至之间的任何连续区域。优选地，第一靶序列区为seqidno:4所示的序列内的任何连续的区域。第二靶序列区是指从紫菜薹薹色基因第25181360位起至第25181690位至之间的任何连续的区域。优选地，第二靶序列区为seqidno:5所示的序列内的任何连续的区域。更优选地，第二靶序列区是指从紫菜薹薹色基因第25181360位起至第25181450位至之间的任何连续的区域。

本发明中“严格条件”是指以比能够检测更大的程度(例如背景测定值的平均+背景测定值的标准误差×2以上的测定值)与其目标序列杂交的条件。严格条件是序列依赖性的，根据进行杂交的环境不同而不同。通过控制杂交和/或洗涤条件的严格性，可以鉴定出对引物为100％互补性的目标序列。在某些实施方案中，严格条件是指5×ssc，50％甲酰胺和42℃下的核酸杂交条件。在某些实施方案中，严格条件是指高严格条件，即对于长度为至少100个核苷酸的序列，遵循标准dna印迹程序，在42℃下在5×ssc、0.3％sds、200微克/ml剪切并变性的鲑精dna和50％甲酰胺中预杂交和杂交12至24/小时。材料最终使用0.2×ssc、0.2％sds，在65℃下洗涤三次，每次15分钟。

[合成的寡核苷酸]

本发明的第一方面，提供合成的寡核苷酸，其包含紫菜薹a07号染色体的薹色基因的特有序列。

本发明的“特有序列”属于一种“indel标记”(insertion-deletion)，是指两种亲本中在全基因组中的差异。相对另一个亲本而言，其中一个亲本的基因组中有一定数量的核苷酸插入或缺失(janderetal.,2002)。

本发明中的特有序列是指例如在白菜类蔬菜的所有亚种和变种中仅存在于紫菜薹植物的基因片段。优选地，特有序列是指存在于紫菜薹，但不存在于菜心中的基因片段。更优选地，本发明的特有序列是指在白菜类蔬菜中仅存在于紫菜薹a07号染色体而不存在于菜心a07号染色体的基因片段。还优选地，本发明的特有序列是指从紫菜薹a07号染色体的薹色基因第25181252位开始至下游约95-130pb的序列。

在某些实施方案中，本发明的寡核苷酸包含seqidno:3所示的序列：

5’-gggaatcgatccaactttgtttc(a)n-3’。其中，(a)n为polya序列，n为25-110之间的自然数。

在某些实施方案中，除了seqidno:3所示的序列外，本发明的合成的寡核苷酸进一步包含其他序列。其他序列可以是薹色基因第一个cds区和第二个cds区的序列，以及第三个cds区内的部分序列。其实例包括紫菜薹薹色基因第25181252位上游的序列，和紫菜薹薹色基因第25181356位下游的序列。优选地，其他序列的实例为第三个cds区内插入位置前面的序列，即seqidno:4所示的序列，第三个cds区内插入位置后面的序列，即seqidno:5所示的序列，或者紫菜薹薹色基因cdna中第三cds区内插入位置前面的序列，即seqidno:7所示的序列。

[用于鉴定植物是否包含紫菜薹的方法]

本发明的第二方面，提供一种用于鉴定植物是否包含紫菜薹的方法。优选地，此处的植物是指来自十字花科(cruciferae)的植物，更优选地，此处的植物为来自芸薹属(brassica)的植物，进一步优选地，此处的植物为来自白菜类蔬菜(brassicarapal.)的植物。在某些实施方案中，此处的“植物”为一种类型植物，此时本发明的方法是指用于鉴定该植物是否为紫菜薹的方法。在某些实施方案中，此处的“植物”为多种类型的植物或其植物成分的混合物，此时本发明的方法是指用于鉴定该植物中是否包含紫菜薹的方法。

本发明的方法包括在待鉴定植物的dna中检测是否存在位于紫菜薹a07号染色体的薹色基因的特有序列的步骤。关于特有序列已在第一方面中进行了说明，在此不再赘述。

本发明中，检测是否存在位于紫菜薹a07号染色体的薹色基因的特有序列的方法可采用本领域已知的任何方法，其实例包括扩增包含特有序列的核酸的方法，还包括直接对植物基因组进行测序的方法等。

在某些实施方案中，本发明的用于鉴定植物是否包含紫菜薹的方法包括利用正反向引物通过pcr从待鉴定植物样品的dna中扩增含有特有序列的基因序列的步骤。此处的正向引物能够特异性结合第一靶序列区，第一靶序列区为从紫菜薹薹色基因第25181155位起至第25181272位至之间的任何连续区域。类似地，此处的反向引物能够特异性结合至第二靶序列区。第二靶序列区为从紫菜薹薹色基因第25181360位起至第25181690位至之间的任何连续的区域。即，本发明的正向引物和反向引物所涵盖的待扩增区域至少包含了本发明的特有序列的全部序列。

在示例性实施方案中，用于鉴定植物是否为紫菜薹的方法包括以下步骤：

(1)从待鉴定植物样品中提取样品dna；

(2)利用正反向引物通过pcr从样品dna中扩增含有特有序列的基因序列的步骤；

(3)通过电泳检测样品pcr产物的长度来鉴定该植物是否为紫菜薹。

步骤(1)中，“待鉴定植物样品”是指植株整体或植株的一部分，例如，植物叶或植物茎等。

在另外的示例性实施方案中，用于鉴定植物是否包含紫菜薹的方法进一步包括(4)利用与步骤(2)中相同的正反向引物通过pcr从对照dna中扩增含有特有序列的基因序列的步骤；和(5)将样品pcr产物的长度与对照pcr产物的长度进行比较的步骤。

在示例性实施方案中，对照dna可以是作为阳性对照的来自紫菜薹的dna，也可以是作为阴性对照的来自菜心的dna。可选地，本发明的方法可以同时使用上述阳性对照和阴性对照。

本发明中，步骤(2)和步骤(4)的pcr条件优选相同，且步骤(2)和(4)可以同时进行或以间隔的时间先后单独进行。

[用于鉴定植物中薹色基因的基因型的方法]

本发明的第三方面，提供一种用于鉴定植物中薹色基因的基因型的方法。本方法中的植物优选为紫菜薹植物。本发明的基因型优选是指纯合型或杂合型。

本发明的方法包括检测待鉴定植物的dna中位于紫菜薹a07号染色体的薹色基因的特有序列的含量的步骤。检测特有序列含量的方法可采用本领域已知的任何方法，对此不限定。本方法中的含量可以是绝对含量，也可以是相对含量。

在某些实施方案中，本发明的含量是指相对于对照或参考物的相对含量。此处的对照或参考物可以是在相同条件下由对照dna获得的含量，也可以是在规定的条件(标准条件)下可通过多次重复操作获得的对照或参考数据。

在示例性实施方案中，用于鉴定植物中薹色基因的基因型的方法可包括以下步骤：

(1’)从待鉴定植物中提取样品dna的步骤；

(2’)在相同条件下利用正反向引物通过pcr从所述样品dna和对照dna中扩增含有所述特有序列的基因序列的步骤；

(3’)将样品pcr产物的含量与对照pcr产物的含量进行比较的步骤。

本方法中的正反向引物可与第二方面中所述的正反向引物相同，在此不再赘述。

本方法中的对照dna可以是作为阳性对照的来自纯合型紫菜薹植物的dna，也可以是作为阴性对照的来自杂合型紫菜薹植物的dna。本发明的对照dna还可以同时使用上述阳性对照和阴性对照。

[基因片段作为鉴定分子标记物在紫菜薹育种中的用途]

本发明的第四方面，提供基因片段作为分子标记物在分子育种中的用途。优选地，基因片段包含位于紫菜薹薹色基因第25181252-25181356位之间的至少一部分序列。

本发明的基因片段作为indel标记用于鉴定紫菜薹的分子标记物，进一步可用作紫菜薹育种的标记辅助选择工具，具有非常重要的意义。

实施例1

本实施例为与紫菜薹薹色基因紧密连锁的indel标记的开发。

indel标记来源于菜心和紫菜薹材料的重测序数据。也就是分别提取菜心和紫菜薹基因组dna，浓度范围在800-1300ng/μl，每个样品10μg送公司测序在illuminagenomeanalyzer测序系统平台上对两份样本进行重测序。其中，两种样品分别得到约32gb双端(pair-ends,pe)reads。

然后以菜心和紫菜薹为f1，杂交后挑选出f2中绿色和紫色各25单株，构建极端池然后测序。其中，两个混池分别得到约11gb双端(pair-ends,pe)reads。选择白菜3.0版本的基因组作为参考基因组，利用bwa和samtools进行snp开发。

首先将双端测序(pair-ends，pe)reads比对到白菜3.0版本的基因组上，其次在允许不少于3对reads来支持该位点，然后过滤掉质量值小于10，dp值小于5，以及indel附近5bp的位点从而获得可靠的snp位点。在子代池中找到和亲本纯合位点一致的位点信息，最后计算snp_index。参考拟南芥中花青苷合成通路基因(41个)，预测白菜中的花青苷合成相关结构基因以及调控基因，共计73个相关基因(guoetal.,2014)。最后定位紫菜薹薹色基因在a07染色体从5’端起的第25180918-25181774之间，在第25181252-25181356位之间存在插入片段。具体分析结果如图1所示。

接下来，设计正向引物indelzx_a07-f，序列如seqidno:1所示，和反向引物indelzx_a07-r，序列如seqidno:2所示。利用正向和反向引物对紫菜薹dna和菜心dna进行扩增。理论上，在紫菜薹dna中扩增得到的片段长度约为331bp；在菜心dna中扩增得到的片段长度为230bp。

对indel标记物的准确性进行验证，该验证操作如下：

1.pcr扩增的反应体系为：2uldna，引物正向和反向各0.8ul，10ul的2×rapidtaqmastermix以及双蒸水6.4ul。

2.pcr扩增的程序为：95℃预变性3分钟；95℃变性15秒，60℃退火15秒，72℃延伸15秒，35个循环；72℃保温5分钟，4℃保存。

3.琼脂糖凝胶胶板制备及电泳：

配置1％的琼脂糖凝胶：0.3g琼脂糖和0.5％tae30ml。

4.混匀然后加热3min，加入3μl的i型核酸染色剂，尽快灌胶并立刻插上梳子，梳子的厚度为1.0mm。

值得注意的是梳子的齿要在一条直线上，且梳孔处不可留有气泡，30min后倒上0.5×的电板缓冲液即可点样。本次试验每个样品做三个重复。

5.电泳条件为150v，10min。

pcr电泳结果如图2所示。结果显示：其中a泳道显示为5kmarker；b、c、d泳道结果显示，dna片段为一条，大小为230bp，与菜心的材料相吻合；e、f、g泳道结果显示：dna片段为一条，大小约为330bp，与紫菜薹的材料相吻合。

通过比较在菜心dna扩增得到的片段和在紫菜薹dna扩增得到的片段可以发现，在紫菜薹的a07染色体上插入一段序列，其序列如seqidno:6所示。

在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本申请说明书和实施例仅是示例性的。

序列表

<110>中国农业科学院蔬菜花卉研究所

<120>与紫菜薹薹色基因连锁的分子标志物及其用途

<130>bh1900065-1

<160>7

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>18

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

agatggtcactgatagcg18

<210>2

<211>21

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

cacatgattcagataccgaag21

<210>3

<211>24

<212>dna

<213>brassicarapal.

<220>

<221>polya_site

<222>(24)..(24)

<400>3

gggaatcgatccaactttgtttca24

<210>4

<211>95

<212>dna

<213>brassicarapal.

<400>4

agatggtcactgatagcgggaagattgcctggacgaaccgacgacgaagtaaggatccat60

tgggaaatttacttagagaagaaactcatgaaaat95

<210>5

<211>334

<212>dna

<213>brassicarapal.

<400>5

gggaatcgatccaactaatcatcgtatctaccatcacaccaactacacttctagacgatt60

cgtcaatgcctcgtataagaaacatgaaaccgatattattagtgatcaatcttcttcggt120

atctgaatcatgtgatatgaaactattacccgtttcaagtaccaatagctctgaggctaa180

tgctagttctggaaacagccggttgcctgacctcaacatcggtctcgtcccgataaagac240

cgtgacttctttgccagatggctcccttcaagaacctagcggatcctctaaccatggttc300

aacgagtcaagaaacacttcttctttttcagtga334

<210>6

<211>103

<212>dna

<213>brassicarapal.

<400>6

gggaatcgatccaactttgtttcaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa60

gggaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa103

<210>7

<211>257

<212>dna

<213>brassicarapal.

<400>7

atgaacaaaattagccacggcgctctctctcggccttccggaatgctgcaccgtgccaag60

aggtatagagggagaaagtacgcaaagccagaacttaaagaaagcaacttctcaaaagac120

gaggacgatctcatcctcaagcttcatgcacttcttggcaatagatggtcactgatagcg180

ggaagattgcctggacgaaccgacgacgaagtaaggatccattgggaaatttacttagag240

aagaaactcatgaaaat257