一种高产赤红球菌菌体细胞的诱变菌株及其应用的制作方法

本发明涉及微生物领域，具体涉及一种高产赤红球菌菌体细胞的诱变菌株及其应用。

背景技术：

红球菌属广泛分布于土壤、岩石、地下水、海底沉积物及动物体内。赤红球菌作为红球菌中的一员，其对有机溶剂的降解效果显著，可用于石油污染的生物修复，且在污水处理、有机染料及农药降解等方面。赤红球菌作为降解苯酚的专性菌，可高效去除苯酚，对于解决污水中高浓度酚类污染物有实用意义。另外，赤红球菌可用于产红色素，其生长快、易培养，可简单大规模工业生产，有巨大的发展潜力。

有鉴于此，获得一株能够稳定高产赤红球菌菌体细胞的菌株，同时挖掘新菌株的新用途是从业人员所迫切期望地。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题，在于提供一种高产赤红球菌菌体细胞的诱变菌株及其应用，该菌株性能优良，能发酵高产赤红球菌细胞量，可规模化高效制备具有免疫活性和抑制肿瘤功能的赤红球菌细胞及其提取物，并应用于提高机体免疫功能和抗肿瘤领域。

本发明是这样实现的：

一种高产赤红球菌菌体细胞的诱变菌株，所述诱变菌株为赤红球菌(rhodococcusruber)fim-12-23，于2019年4月3日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmccno.17526。

进一步地，所述赤红球菌(rhodococcusruber)fim-12-23的菌体细胞及其提取物在提高免疫功能药物中的应用。

进一步地，所述赤红球菌(rhodococcusruber)fim-12-23的菌体细胞及其提取物在抗肿瘤药物中的应用。

本发明具有如下优点：

提供的赤红球菌诱变菌株赤红球菌(rhodococcusruber)fim-12-23，其性能优良，能发酵高产赤红球菌细胞量，可规模化高效制备具有免疫活性和抑制肿瘤功能的赤红球菌细胞及其提取物，并应用于提高机体免疫功能和抗肿瘤领域；且该菌株稳定性良好，连续传五代其产细胞量维持在高产水平，能够作为进一步研究和开发的生产菌株。

【附图说明】

下面参照附图结合实施例对本发明作进一步的说明。

图1是本发明中菌株fim-12-23系统发育学地位图。

图2为本发明实施例的artp处理时间与出发菌株fim-12致死率的关系曲线图。

【具体实施方式】

参阅图1-2，本发明涉及一种高产赤红球菌菌体细胞的诱变菌株，所述诱变菌株为赤红球菌(rhodococcusruber)fim-12-23，于2019年4月3日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmccno.17526。

本发明还涉及上述高产细胞菌体的赤红球菌诱变菌株的应用之一，所述赤红球菌(rhodococcusruber)fim-12-23的菌体细胞及其提取物在提高免疫功能药物中的应用。

本发明的涉及上述高产细胞菌体的赤红球菌诱变菌株的应用之二，所述赤红球菌(rhodococcusruber)fim-12-23的菌体细胞及其提取物在抗肿瘤药物中的应用。

所述诱变菌株为赤红球菌(rhodococcusruber)fim-12-23，是以保藏编号为cgmccno.17525的赤红球菌(rhodococcusruber)fim-12菌株为出发菌株，采用常压室温等离子体诱变技术并筛选得到的赤红球菌(rhodococcusruber)fim-12-23菌株，对该菌株的理化特性等进行鉴定，最终鉴定其为赤红球菌菌属的一株菌株。

所述菌株为赤红球菌(rhodococcusruber)fim-12，于2019年04月03日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为cgmccno.17525。

以下结合具体实施例对本发明作进一步的说明。

实施例

一、出发菌株赤红球菌(rhodococcusruber)fim-12的分离

(1)于海南文昌八门湾红树林，采集红树林表层底泥，具体地，用取样铲采集约10cm左右土壤，放入无菌塑料封口袋中，低温保存；称取5g土样并加入50ml无菌50％陈海水的三角瓶中，振荡后静置30min，取上清液即原液进行梯度稀释，选用稀释度为10^-2、10^-3、10^-4和10^-5的悬浮液；

(2)分别取原液及选用的悬浮液0.1ml涂布于添加50mg/l重铬酸钾的水配制的isp4培养基平板上，每个样重复3个平行板，然后将涂布后的平板置于32℃培养，观察菌落外观、大小、颜色、边缘形状、表面干湿状态等形态特征；

(3)无菌操作条件下，培养7d后挑出红色且色素不分泌到培养基、表面扁平粗糙等具有代表性的单菌落，并划线接种于营养琼脂培养基斜面，置于32℃条件下培养，分离纯化得到菌株，即为赤红球菌(rhodococcusruber)fim-12(以下简称菌株fim-12)，然后于-80℃条件下将分离获得的fim-12菌株以20％甘油保存。

二、菌株赤红球菌(rhodococcusruber)fim-12-23的获得

(1)、取所述菌株fim-12并转接至营养培养基斜面上，并于恒温培养箱中培养7d，且培养温度为32℃；之后用生理盐水洗下斜面培养基上的菌苔，玻璃珠打散，经擦镜纸过滤，制成10⁶个/ml的菌悬液；

(2)、用移液枪吸取10μl步骤(1)制得的菌悬液于直径为1cm的圆形铁片上，置于以氦气作为工作气体、电源功率为110w、工作气流量10l/min的常压室温等离子体诱变系统中，且处理距离为2mm，分别处理5s、10s、15s、30s、45s、60s、90s、120s、180s，将处理后的菌悬液进行梯度稀释涂平板，制作致死率曲线(如图2所示)；表明诱变处理剂量与菌株fim-12致死率之间存在明显的剂量效应关系，随着处理时间的延长，致死率逐渐升高，辐照处理90s后菌落完全不生长；

(3)、根据步骤(2)的致死率曲线，选择75％左右致死剂量的照射时间，对菌株fim-12的菌悬液进行等离子体诱变，得诱变菌悬液，备用；

(4)、将步骤(3)所得诱变菌悬液进行梯度稀释，稀释度分别为10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6，选取10^-4、10^-5、10^-6三个稀释度的菌悬液，分别涂布于营养琼脂分离平板培养基上，于32℃避光培养7d；

(5)、将步骤(4)中各个分离平板上长出的单菌落转接营养琼脂斜面培养基上培养7天后，以划线法接种于种子培养基中，于32℃、230r/min条件下培养42h后得种子液；以5％的接种量将种子液接种于发酵培养基中，于32℃、230r/min条件下培养120h，收集橙红色发酵液，离心后水洗得赤红球菌湿细胞；

(6)通过比较细胞产量即筛选出菌体产量最高的菌株，为了方便描述，将筛选所得的菌株命名为菌株fim-12-23，且菌株fim-12-23于甘油中保存。

三、菌株fim-12-23的鉴定

(1)生理生化特性鉴定：将获得的菌株fim-12-23在营养琼脂培养基平板上划线涂菌并插入盖玻片，32℃培养7d，观察单菌落的形态特征及其菌丝。得到该菌株fim-12-23的主要形态及生理生化特性如下：

革兰氏阳性菌，不抗酸，不形成气生菌丝，不产芽孢，菌落圆形不透明，表面皱褶粗糙干燥，橙或燕红色，色素不分泌到培养基，菌丝最初丝状，后产生横膈膜进而断裂成杆状或球状；可利用蔗糖、甘油、岩藻糖、棉子糖、果糖、麦芽糖、甘露醇、糊精、葡萄糖，不利用乳糖、半乳糖、阿拉伯糖、鼠李糖、山梨糖、棉籽糖；牛奶凝固或胨化，明胶液化阴性；不利用纤维素；硝酸盐还原阴性；此菌株最适生长温度为26～37℃，最适生长ph为6.5～8.5；在摇床转速为200～250r/min，培养3～5d，菌体细胞量最高。

(2)分子生物学鉴定：对菌株fim-12-23的16srdna序列进行测序，测得的16srdna序列如seqidno.1所示；将所测的菌株的16srdna序列与genbank数据库中已有序列进行比对，及进行同源性分析；在lpsn(http://www.bacterio.cict.fr)网站上选取相应的模式株16srrna基因序列，系统进化分析用clustal-x软件进行比对，生成的比对文件用treecon软件邻接法进行系统进化分析，拓扑分析为1000次重复取样的结果；通过16srdna序列分析表明，菌株fim-12-23与赤红球菌(rhodococcusruber)的序列同源性为100％。

通过上述的鉴定，可确定该菌株fim-12-23属于赤红球菌(rhodococcusruber)，命名为赤红球菌(rhodococcusruber)fim-12-23。

四、赤红球菌(rhodococcusruber)fim-12-23菌体细胞的发酵

菌株活化：将采用甘油保存的菌株fim-12-23转接至斜面培养基上，并于恒温培养箱中培养7d，且培养温度为30℃；

种子制备：将菌株fim-12-23活化所得的斜面菌苔接种于种子培养基(500ml三角瓶内装100ml种子培养基)中，于28℃、230r/min条件下培养42h，得种子液；

发酵培养：将制得的种子液以5％(v/v)接种量接种于发酵培养基(5000ml三角瓶内装1000ml发酵培养基)中，于32℃、230r/min条件下发酵培养120h，发酵液3000r/min离心30min，将所收集的菌体纯化水洗离心，每1000ml发酵液收获赤红球菌菌体湿细胞55.6g，菌株fim-12-23湿菌体细胞产量达5.56％。

五、赤红球菌(rhodococcusruber)fim-12-23提取物的提取

将菌株fim-12-23菌体湿细胞置于-80℃低温24h，反复3次；按以1：4比例将纯化水加入湿细胞中，在冰水浴条件下超声波破碎处理，超声功率800w，超声时间5min，间隔时间2min，总时间20min；以无水乙醇提取3次，离心即得赤红球菌提取物，其产率为3.9g赤红球菌提取物粉末/100g湿细胞。

六、赤红球菌(rhodococcusruber)fim-12-23提取物对免疫器官影响

不同剂量的赤红球菌提取物试验组通过灌胃小鼠，每只小鼠每日定时灌胃0.5ml，连续20d，对照组以等量的生理氯化钠溶液(n.s)代替，停药次日眼眶静脉穿刺采血，行外周白细胞计数，处死小白鼠，分别取出胸腺、脾脏并称重。结果如表1所示，与对照组比较，菌株fim-12-23提取物明显增加胸腺脾脏重量及提升白细胞数量，提示在适当剂量下该提取物具有刺激t细胞和b细胞的作用。

表1赤红球菌提取物对小鼠免疫器官的影响

*：p<0.05

七、赤红球菌(rhodococcusruber)fim-12-23提取物对巨噬细胞功能影响

不同剂量的菌株fim-12-23提取物试验组通过灌胃免疫小鼠，每只小鼠每日定时灌胃0.5ml，连续灌胃20d，对照组以等量生理氯化钠溶液灌胃。停止灌胃次日无菌采取小鼠腹腔渗出细胞液，离心洗涤获富含mφ的小鼠腹腔细胞，调节悬液的mφ浓度为2×10⁶/ml，于96孔培养板中每孔加100μl，置37℃，5％co2培养箱培养4h，弃上清，洗涤，加入一定量的0.075％中性红溶液，37℃、5％co2培养箱培养1h。取出培养板，清洗，加入细胞裂解液(0.1m乙酸：乙醇＝1：1，v/v)150μl。静置过夜，于酶联免疫仪上测570nm的吸光值od570。结果如表2所示，三个不同剂量组的菌株fim-12-23提取物均较对照组明显提高小鼠mφ的吞噬活性，说明菌株fim-12-23的赤红球菌提取物对小鼠腹腔mφ具有明显的激活作用，激活了的mφ具有增强吞噬异物作用。

表2赤红球菌提取物对小鼠巨噬细胞吞噬中性红的影响

*：p<0.05**：p<0.001

八、菌株fim-12-23提取物对小鼠移植性肿瘤的抑瘤作用

抽取生长7d的s180小鼠腹水调整成细胞5×10⁶/ml的悬液，小鼠右腋皮下接种0.2ml/只，接种次日开始按不同剂量试验组灌胃菌株fim-12-23提取物，每日定时0.5ml/只，连续20d，对照组灌胃等量生理氯化钠溶液。停止灌胃次日解剖，取瘤称重，计算肿瘤生长抑制率。结果如表3所示，表3表明灌胃赤红球菌提取物对s180腹水型转实体瘤具有显著的抑瘤作用。

表3赤红球菌提取物对小鼠s180的抑瘤作用

*：p<0.05

九、菌株fim-12-23的遗传稳定性验证

将高产菌株fim-12-23以250ml茄子瓶连续培养6代斜面，500ml三角瓶发酵检测菌体细胞产量，以验证其遗传稳定性，菌株传代发酵实验结果如下：

对高产菌株fim-12-23连续传代6次：f1、f2、f3、f4、f5、f6，经摇瓶发酵后测定菌体细胞量，以生长良好的原代菌株(f0)为对照,其相对细胞量为100％，结果见如表4，表明菌株fim-12-23传五代发酵水平无明显影响，其细胞产量基本稳定，维持在同一较高水平；从而表明菌株fim-12-23具有较好的遗传稳定特性，目标菌种即菌株fim-12-23菌体产量水平最终维持在55.6g/l左右，相对于出发菌株fim-12菌株(35.2g/l)提高了55％以上，所以诱变菌株赤红球菌(rhodococcusruber)fim-12-23能够作为进一步研究和开发的生产菌株。

表4传代对菌株fim-12-23细胞量的影响

另外，需要说明的是，在发明所涉及的各培养基的组分如下：营养琼脂培养基的组分为：蛋白胨1.0％，牛肉膏0.3％，nacl0.5％，琼脂2.0％，余量为蒸馏水，ph7.2，121℃高压蒸汽灭菌30min；种子培养基和发酵培养基的组分均为：葡萄糖1.0％、酵母提取物1.0％、余量为蒸馏水，ph7.2，121℃高压蒸汽灭菌30min；且在无特殊说明的情形下，本发明中的百分数均为质量百分数。

综上，本发明提供的赤红球菌(rhodococcusruber)fim-12-23，其能够发酵高产赤红球菌细胞量(菌体细胞产量水平最终维持在55.6g/l左右)，高效制备赤红球菌提取物，并用于提高机体免疫功能和抑制肿瘤领域，可应用于工业化生产；且该菌株fim-12-23稳定性良好，连续传代五代其细胞产量基本稳定，能够作为进一步研究和开发的生产菌株。

虽然以上描述了本发明的具体实施方式，但是熟悉本技术领域的技术人员应当理解，我们所描述的具体的实施例只是说明性的，而不是用于对本发明的范围的限定，熟悉本领域的技术人员在依照本发明的精神所作的等效的修饰以及变化，都应当涵盖在本发明的权利要求所保护的范围内。

序列表

<110>福建省微生物研究所

<120>一种高产细胞菌体的赤红球菌诱变菌株及其应用

<130>100

<160>1

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>1394

<212>dna

<213>（rhodococcusruber）

<400>1

catgcaagtcgaacgatgaagcccagcttgctgggtggattagtggcgaacgggtgagta60

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