基于多重PCR合成寡核苷酸探针的方法与流程

一、技术领域

本发明公开了基于多重pcr合成寡核苷酸探针的方法，有利于开展经测序植物染色体的细胞遗传学研究，属于植物生物技术领域。

二、技术背景

利用荧光原位杂交技术(fluorescenceinsituhybridization，fish)，使研究对象的特定染色体区段、染色体臂或整条染色体发出某种颜色的荧光，从而可以在荧光显微镜下可视化染色体的技术称为染色体涂染，该技术大大加深了我们对染色体结构及变化的理解。例如，利用该技术分析和研究染色体的重组、畸变以及同源基因(riedetal.，1998)；此外，染色体涂染技术未经过基因组测序的近缘种间基因组的比较研究提供了新的方法，通过种间比较染色体涂染的方法能直观地展示物种间的染色体结构的差异，从而我们可以分析近缘物种间染色体的重排关系(jiangetal.，2006)。

但是，由于植物细胞壁和植物染色体中大量重复序列的存在，使得植物染色体涂染在很长时间都难以开展。大量的研究者进行了诸如大片段克隆(bac、yac、fosmid克隆等)探针、单拷贝探针等改进使该技术可以应用于植物染色体研究中(franszetal.，2000；lysaketal.，2003，2006；mandakovaetal.，2010；louetal.，2014)。但是，由于探针制备过程繁琐且劳动密集(lysaketal.，2013)，对染色体制片技术要求较高，在植物的染色体研究中应用仍然比较有限。

近年来，寡核苷酸合成技术的发展为解决植物染色体研究的问题开创了一种新的方式(cuadradoetal.，1998，2002)。han等(2015)通过筛选已测序植物物种基因组中特异的寡核苷酸制成的寡核苷酸探针，可以便捷的完成对植物特异染色体区段或染色体的全长的涂染。因此，该方法对经测序的植物染色体研究有较大的潜力，并且已经在部分物种如草莓、马铃薯、番茄、茄子上都进行了许多成功的研究(quetal.，2017；brazetal.，2017)。

但是，由于对寡核苷酸探针的应用还处于起步阶段，现有的寡核苷酸探针合成方法复杂、劳动密集且耗时长，此外，合成寡核苷酸探针所需的试剂价格高昂，一次性投入较大，所以实际研究中使用较少。为此我们提出了一种基于多重pcr的分段寡核苷酸探针涂染的技术。该技术基于黄瓜的基因组序列信息，筛选合成了黄瓜染色体的寡核苷酸文库，在探针设计过程中使用双接头的方式将染色体文库进行分段，通过多重pcr的方法简便、快捷的合成大量实验所需的某一段、某几段或整条染色体的寡核苷酸探针，使得寡核苷酸探针的利用更加简便、灵活，通过合成双链的寡核苷酸探针还可以加强信号的强度。该技术有利于寡核苷酸探针在植物染色体研究中的推广应用。

三、

技术实现要素：

技术问题

本发明利用黄瓜基因组信息，筛选合适的寡核苷酸并进行双接头分段设计，选取对应的带有荧光基团标记的引物，通过多重pcr合成所筛选的寡核苷酸探针经纯化后即可用于植物染色体研究，是针对寡核苷酸探针合成技术繁琐、且合成文库固定无法灵活利用的问题，开发出的一种仅通过pcr即可灵活利用寡核苷酸探针的方法。

技术方案

本发明所基于多重pcr合成寡核苷酸探针的方法，其实施方案如下：

1)针对黄瓜4号染色体，以黄瓜‘9930’基因组为参考，通过chorus软件筛选所需的寡核苷酸文库。

2)使用repeatmasker去除黄瓜基因组中所有的重复序列，然后将基因组序列分成48nt的寡核苷酸，并弃去含有多于6个核苷酸的均聚物。

3)使用blat将每个寡核苷酸与参考基因组比对，选择＞75％相似性的寡核苷酸。

4)利用primer3保留dtm＞10℃的寡核苷酸以构建探针数据库，从探针数据库中选择与特定染色体或基因组区域相关的探针。

5)筛选出覆盖黄瓜4号染色体(约23.3mb)的寡核苷酸探针共93396个，平均每kb约3.8个探针。

6)通过双接头的连接方式将寡核苷酸文库进行分段。

7)将300ng的寡核苷酸文库溶解于300μl的无dna/rna水中制成1ng/μl的储备溶液(-80℃储存)，之后将2μl储备溶液与26μl水混合，制备寡核苷酸文库的工作液，储存在-20℃中。

8)pcr中所使用前后引物均使用fam和tamra在引物5’端进行修饰。

9)按照表1中所述体系进行pcr。

表1pcr体系

使用如下pcr程序扩增寡核苷酸片段：95℃3分钟，98℃20秒，54℃15秒，72℃30秒，从步骤2开始进行15个循环，98℃20秒，56℃为15秒，72℃持续30秒，从步骤5开始25个循环，最后温度保持在4℃。pcr反应产物可在进行纯化后直接用作探针。

有益效果

本发明与现有技术相比，具有如下优点和积极效果：

1)基于多重pcr合成寡核苷酸探针的方法与现有技术相比，充分提高了探针合成的效率。

2)使用双接头的方式分段设计的寡核苷酸文库，在合成过程中可以根据实验需要灵活的选用其中覆盖某一段、某几段或覆盖整条染色体的寡核苷酸探针引物，提高了探针利用过程中的灵活度。

3)在合成寡核苷酸探针过程中，可以将双链寡核苷酸探针中的一条链带有绿色荧光，另一条链带有红色荧光，在实验过程中可以一次利用三种颜色的寡核苷酸探针，提高了实验效率。

4)该方法合成出的寡核苷酸探针可以作为文库继续合成可利用的寡核苷酸探针，因此一旦合成即可永久使用，降低了实验成本。

四、附图说明

图1：多重pcr合成寡核苷酸探针原理示意图。

图2：通过pcr合成的黄瓜4号染色体寡核苷酸探针chr4-t(红色)在黄瓜中期和粗线期染色体上的涂染。

图3：通过pcr合成的分段寡核苷酸探针在黄瓜粗线期染色体上的涂染。其中chr4-1，-3，-5，-7为红色信号，chr4-2，-4，-6，-8为绿色信号。

图4：通过pcr合成双链一红一绿的寡核苷酸探针在fish中出现明显可辨的类似黄色的信号。

五、具体实施方式

本发明基于多重pcr合成寡核苷酸探针的方法的实施程序包括：

1)寡核苷酸文库的设计：针对黄瓜4号染色体，以黄瓜‘9930’基因组为参考，通过chorus软件筛选所需的寡核苷酸文库。使用repeatmasker去除黄瓜基因组中所有的重复序列，然后将基因组序列分成48nt的寡核苷酸，并弃去含有多于6个核苷酸的均聚物。使用blat将每个寡核苷酸与参考基因组比对，选择＞75％相似性的寡核苷酸。利用primer3保留dtm＞10℃的寡核苷酸以构建探针数据库，从探针数据库中选择与特定染色体或基因组区域相关的探针。筛选出覆盖黄瓜4号染色体(约23.3mb)的寡核苷酸探针共93396个，平均每kb约3.8个探针。此外，通过双接头的连接方式将寡核苷酸文库进行分段。

2)寡核苷酸探针的合成：将300ng的寡核苷酸文库溶解于300μl的无dna/rna水中制成1ng/μl的储备溶液(-80℃储存)，之后将2μl储备溶液与26μl水混合，制备寡核苷酸文库的工作液，储存在-20℃中。根据上述体系和程序进行pcr，pcr中所使用前后引物均使用fam和tamra在引物5’端进行修饰，pcr反应产物可在进行纯化后直接用作探针。

3)荧光原位杂交及信号检测：取2μl所得寡核苷酸探针，制成探针杂交液(含寡核苷酸探针、50％去离子甲酰胺，2×ssc，10％硫酸葡聚糖)于90℃金属浴中变性6分钟，冰浴10min，含有良好染色体的载玻片于80℃的70％去离子甲酰胺中变性90s，以70％、90％、100％系列冰乙醇脱水各5min，晾干，将变性的探针杂交液滴于变性后的玻片上，封片，置原位杂交仪中37℃杂交过夜。洗片后室温风干，加入含有抗荧光淬灭剂的dapi，盖玻片封片后在避光的条件下，用olympusbx51荧光显微镜观察杂交信号。