一种核桃中乙酰5-羟色胺的分离方法及应用与流程

本发明涉及一种核桃中乙酰5-羟色胺的分离方法及应用，属于食品、保健食品、医药技术领域。

背景技术：

核桃是胡桃(juglansregiall.)的成熟种子，含有丰富的不饱和脂肪酸，有“木本油料王”之称，具有改善脑缺血，抗疲劳，提高记忆力的作用。核桃中含有多种营养成分对大脑神经有一定的益处，可以提高脑神经的生理功能，增强神经细胞活力，增强记忆力。

但核桃中具体哪一种成分具有增强记忆力的功效并不清楚，也无法明确功效的机理。目前普遍认为核桃中大量的亚油酸、亚麻酸、dha等不饱和脂肪酸是健脑益智的功效成分，能净化血液，清除脑血管壁内中的杂质，提高脑细胞的血液供应量，保证脑细胞所需充足的养料和氧气，提高大脑的生理功能。不可否认多不和脂肪对大脑有较好的保护作用，但并不具有直接的提高记忆的功能，在我们对核桃提取物的成分研究中发现一种生物碱，并证实该生碱具有直接的提高记忆的活性，是核桃中具有增强记忆力的主要功效成分。

技术实现要素：

本发明首次从核桃中分离鉴定出乙酰5-羟色胺，并确定该化合物为核桃中具有增强记忆力的主要功效成分。

本发明的第一个目的是提供一种核桃中乙酰5-羟色胺的分离方法包括以下步骤：

(1)提取：将核桃经粉碎后，用10～70％体积浓度的乙醇，于30-70℃条件下搅拌提取2-5h，过滤取上清液，如此重复3次，将3次所得上清液减压浓缩去乙醇后即得核桃乙醇提取物。

(2)分离：将步骤(1)所得核桃乙醇提取物进行柱层析，用乙醇溶液洗脱，得到乙酰5-羟色胺。

在本发明一种实施方式中，所述乙酰5-羟色胺的结构式为：

在本发明一种实施方式中，步骤(1)中核桃粉和乙醇的料液比为1:10-20(m/v)。

在本发明一种实施方式中，步骤(2)中是将步骤(1)所得核桃乙醇提取物上mci柱，依次用去离子水、浓度为30％、50％、95％的乙醇进行梯度洗脱，收集30％乙醇洗脱部分；减压浓缩后上样到ods柱，依次用浓度20％、30％、40％的乙醇进行洗脱，收集30％乙醇洗脱部分；减压浓缩后上样到ods-aq柱，依次用浓度20％、30％、40％的乙醇进行洗脱，收集30％乙醇洗脱部分；将30％乙醇洗脱部分反复上ods-aq柱，最后得乙酰5-羟色胺。

本发明的第二个目的是提供一种含有上述方法得到的乙酰5-羟色胺的组合物。

在本发明一种实施方式中，所述组合物在食品领域的应用。

本发明的第三个目的是提供一种药物组合物，所述药物组合物由上述方法得到的乙酰5-羟色胺和药学上可接受的载体组成。

在本发明一种实施方式中，剂型包括粉剂、片剂、针剂、口服液或注射液。

在本发明一种实施方式中，所述药物组合物在增强记忆力方面的应用。

有益效果：

(1)采用本发明方法从核桃中分离得到的乙酰5-羟色胺具有直接的提高记忆的活性，是核桃中具有增强记忆力的主要功效成分；

(2)与现有的5-羟色胺相比，采用本发明方法从核桃中分离得到的乙酰5-羟色胺增强记忆力效果更好。

附图说明

图1为乙酰5-羟色胺组¹h-nmr图；

图2为乙酰5-羟色胺组¹³c-nmr图；

图3为乙酰5-羟色胺组¹³⁵dept-nmr图。

具体实施方式

以下对本发明的优选实施例进行说明，应当理解实施例是为了更好地解释本发明，不用于限制本发明。

实施例1：

从核桃中提取纯化核桃乙酰5-羟色胺方法，其步骤如下：

核桃经粉碎后，按料液比1:10(m/v)加入70％的乙醇，于50℃条件下搅拌提取3h，过滤取上清液，如此重复3次。将3次所得上清液减压浓缩去乙醇后即得核桃乙醇提取物。将核桃乙醇提取物上mci柱，依次用去离子水、浓度为30％、50％、95％的乙醇进行梯度洗脱，收集30％乙醇洗脱部分，减压浓缩后上样到ods柱，依次用浓度20％、30％、40％的乙醇进行洗脱，收集30％乙醇洗脱部分，减压浓缩后上样到ods-aq柱，依次用浓度20％、30％、40％的乙醇进行洗脱，收集30％乙醇洗脱部分。将30％乙醇洗脱部分反复上ods-aq柱，最后得一个单体化合物—乙酰5-羟色胺，该化合物为无色无定形粉未，易溶水、甲醇、乙醇。

利用hplc测定所得的乙酰5-羟色胺的收率为90％，纯度为98.1％。

实施例2：

从核桃中提取纯化核桃乙酰5-羟色胺的方法，其步骤如下：

核桃经粉碎后，按料液比1:15(m/v)加入10％的乙醇，于30℃条件下搅拌提取5h，过滤取上清液，如此重复3次。将3次所得上清液减压浓缩去乙醇后即得核桃乙醇提取物。将核桃乙醇提取物上mci柱，依次用去离子水、浓度为30％、50％、95％的乙醇进行梯度洗脱，收集30％乙醇洗脱部分，减压浓缩后上样到ods柱，依次用浓度20％、30％、40％的乙醇进行洗脱，收集30％乙醇洗脱部分，减压浓缩后上样到ods-aq柱，依次用浓度20％、30％、40％的乙醇进行洗脱，收集30％乙醇洗脱部分。将30％乙醇洗脱部分反复上ods-aq柱，最后得一个单体化合物—乙酰5-羟色胺，该化合物为无色无定形粉未，易溶水、甲醇、乙醇。所得的产品的收率为89％，纯度为98％。

实施例3：

从核桃中提取纯化核桃乙酰5-羟色胺的方法，其步骤如下：

核桃经粉碎后，按料液比1:20(m/v)加入60％的乙醇，于70℃条件下搅拌提取2h，过滤取上清液，如此重复3次。将3次所得上清液减压浓缩去乙醇后即得核桃乙醇提取物。将核桃乙醇提取物上mci柱，依次用去离子水、浓度为30％、50％、95％的乙醇进行梯度洗脱，收集30％乙醇洗脱部分，减压浓缩后上样到ods柱，依次用浓度20％、30％、40％的乙醇进行洗脱，收集30％乙醇洗脱部分，减压浓缩后上样到ods-aq柱，依次用浓度20％、30％、40％的乙醇进行洗脱，收集30％乙醇洗脱部分。将30％乙醇洗脱部分反复上ods-aq柱，最后得一个单体化合物—乙酰5-羟色胺，该化合物为无色无定形粉未，易溶水、甲醇、乙醇。所得的产品的收率为91％，纯度为97.5％。

实施例4：

分别用hrei-ms和核磁共振对实施例1获得的物质结构进行鉴定。

lc-ms检测条件为：采用esi+模式，电压1170v，化合物m/z为218.4103，计算分子式为c12h14n2o2。

核磁共振检测条件为：以d2o为溶剂，四甲基硅烷为内标，bruck500mz进行nmr测定，核磁共振检测结果如表1所示。¹h和¹³c核磁共振数据见表1。

hrei-ms给出分子质量为218.4103，计算分子式为c12h14n2o2，¹h和¹³c核磁共振数据见表1。

表1核桃中乙酰5-羟色胺的¹h和¹³c核磁共振数据

¹h-nmr可见δ7.19(¹h，d,j＝8.5)，7.08(¹h，s),δ6.94(¹h，d,j＝3.0)，δ6.71(¹h，dd,j＝8.5,3.0)，表明苯环上有一个amx系统。δ3.18(²h，t,j＝7.5),δ3.03(²h，t,j＝7.5)为脂肪链上的-ch2-氢信号,δ1.91(³h，s)为甲基氢信号。

从¹³c-nmr可见化合物共有12个碳信号，其中δ180.7为羰基碳信号，δ151.8应为连氧碳信号，δ41.4为一个连氮碳信号。从135dept可见125.3，113.3，113.1，103.5四个-ch碳信号，δ41.4，25.1为-ch2-碳信号，δ24.5为甲基碳信号。可以得出化合物为5-羟色胺类衍生物，并含有一个乙酰基。

通过以上测定分析该化合物的结构如下所示:

实施例5：

利用小鼠水迷宫实验检测乙酰5-羟色胺改善记忆功能，具体步骤如下：

选取3周龄(18g左右)雄性icr小鼠，适应性喂养7d，观察小鼠状态并对小鼠进行标记和分组，空白组(灌生理盐水)共10只，实验组10只。灌胃周期为连续21天，于末次给药30min后进行水迷宫实验。

由表2可知，与空白组相比，乙酰5-羟色胺组试验小鼠第1～2天单日逃避潜伏期无明显差异，第3和第4天单日逃避潜伏期较空白组显著缩短，第5天和第3～5天内平均潜伏期与空白组相比有极显著差异。由表3可知，与空白组相比，乙酰5-羟色胺组目标象限游泳累计时间显著延长，且经过平台区域频次显著增加。综合小鼠定位航行试验和空间探索试验结果表明乙酰5-羟色胺能明显改善小鼠的记忆水平。

实施例6：

利用小鼠跳台实验检测乙酰5-羟色胺改善记忆功能，具体步骤如下：

选取3周龄(18g左右)雄性icr小鼠，适应性喂养7d，观察小鼠状态并对小鼠进行标记和分组，空白组(灌生理盐水)共10只，实验组30只。灌胃周期为连续21天，于末次给药30min后进行跳台测试。

从表4可见，乙酰5-羟色胺组组第一次潜伏期较空白对照组显著缩短，错误次数显著减少，而其余各组均无显著性差异，说明具有改善小鼠记忆的功效。

对比例1：

采用实施例3和4的方法检测5-羟色胺改善记忆功能，所述5-羟色胺的结构式为：

对比例2：

采用实施例3和4的方法检测5，10二-羟色胺改善记忆功能，所述5，10二-羟色胺结构式为：

表2定向航行实验结果

注∶与空白组比较，^*p<0.05；^**p<0.01。

表3空间探索实验结果

注∶与空白组比较，^*p<0.05。

表4小鼠跳台实验结果

注：与空白对照组比较，^*p<0.05；^**p<0.01；^***p<0.001。

由表2-4的对照结果可知，将乙酰5-羟色胺中的乙酰基替换成氨基和羟基，说明采用其它基团的5-羟色胺对小鼠记忆的功效不及采用本发明方法分离的乙酰5-羟色胺。

对比例3：

例：采用实施例1中的方法，将柱中mci层析柱替换成大孔树脂ab-8，其他条件或者参数与实施例1一致。所得产品的收率为53％，纯度为72％。

对比例4：

采用实施例1中的方法，将乙醇浓度调整为5％，其他条件或者参数与实施例1一致。所得产品的收率为31％，纯度为65％。发明人经多次实验证明，乙醇浓度过高或过低对产品收率和纯度都有很大影响。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。