一种提高体外合成mRNA稳定性的方法与流程

本发明涉及mrna合成技术领域，具体涉及一种提高体外合成mrna稳定性的方法。

背景技术：

体外合成mrna主要是以cdna为模板通过体外反转录得到，最常用的是以质粒dna为模板利用rna聚合酶转录合成。目前，主要是采用含rna聚合酶的rna体外转录试剂盒来获得体外合成的mrna，它利用线性化的质粒dna为模板在含有rna聚合酶(t7，t3或sp6)的条件下，以ntp为底物，从启动子下游开始合成与模板dna中一条链互补的mrna，简单快速获得大量的mrna分子。

帽子结构是成熟mrna所应具备的基本组成元件，体外合成mrna的帽子结构可在反应过程中加入，然而研究表明至少1/3体外合成的mrna分子在加入一般的帽子类似物时很容易添加到相反的方向使m7g核苷酸不被识别为帽子结构而被作为转录的第一个核苷酸，使mrna缺少甲基化的帽子结构而不能被帽子结合蛋白真核起始因子(eif4e)不能识别翻译。成熟mrna必须具备polya尾，ploya尾巴对mrna的稳定性也起着非常重要的作用。研究表明polya尾少于68个碱基时，多聚核糖体的形成效率随着polya尾长度的增加不断增强，然而也并不是polya尾长度越长蛋白的表达效率就越高，有研究表明体外合成的mrna转染umr-106细胞时，polya尾少于60个碱基时蛋白的表达效率会随着polya尾长度的增加而增加，进一步的增加polya尾的长度反而会降低蛋白的表达效率。哺乳动物mrna不仅含有a、t、g、c四种碱基，也含有如5-甲基胞嘧啶、假尿嘧啶这类修饰碱基。碱基修饰可降低激活2’,5’-寡聚腺苷酸合成酶的活性，减慢rna酶的剪切作用。体外合成mrna在核酸疫苗的制备、基因治疗等领域有广阔的临床运用前景，但稳定性差。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是克服上述缺陷，提供一种提高体外合成mrna稳定性的方法，通过对体外合成的mrna分子的帽子结构、polya尾以及合成碱基等方面的研究，大大提高了体外合成mrna在细胞和动物体内的作用时间。

为了解决上述技术问题，本发明的技术方案为：

一种提高体外合成mrna稳定性的方法，以luciferasemrna合成模板质粒为模板分别进行pcr加尾、帽子结构类似物修饰、碱基类似物修饰后，再用megascriptt7试剂盒按说明书在t7rna聚合酶的作用下合成mrna。

优选的，具体方法包括如下步骤：

(1)以luciferasemrna合成模板质粒为模板进行pcr加尾，分别合成带20/60/120个t碱基的tailpcr反向引物；

(2)以步骤(1)得到的含120个t碱基的的luciferasepcr产物为模板，进行arca修饰和碱基类似物修饰体外合成mrna，具体合成体系如下：

优选的，所述tailpcr反向引物为：tailpcrf:ttggacctcgtacagaagctaatacg，tailpcrr:t20/60/120cttcctactcaggctttttcaaagacca。

优选的，步骤(1)所述pcr加尾的具体反应体系如下：

优选的，所述反应条件为：95℃反应5min，设置分别在95℃反应30s、58℃反应30s，72℃反应1.5min，然后按照95℃、58℃、72℃反应条件循环反应30次后，在72℃反应10min，得到带20/60/120个t碱基的tailpcr反向引物。

与现有技术相比本发明的有益效果是：

本发明通过对polya尾长短、帽子类似物以及碱基类似物对体外合成mrna翻译效率和稳定性的研究发现，通过这一系列的修饰可以提高体外合成mrna在细胞内的翻译效率、延长表达时间。

附图说明

图1为luciferasemrna体外合成模板的构建及合成示意图；

图2为含不同长度polya尾的体外合成luciferasemrna在细胞中的表达；

图3为帽子类似物对体外合成luciferasemrna在细胞中表达的影响；

图4为碱基类似物对体外合成luciferasemrna在细胞中表达的影响。

具体实施方式

下面对本发明的具体实施方式作结合附图进一步说明。在此需要说明的是，对于这些实施方式的说明用于帮助理解本发明，但并不构成对本发明的限定。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。

实施例1

一种提高体外合成mrna稳定性的方法，包括如下步骤：

(1)构建luciferasemrna合成模板质粒：以质粒ef1-gfp-t2a-luciferaseminicircledna为模板通过pcr扩增编码luciferase的序列，扩增编码luciferase序列的引物为：正向引物，5’-cgcggatccgccaccatggaagatgccaaaaacattaag-3’反向引物，5’-ccgctcgagttacacggcgatcttgccgccc-3’；pcr反应条件为：95℃反应5min后，95℃10s，56℃30s，72℃1min条件下反应30个循环，72℃延长10min，pcr产物和pcdna3.4质粒分别经过bamhi和xhoi酶切，胶回收，t4连接酶连接，转入大肠杆菌dh5α中并筛选重组子，重组质粒由双酶切、pcr及测序鉴定，得到luciferasemrna合成模板质粒；

(2)以luciferasemrna合成模板质粒为模板进行pcr加尾，分别合成带20/60/120个t碱基的tailpcr反向引物；其中tailpcr反向引物为：tailpcrf:ttggacctcgtacagaagctaatacg，tailpcrr:t20/60/120cttcctactcaggctttttcaaagacca；具体反应体系如下：

反应条件为：95℃反应5min，设置分别在95℃反应30s、58℃反应30s，72℃反应1.5min，然后按照95℃、58℃、72℃反应条件循环反应30次后，在72℃反应10min，得到带20/60/120个t碱基的tailpcr反向引物；

(3)以步骤(1)得到的含120个t碱基的luciferasepcr产物为模板体外合成mrna，具体合成体系如下：

对比例1

一种体外合成mrna的方法，包括如下步骤：

(1)以luciferasemrna合成模板质粒为模板进行pcr加尾，分别合成带20/60/120个t碱基的tailpcr反向引物；其中tailpcr反向引物为：tailpcrf:ttggacctcgtacagaagctaatacg，tailpcrr:t20/60/120cttcctactcaggctttttcaaagacca；具体反应体系如下：

反应条件为：95℃反应5min，设置分别在95℃反应30s、58℃反应30s，72℃反应1.5min，然后按照95℃、58℃、72℃反应条件循环反应30次后，在72℃反应10min，得到带20/60/120个t碱基的tailpcr反向引物；

(2)按megascriptt7kit的说明书体外合成含不同长度polya尾的luciferasemrna，具体的合成体系如下：

按上表依次加入各组分，37℃水浴孵育5h，然后再加入2μl碱性磷酸酶，37℃反应1h。

对比例2

一种体外合成mrna的方法，包括如下步骤：

(1)以luciferasemrna合成模板质粒为模板进行pcr加尾，分别合成带20/60/120个t碱基的tailpcr反向引物；其中tailpcr反向引物为：tailpcrf:ttggacctcgtacagaagctaatacg，tailpcrr:t20/60/120cttcctactcaggctttttcaaagacca；具体反应体系如下：

反应条件为：95℃反应5min，设置分别在95℃反应30s、58℃反应30s，72℃反应1.5min，然后按照95℃、58℃、72℃反应条件循环反应30次后，在72℃反应10min，得到带20/60/120个t碱基的tailpcr反向引物；

(2)以含120个t碱基的luciferasepcr产物为模板体外合成mrna，具体合成体系如下：

对比例3

以含120个t碱基的luciferasepcr产物为模板体外合成mrna，具体合成体系如下：

对比例4

以含120个t碱基的luciferasepcr产物为模板体外合成mrna，具体合成体系如下：

试验结果：

1.体外合成mrna的纯化

采用megacleartmkit对实施例1、对比例1、对比例2、对比例3、对比例4的体外合成的mrna分别进行纯化，具体的实验操作步骤如下：

(1)向体外合成的mrna产物中加入洗脱液至总体积为100μl，用枪头轻轻吹打混匀；再加入350μl结合液，吹打混匀，加入250μl无水乙醇轻轻混匀后，室温放置3min；

(2)将上述混合液转移到带离心柱的离心管中，室温放置2-5min，13000rpm离心1min，将离心得到的废液弃掉，向离心柱中加入500μl漂洗液，放入离心机中13000rpm离心1min；

(3)重复上一个步骤，离心弃去废液，空柱离心管在13000rpm下离心2min，去除残留的酒精，敞开盖子室温放置3-5min，让酒精完全挥发；

(4)将60μlddh2o加入到离心柱膜中央，放入65-70℃加热块中孵育5-10min，13000rpm离心2min洗脱mrna，离心得到的溶液即为纯化的mrna。

(5)将纯化得到的体外合成mrna分装，并于-20℃保存。

2.体外合成mrna的转染

采用transit-mrna试剂对实施例1、对比例1、对比例2、对比例3、对比例4体外合成的luciferasemrna进行转染，具体步骤如下：

(1)将293细胞消化、离心、计数，用新鲜的完全培养液将细胞重悬，且将细胞的密度调整为1×10⁵/ml；

(2)在12孔板中每孔1ml细胞悬液，放入37℃，5％co2培养箱中培养；次日观察细胞状态，转染前更换新鲜培养液；

(3)在100μlopti-mem优化培养基中加入1μgluciferasemrna，再依次加入1μltransit-mrna和1μlboostreagent，轻轻混匀，室温放置2-5min；

(4)将混合物加入细胞培养液中，轻轻摇匀，37℃、5％co2培养箱中培养；

(6)在转染后的不同时间点加入荧光素酶底物在小动物活体成像仪中观察细胞中荧光素酶的表达。

将对比例1体外合成分别含有20、60、120个t碱基的luciferasemrna转染细胞后，1天、2天、3天小动物活体成像仪下观察细胞内荧光素酶的表达情况，分析细胞内荧光素酶的表达情况，发现随着polya尾的加长luciferasemrna在细胞中翻译表达的效率提高，表达时间延长，具体结果如图2所示。

将对比例1和对比例2的luciferasemrna转染细胞，1天、2天、3天小动物活体成像仪下观察细胞内荧光素酶的表达情况，分析细胞内荧光素酶的表达情况发现对比例2经帽子类似物修饰的luciferasemrna在细胞中翻译表达的效率提高，表达时间延长，具体结果如图3所示。

将实施例1、对比例3、对比例4的luciferasemrna转染细胞，1天、2天、3天小动物活体成像仪下观察细胞内荧光素酶的表达情况，分析细胞内荧光素酶的表达情况发现经碱基类似物修饰的luciferasemrna在细胞中翻译表达的效率提高，表达时间延长，具体结果如图4所示。

以上为本发明较佳实施例，只适用于帮助理解本发明实施例的原理；同时，对于本领域的一般技术人员，依据本实施例，在具体实施方式以及应用范围上均会有改变之处，综上所述，本说明书内容不应理解为对本发明的限制。