一种基于RPA快速检测南方水稻黑条矮缩病毒的方法与流程

本发明涉及植物保护领域，具体涉及一种基于rpa快速检测南方水稻黑条矮缩病毒的方法。
背景技术：
：南方水稻黑条矮缩病毒(southernriceblack-streakeddwarfvirus，srbsdv)隶属于呼肠孤病毒科(reoviridae)斐济病毒属(fijivirus)第2组的一个新种，通过白背飞虱进行持久型传播。该病毒不仅导致水稻黑条矮缩病，还可侵染玉米导致粗缩病并造成严重产量损失。水稻、玉米、小麦、大麦及其它多种禾本科杂草是其主要天然寄主。病毒侵染植物后都被限制在韧皮部。感病稻株严重矮化，不能拔节，叶片颜色浓绿，叶尖卷曲，拔节期的病株茎节部有倒生气生须根及高节位分蘖，病株茎秆出现条状乳白色或深褐色瘤状突起。感病植株的根系生长也受到影响，须根少而短，感病严重时根系呈黄褐色。近年来该病毒蔓延之势迅猛，在我国华南、西南等稻区流行和危害，给我国南方广大稻区安全生产构成了严重威胁。随着现代分子生物学技术的不断发展，各种基于pcr的分子检测技术由于具有灵敏、快速及特异等特点，被学者们广泛应用于病原物检测和植物病害鉴定领域。目前检测srbsdv病毒的主要采用rt－qpcr方法，该方法通过检测病毒的核酸来证实植物病毒的存在，有着极高的灵敏度与极强的特异性，检测速度相比血清学检测法较快。但pcr方法对精密仪器的依赖性较高，需要昂贵的实验仪器如pcr热循环完成预变性、变性、退火及延伸等步骤，整个过程耗费时间长，成本高昂，不能满足经济高效检测的需求。因此摆脱精密仪器对分子检测的限制，快速、灵敏地检测该病毒对于病害防治至关重要。近年来，等温核酸扩增技术的发展解决了传统pcr方法的局限性。重组酶聚合酶扩增(recombinasepolymeraseamplification，rpa)技术即是一项由多种酶和蛋白参与，在恒定温度条件下实现核酸指数扩增的新技术，具有反应灵敏、高效、特异和操作简便的特点。目前rpa技术已经在医疗诊断、食品致病菌和转基因农作物等检测分析以及生物安全方面崭露头角，但用于植物病毒检测的报道较少。srbsdv的发生与流行给我国南方广大稻区安全生产构成了严重威胁，因此建立成熟的快速，简便、高效的早期srbsdv检测技术已迫在眉睫。技术实现要素：本发明的目的是提供一种基于rpa快速检测南方水稻黑条矮缩病毒的方法。本发明首先保护引物对，由引物srbsdv-f和引物srbsdv-r组成；所述引物srbsdv-f为如下(a1)或(a2)：(a1)序列表的序列1所示的单链dna分子；(a2)将序列1经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列1具有相同功能的dna分子；所述引物srbsdv-r为如下(a3)或(a4)：(a3)序列表的序列2所示的单链dna分子；(a4)将序列2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列2具有相同功能的dna分子。所述引物srbsdv-f根据编码链设计；所述引物srbsdv-r根据互补链设计。所述引物对的用途为如下(b1)或(b2)或(b3)或(b4):(b1)鉴定或辅助鉴定待测病毒是否为南方水稻黑条矮缩病毒；(b2)制备用于鉴定或辅助鉴定待测病毒是否为南方水稻黑条矮缩病毒的试剂盒；(b3)检测待测生物样本中是否含有南方水稻黑条矮缩病毒；(b4)制备用于检测待测生物样本中是否含有南方水稻黑条矮缩病毒的试剂盒。本发明还保护所述引物对的应用，为如下(b1)或(b2)或(b3)或(b4):(b1)鉴定或辅助鉴定待测病毒是否为南方水稻黑条矮缩病毒；(b2)制备用于鉴定或辅助鉴定待测病毒是否为南方水稻黑条矮缩病毒的试剂盒；(b3)检测待测生物样本中是否含有南方水稻黑条矮缩病毒；(b4)制备用于检测待测生物样本中是否含有南方水稻黑条矮缩病毒的试剂盒。本发明还保护含有所述引物对的试剂盒；所述试剂盒的用途为如下(c1)或(c2)：(c1)鉴定或辅助鉴定待测病毒是否为南方水稻黑条矮缩病毒；(c2)检测待测生物样本中是否含有南方水稻黑条矮缩病毒。本发明还保护所述试剂盒的制备方法，包括将各条引物单独包装的步骤。本发明还保护一种鉴定或辅助鉴定待测病毒是否为南方水稻黑条矮缩病毒的方法，包括如下步骤：(1)提取待测病毒的总rna，并反转录为cdna；(2)以步骤(1)提取的cdna为模板，采用所述引物对进行重组酶聚合酶扩增，如果pcr扩增产物中含有152bp±5bp的dna片段、待测病毒为或候选为南方水稻黑条矮缩病毒，如果pcr扩增产物中不含有152bp±5bp的dna片段、待测病毒为或候选为非南方水稻黑条矮缩病毒。本发明还保护一种鉴定或辅助鉴定待测病毒是否为南方水稻黑条矮缩病毒的方法，包括如下步骤：(1)提取待测病毒的总rna，并反转录为cdna；(2)检测步骤(1)得到的cdna中是否含有特异dna片段，如果含有特异dna片段、待测病毒为或候选为南方水稻黑条矮缩病毒，如果不含有特异dna片段、待测病毒为或候选为非南方水稻黑条矮缩病毒；所述特异dna片段为南方水稻黑条矮缩病毒的cdna中所述的引物对的靶序列。本发明还保护一种检测待测生物样本中是否含有南方水稻黑条矮缩病毒的方法，包括如下步骤：(1)提取待测生物样本的总rna，并反转录为cdna；(2)以步骤(1)提取的cdna为模板，采用所述引物对进行重组酶聚合酶扩增，如果pcr扩增产物中含有152bp±5bp的dna片段、待测生物样本中含有或疑似含有南方水稻黑条矮缩病毒，如果pcr扩增产物中不含有152bp±5bp的dna片段、待测生物样本中不含有或疑似不含有南方水稻黑条矮缩病毒。本发明还保护一种检测待测生物样本中是否含有南方水稻黑条矮缩病毒的方法，包括如下步骤：(1)提取待测生物样本的总rna，并反转录为cdna；(2)检测步骤(1)得到的cdna中是否含有特异dna片段，如果含有特异dna片段、待测生物样本中含有或疑似含有南方水稻黑条矮缩病毒，如果不含有特异dna片段、待测生物样本中不含有或疑似不含有南方水稻黑条矮缩病毒；所述特异dna片段为南方水稻黑条矮缩病毒的cdna中所述引物对的靶序列。以上任一所述重组酶聚合酶扩增的方法具体可为如下所示：(1)向1.5ml离心管中依次加入ddh2o12.2μl、干粉溶解缓冲液(rehydrationbuffer)29.5μl、引物srbsdv-f溶液、引物srbsdv-r溶液各2.4μl、模板cdna溶液1μl。引物srbsdv-f溶液中引物srbsdv-f的浓度为10μmol/l，引物srbsdv-r溶液中引物srbsdv-r的浓度为10μmol/l。(2)将(1)配置的再水合溶液转移至冻干basic反应微球中，吹打混匀直到整个微球重悬，加入2.5μl280mm醋酸镁(mgoac)并充分混匀，得到反应体系。将反应体系置于39℃的金属浴上反应20min。以上任一所述152bp±5bp的dna片段具体可为152bp的dna片段。以上任一所述待测病毒具体可为南方水稻黑条矮缩病毒(srbsdv)、水稻黑条矮缩病毒(rbsdv)、玉米褪绿斑驳病毒(mcmv)、甘蔗花叶病毒(scmv)、黄瓜花叶病毒(cmv)、雀麦花叶病毒(bmv)和玉米黄矮病毒(mydv)。以上任一所述待测生物样本具体可为生物组织，更具体可为玉米或水稻组织。与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明无需依赖于精密实验仪器，操作方法简单，灵敏度高，可用于南方水稻黑条矮缩病毒的早期快速检测。本发明中的rpa引物可有效扩增靶基因，具有高度的特异性，灵敏度更高，可以实现该病毒的早期快速检测，对于防控该病毒的发生与流行具有重要意义。附图说明图1为利用特异引物对对南方水稻黑条矮缩病毒进行特异性筛查的琼脂糖凝胶电泳图。其中m为分子量标记(marker)dl2000，1-9依次对应南方水稻黑条矮缩病毒相关材料、水稻黑条矮缩病毒相关材料、玉米褪绿斑驳病毒相关材料、甘蔗花叶病毒相关材料、黄瓜花叶病毒相关材料、雀麦花叶病毒相关材料、玉米黄矮病毒相关材料、健康叶片相关材料及阴性对照的扩增产物。图2为利用特异引物对对南方水稻黑条矮缩病毒进行灵敏度筛查的琼脂糖凝胶电泳图。其中m为分子量标记(marker)dl2000，1-8依次对应100、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6共7个稀释度cdna以及阴性对照的扩增产物。具体实施方式以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。实施例中提及的感染南方水稻黑条矮缩病毒(srbsdv)的玉米叶片提取的总rna均为南方水稻黑条矮缩病毒(srbsdv)在玉米上的分离物jni4提取的总rna。jni4及提取jni4总rna的方法均记载于文献：yinx,xuff,zhengfq,etal.molecularcharacterizationofsegmentss7tos10ofasouthernriceblack-streakeddwarfvirusisolatefrommaizeinnorthernchina[j].virologicasinica,2011,26(1):47-53.；相关材料公众也可以从中国农业大学获得。实施例中提及的水稻黑条矮缩病毒(rbsdv)、水稻黑条矮缩病毒(rbsdv)感染的玉米叶片及感染采用水稻黑条矮缩病毒(rbsdv)感染玉米叶片并提取感染水稻黑条矮缩病毒(rbsdv)的玉米叶片的总rna的方法均记载于文献：chenl,jiaoz,liud,etal.one-stepreversetranscriptionloop-mediatedisothermalamplificationforthedetectionofmaizechloroticmottlevirusinmaize[j].journalofvirologicalmethods,2017,240:49-53.；相关材料公众也可以从中国农业大学获得。实施例中提及的玉米褪绿斑驳病毒(mcmv)、玉米褪绿斑驳病毒(mcmv)感染的玉米叶片及采用玉米褪绿斑驳病毒(mcmv)感染玉米叶片并提取感染玉米褪绿斑驳病毒(mcmv)的玉米叶片的总rna的方法均记载于文献：chenl,jiaoz,liud,etal.one-stepreversetranscriptionloop-mediatedisothermalamplificationforthedetectionofmaizechloroticmottlevirusinmaize[j].journalofvirologicalmethods,2017,240:49-53.；相关材料公众也可以从中国农业大学获得。实施例中提及的甘蔗花叶病毒(scmv)、甘蔗花叶病毒(scmv)感染的玉米叶片及采用甘蔗花叶病毒(scmv)感染玉米叶片并提取感染甘蔗花叶病毒(scmv)的玉米叶片的总rna的方法均记载于文献：chenl,jiaoz,liud,etal.one-stepreversetranscriptionloop-mediatedisothermalamplificationforthedetectionofmaizechloroticmottlevirusinmaize[j].journalofvirologicalmethods,2017,240:49-53.；相关材料公众可以从中国农业大学获得。实施例中提及的感染黄瓜花叶病毒(cmv)的玉米叶片均为采用黄瓜花叶病毒株zmbj-cmv接种玉米叶片后得到的感染黄瓜花叶病毒(cmv)的玉米叶片。zmbj-cmv、感染zmbj-cmv的玉米叶片及采用zmbj-cmv感染玉米叶片并提取感染zmbj-cmv的玉米叶片的总rna的方法均记载于文献：wangr,yangx,wangn,etal.anefficientvirus-inducedgenesilencingvectorformaizefunctionalgenomicsresearch[j].plantjournal,2016,86(1):102-115.；相关材料公众可以从中国农业大学获得。实施例中提及的感染雀麦花叶病毒(bmv)的玉米叶片均为使用bmv-vigs接种玉米叶片得到的感染雀麦花叶病毒(bmv)的玉米叶片。bmv-vigs、感染bmv-vigs的玉米叶片及采用bmv-vigs感染玉米叶片并提取感染bmv-vigs的玉米叶片的总rna的方法均记载于文献：朱敏.玉米elonginc蛋白与甘蔗花叶病毒vpg的分子互作研究[d].中国农业大学,2014.；相关材料公众可以从中国农业大学获得。实施例中提及的感染玉米黄矮病毒(mydv)为提取自玉米叶片的玉米黄矮病毒mydv-rmv2，记载于文献：wangf,zhaox,dongq,etal.characterizationofanrnasilencingsuppressorencodedbymaizeyellowdwarfvirus-rmv2[j].virusgenes,2018.；相关材料公众可以从中国农业大学获得。实施例中提及的健康玉米叶片(healthymaizeleaves)及健康玉米叶片(healthymaizeleaves)提取总dna的方法均记载于文献：chenl,jiaoz,liud,etal.one-stepreversetranscriptionloop-mediatedisothermalamplificationforthedetectionofmaizechloroticmottlevirusinmaize[j].journalofvirologicalmethods,2017,240:49-53.；相关材料公众可以从中国农业大学获得。实施例1、南方水稻黑条矮缩病毒的rpa检测核苷酸引物组合筛选一、引物设计1.进行大量序列分析、比对获得了用于检测南方水稻黑条矮缩病毒的9条引物(如表1所示)。表1用于检测srbsdv的rpa引物序列引物名称引物序列(5'-3')srbsdv-f1agatgaagatcaagatgagtacgaactagcsrbsdv-f2gatcaagatgagtacgaactagctggactgsrbsdv-f3agatcaagatgagtacgaactagctggactgtsrbsdv-f4gaagatcaagatgagtacgaactagctggactgsrbsdv-f5atcaagatgagtacgaactagctggactgtcsrbsdv-f6aaatgttgtcgtgaagttcctgctcaaatgsrbsdv-r1gtcttacgcaacgatgaacctttctctattsrbsdv-r2cggtcttacgcaacgatgaacctttctctasrbsdv-r3gtctcgaatattggtcgtaaccgccatagt2.将步骤1设计的9条引物组合成6对引物组合(如表2所示)表2rpa引物组合及产物大小编号引物组合产物大小(bp)t1f1r1159t2f2r1152t3f3r2155t4f4r2157t5f5r2153t6f6r3163二、最佳引物组合的筛选1.取感染南方水稻黑条矮缩病毒(srbsdv)的玉米叶片提取的总rna，并反转录为cdna。2.以步骤1得到的cdna为模板，采用表2所示的6种引物组合分别进行rpa反应。rpa反应体系的配置方法如下：(1)配置再水合溶液向1.5ml离心管中依次加入ddh2o12.2μl、干粉溶解缓冲液(rehydrationbuffer)29.5μl、上游引物、下游引物溶液各2.4μl、模板cdna溶液1μl。上游引物溶液中上游引物的浓度为10μmol/l，下游引物溶液中下游引物的浓度为10μmol/l。模板cdna溶液中，cdna的浓度为692.5ng/μl。(2)将(1)配置的再水合溶液转移至冻干basic反应微球中，吹打混匀直到整个微球重悬，加入2.5μl280mm醋酸镁(mgoac)并充分混匀，得到反应体系。上述反应中使用的试剂均来自basic试剂盒(英国twistdx)，试剂用量参照basic试剂盒说明书。将反应体系置于39℃的金属浴上反应20min。同时设置采用健康玉米叶片(healthymaizeleaves)的dna代替感染南方水稻黑条矮缩病毒(srbsdv)的玉米叶片提取的总rna反转录物的阴性对照。3.完成步骤2后，将50μl反应产物与等体积的(tri饱和酚：氯仿＝1:1，体积比)混合，12000rpm室温离心10min，取离心后的上清产物5μl于2％琼脂糖凝胶电泳26min，在凝胶成像系统上观察结果。引物对(f2和r1)的扩增条带最为清晰特异，无杂带，扩增条带大小为152bp，为检测水稻黑条矮缩病毒的最佳pra引物组合。其余引物对扩增效果较差，条带不够清晰且非特异性杂带较多。基于上述结果，得到用于南方水稻黑条矮缩病毒的rpa检测的特异引物对，由引物srbsdv-f和引物srbsdv-r组成；srbsdv-f：5'-gatcaagatgagtacgaactagctggactg-3'(序列1)；srbsdv-r：5'-gtcttacgcaacgatgaacctttctctatt-3'(序列2)。实施例2、特异性1.提取感染水稻黑条矮缩病毒(rbsdv)的玉米叶片、感染玉米褪绿斑驳病毒(mcmv)的玉米叶片、感染甘蔗花叶病毒(scmv)的玉米叶片、感染黄瓜花叶病毒(cmv)的玉米叶片、感染雀麦花叶病毒(bmv)的玉米叶片和玉米黄矮病毒(mydv)的总rna并反转录为cdna。2.提取健康玉米叶片(healthymaizeleaves)的总dna。3.取感染南方水稻黑条矮缩病毒(srbsdv)的玉米叶片提取的总rna，并反转录为cdna。4.取步骤1、2和3获得的cdna或总dna，以所述cdna或总dna为模板，采用引物srbsdv-f和引物srbsdv-r组成的引物对进行rpa反应(反应方法见实施例1中第二部分的步骤2和3)。设置采用ddh20作为模板的阴性对照组。结果如图1所示。结果表明，只有srbsdv病毒对应的rpa扩增产物含有1条大小为152bp的目的条带，感染其它种对照病毒的玉米叶片和阴性对照均无条带，由此证明本发明设计的rpa引物对具有高度特异性。实施例3、灵敏度1.取感染南方水稻黑条矮缩病毒(srbsdv)的玉米叶片提取的总rna，并反转录为cdna(cdna浓度为692.5ng/μl)。2.将步骤1得到的cdna以10倍梯度逐级稀释，分别为100、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6共7个稀释度，对应的浓度分别为692.5ng/μl、69.25ng/μl、6.925ng/μl、6.925×10-1ng/μl、6.925×10-2ng/μl、6.925×10-3ng/μl、6.925×10-4ng/μl。3.以步骤2进行不同梯度稀释的cdna为模板，采用引物srbsdv-f和引物srbsdv-r组成的引物对进行rpa反应(反应方法见实施例1中第二部分的步骤2和3)。设置采用ddh20作为模板的阴性对照组。结果如图2所示。结果表明，本方法的灵敏度为10-3稀释度(10-3稀释度得到的特异条带较浅)，灵敏度浓度为6.925×10-1ng/μl。序列表<110>中国农业大学<120>一种基于rpa快速检测南方水稻黑条矮缩病毒的方法<160>2<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>30<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>1gatcaagatgagtacgaactagctggactg30<210>2<211>30<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>2gtcttacgcaacgatgaacctttctctatt30当前第1页12