一种生物法合成亚精胺的方法与流程

本发明涉及一种生物法合成亚精胺的方法，属于生物工程技术领域。

背景技术：

亚精胺(spermidine)，线性分子式为nh2(ch2)3nh(ch2)4nh2，广泛存在于微生物、植物和动物体内，是一种重要的生理活性物质。亚精胺具有延长动物寿命的功效，并抵消与年龄相关的疾病，如心血管疾病，神经退行性疾病和癌症等。

如图1所示，生物体中主要有两条途径合成亚精胺(1)经由羧基化腺苷甲硫氨酸和腐胺在亚精胺合成酶的作用下直接合成亚精胺，羧基化腺苷甲硫氨酸可由甲硫氨酸(met)，经过相关酶的腺苷化和脱羧化催化得到，该途径在动物、植物和微生物体内，是比较常见的传统亚精胺合成的途径；(2)经由天冬氨酸-β-半醛和腐胺在羧基亚精胺脱氢酶和脱羧酶的催化下合成亚精胺，天冬氨酸-β-半醛可经常见氨基酸如天冬氨酸(asp)经相关酶的磷酸化和脱氢化催化合成，该途径为新发现的替代合成途径，主要存在于一些细菌中，包括重要的人类病原体，肠道菌群等。两条途径都涉及到重要的中间体-腐胺(put)，腐胺可由常见的氨基酸-鸟氨酸(orn)或精氨酸(arg)经过相关酶催化合成得到，在亚精胺的合成过程中，是重要的中间底物。由于这些途径中的酶受到高度调控，动植物体的亚精胺含量较低，目前也未发现可以大量生产亚精胺的微生物。

技术实现要素：

[技术问题]

本发明要解决的技术问题是利用生物法合成亚精胺，尤其是构建多酶共表达的基因工程菌，利用基因工程菌合成亚精胺，实现亚精胺的高效生产。

[技术方案]

本发明提供了一种生物法合成亚精胺的方法，是以高丝氨酸和腐胺(丁二胺)为底物合成亚精胺，利用高丝氨酸脱氢酶将高丝氨酸脱氢生成天冬半醛和nadh，羧基亚精胺脱氢酶以nadh为辅酶将天冬半醛和腐胺合成为羧基亚精胺，并实现辅酶再生生成nad，最后，羧基亚精胺脱羧酶将羧基亚精胺脱羧生成亚精胺。

所述高丝氨酸脱氢酶可以来自于rhizobiumleguminosarumatcc14479、burkholderiacepaciaatcc25416、pseudomonasfluorescensncimb11764、streptomycesgriseoruberdsm40281、lactobacillusfermentumatcc14931、enterococcusfaecalisatcc29212、rhodobactersphaeroidesatccbaa-808或clostridiumsymbiosumatcc14940。所述高丝氨酸脱氢酶的氨基酸序列可以是ncbi上accessionno.为wp_047622250.1、aio28186.1、akv10834.1、kun83774.1、eei22323.1、ail05261.1、yp_353478.1或eri80758.1的序列。编码所述高丝氨酸脱氢酶的基因的核苷酸序列是ncbi上accessionno.为nz_cp030760region:391900..393225、cp007748region:complement(838173..839252)、cp010945region:2419401..2420705、nz_liqs01000442region:17468..18559、acgi01000069region:22921..24087、cp008816region:complement(1218603..1219895)、nc_007493region:2134869..2136155或awsu01000003region:complement(11687..12895)的序列。

所述羧基亚精胺脱氢酶来自于bacilluscoagulansdsm1、clostridiumsp.dsm8431、prevotellabiviadsm20514、ruminococcuscallidusatcc27760、campylobacterjejunisubsp.jejuniatcc700819、porphyromonascatoniaeatcc51270、rhodobactersphaeroidesatccbaa-808或者clostridiumsymbiosumatcc14940。所述羧基亚精胺脱氢酶的氨基酸序列可以是ncbi上accessionno.为ajh78404.1、sfu79043.1、eim32270.1、erj96771.1、yp_002343630.1、ewc93538.1、yp_351518.1或eri79986.1的序列。编码所述羧基亚精胺脱氢酶的基因的核苷酸序列可以是ncbi上accessionno.为cp009709region:2139242..2140441、fpby01000164region:458..1657、jh660660region:573354..574616、awvf01000096region:13704..14912、nc_002163region:complement(167807..169012)、jdff01000004region:complement(69139..70371)、nc_007493region:59748..60986或awsu01000043region:complement(9703..10905)的序列。

所述羧基亚精胺脱羧酶可以来自于bacteroidescellulosilyticusdsm14838、clostridiumsymbiosumatcc14940、campylobacterjejunisubsp.jejuniatcc700819或rhodobactersphaeroidesatccbaa-808。所述羧基亚精胺脱羧酶的氨基酸序列是ncbi上accessionno.为eef87925.1、eri79985.1、yp_002344893.1或yp_351517.1的序列。编码所述羧基亚精胺脱羧酶的基因的核苷酸序列是ncbi上accessionno.为acch01000346region:346..1506、awsu01000043region:complement(8508..9659)、nc_002163region:complement(1450328..1451476)或nc_007493region:58614..59711的序列。

本发明还提供了一种可用于生产亚精胺的重组菌；所述重组菌同时表达3种酶，分别为高丝氨酸脱氢酶(homoserinedehydrogenase)、羧基亚精胺脱羧酶(carboxyspermidinedecarboxylase)、羧基亚精胺脱氢酶(carboxyspermidinedehydrogenase)。

所述重组菌可以选择大肠杆菌为宿主。例如escherichiacolibl21(de3)。

所述3种酶可以在宿主中借助载体进行融合表达或共表达，或者整合到宿主的基因组上进行表达。所述3种酶借助载体进行表达时，可以选择一种载体，利用这一种载体同时表达3种酶；或者，也可以将这3种酶分配到两种或者两种以上的载体中进行组合表达。例如，选择petduet-1、pacycduet-1、prsfduet-1中的一种载体同时表达3种酶，或者，将3种酶分配到petduet-1、pacycduet-1、prsfduet-1中的两种或两种以上进行表达。

在一种实施方式中，本发明提供了可用于生产亚精胺的重组大肠杆菌，是使用petduet-1、pacycduet-1、prsfduet-1中的一种载体同时表达3种酶。例如，escherichiacolibl21(de3)/petduet-1-bchsdh-pccsdh-cjcsdc，escherichiacolibl21(de3)/pacycduet-1-bchsdh-pccsdh-cjcsdc、escherichiacolibl21(de3)/prsfduet-1-bchsdh-pccsdh-bscsdc、escherichiacolibl21(de3)/petduet-1-rlhsdh-cscsdh-cjcsdc、escherichiacolibl21(de3)/petduet-1-efhsdh-cjcsdh-cjcsdc、escherichiacolibl21(de3)/petduet-1-rshsdh-cccsdh-cjcsdc。

在一种实施方式中，本发明提供了可用于生产亚精胺的重组大肠杆菌，是将这3种酶分配到两种或者两种以上的载体中进行组合表达。例如：escherichiacolibl21(de3)/petduet-1-bchsdh-pccsdh+pacycduet-1-bscsdc、escherichiacolibl21(de3)/petduet-1-bchsdh-pccsdh+pacycduet-1-cscsdc、escherichiacolibl21(de3)/petduet-1-bchsdh-pccsdh+pacycduet-1-cjcsdc、escherichiacolibl21(de3)/petduet-1-bchsdh-pccsdh+pacycduet-1-rscsdc、escherichiacolibl21(de3)/pacycduet-1-bchsdh-pccsdh+petduet-1-bscsdc、escherichiacolibl21(de3)/petduet-1-bchsdh-cjcsdc+pacycduet-1-pccsdh、escherichiacolibl21(de3)/petduet-1-cjcsdc-pccsdh+pacycduet-1-bchsdh

在一种实施方式中，本发明还提供了一种全细胞催化生产亚精胺的方法，是利用本发明构建的重组菌为全细胞催化剂，转化体系为：细胞湿重1-200g/l，腐胺1-100g/l，高丝氨酸1-100g/l，nad0-1g/l，ph5.0-9.0，温度15-40℃，转化时间1-48小时。所述全细胞催化剂的制备，是培养、繁殖重组细胞，并使得重组细胞表达所述3种酶，然后收集重组细胞。使用所述全细胞催化剂时，除了提供底物，还需要维持适当的温度和ph，必要时还提供一些辅酶或者营养物质，以帮助全细胞催化剂更好地发挥催化作用。

[有益效果]

本发明构建了一种生物合成亚精胺的途径，并实现了这种途径在微生物中的高效表达。进一步利用三酶共表达基因工程菌来生产亚精胺。

本发明选择的高丝氨酸脱氢酶和羧基亚精胺脱氢酶均具有能高效使用nad(nadh)为辅酶进行反应的特点。

本发明提供的生物合成亚精胺的方法，生产过程简单且原料易得成本低，具有良好的工业化应用前景。

附图说明

图1两种现有的合成亚精胺的途径

具体实施方式

1、本发明所涉及的菌株及质粒

购自美国菌种保藏中心atcc的rhizobiumleguminosarumatcc14479、burkholderiacepaciaatcc25416、lactobacillusfermentumatcc14931、enterococcusfaecalisatcc29212、ruminococcuscallidusatcc27760、campylobacterjejunisubsp.jejuniatcc700819、porphyromonascatoniaeatcc51270、rhodobactersphaeroidesatccbaa-808、clostridiumsymbiosumatcc14940。streptomycesgriseoruberdsm40281、bacteroidescellulosilyticusdsm14838、bacilluscoagulansdsm1、clostridiumsp.dsm8431、prevotellabiviadsm20514购自德国微生物菌种保藏中心dsmz。pseudomonasfluorescensncimb11764购自英国ncimb菌种保藏中心。

购自novagen公司的petduet-1、pacycdue-1、pcoladuet-1、prsfduet-1质粒和escherichiacolibl21(de3)。pcasred、pcrispr-gdna购自镇江爱必梦生物科技有限公司。

2、样品的检测分析

亚精胺、羧基亚精胺含量的测定方法根据文献进行(analternativepolyaminebiosyntheticpathwayiswidespreadinbacteriaandessentialforbiofilmformationinvibriocholerae，jbiolchem.2009apr10；284(15):9899–9907.)。

高丝氨酸脱氢酶和羧基亚精胺脱氢酶活力采用经典的nadh生成或减少的方法进(thekineticsandmechanismofliveralcoholdehydrogenasewithprimaryandsecondaryalcoholsassubstrates.biochemicaljournal1966,100:34.)。比酶活(umg^-1)定义为每mg酶所具有的酶活力单位，一个酶活力单位(u)定义为1min生成或减少1μmolnadh所需的酶量。

高丝氨酸脱氢酶活力根据文献以nad为辅酶进行(crystalstructuresofahyperthermophilicarchaealhomoserinedehydrogenasesuggestanovelcofactorbindingmodeforoxidoreductases，scirep.2015；5:11674.)。

羧基亚精胺脱氢酶活力测定：3ml反应体积中腐胺1mm、天冬半醛1mm、nadh0.12mm、ph8、温度35℃，340nm测定nadh的减少速率。

羧基亚精胺脱羧酶活力测定：于3ml反应体系中含有5mm羧基亚精胺，50mm磷酸缓冲液(ph8.0)，2mm二硫苏糖醇和50μmmplp，37℃水浴30min后，加入1ml10％三氯乙酸终止反应，离心(8000rpm/min)5min后，hplc分析亚精胺的生成量。比酶活表示为每分钟每mg酶形成的亚精胺μ形成的。一个酶活力单位(u)定义为1min减少1μmolnadh所需的酶量。

实施例1：高丝氨酸脱氢酶的筛选

高丝氨酸脱氢酶广泛存在多种微生物中，目前文献报道的主要是以nadph(nadp)为辅酶，并趋向将天冬半醛还原为高丝氨酸。通常菌体内的nad比nadp更多，而且nad价格更为便宜。本实施例首先从多个菌株中筛选能以nad为辅酶将高丝氨酸高效氧化生成天冬半醛的高丝氨酸脱氢酶。

分别从rhizobiumleguminosarumatcc14479、burkholderiacepaciaatcc25416、pseudomonasfluorescensncimb11764、streptomycesgriseoruberdsm40281、lactobacillusfermentumatcc14931、enterococcusfaecalisatcc29212、rhodobactersphaeroidesatccbaa-808、clostridiumsymbiosumatcc14940克隆得到高丝氨酸脱氢酶基因rlhsdh、bchsdh、pfhsdh、sghsdh、lfhsdh、efhsdh、rshsdh、cshsdh。这些基因编码的酶的氨基酸序列在ncbi上accessionno为wp_047622250.1、aio28186.1、akv10834.1、kun83774.1、eei22323.1、ail05261.1、yp_353478.1、eri80758.1。

将克隆得到的基因分别连接到petduet-1载体上，并在escherichiacolibl21(de3)中诱导表达。诱导表达方法：将重组大肠杆菌按体积比为2％的量转接到lb发酵培养基(蛋白胨10g/l、酵母粉5g/l、nacl10g/l)中，当细胞od600达到0.6-0.8后，加入终浓度为0.4mm的iptg，在20℃诱导表达培养8h。诱导表达结束后，4℃、8000rpm、20分钟离心收集细胞。破胞后利用his-tag标签法纯化酶，得到纯酶后测定活性。当以高丝氨酸为底物，nad为辅酶时，高丝氨酸脱氢酶基因rlhsdh、bchsdh、pfhsdh、sghsdh、lfhsdh、efhsdh、rshsdh、cshsdh各自表达的酶的比酶活分别为：3.5、37.3、21.2、4.8、2.1、23.2、36.1、11.1u/mg。

实施例2：羧基亚精胺脱氢酶的筛选

羧基亚精胺脱氢酶广泛存在多种微生物中，通常以nadph(nadp)为辅酶。通常菌体内的nad比nadp更多，而且nad价格更为便宜。本实施例通过比较多种来源的羧基亚精胺脱氢酶筛选得到以nadh(nad)为辅酶的羧基亚精胺脱氢酶，能够用于合成羧基亚精胺。

分别从bacilluscoagulansdsm1、clostridiumsp.dsm8431、prevotellabiviadsm20514、ruminococcuscallidusatcc27760、campylobacterjejunisubsp.jejuniatcc700819、porphyromonascatoniaeatcc51270、rhodobactersphaeroidesatccbaa-808、clostridiumsymbiosumatcc14940克隆得到羧基亚精胺脱氢酶基因bccsdh、cccsdh、pbcsdh、rccsdh、cjcsdh、pccsdh、rscsdh、cscsdh。这些基因编码的酶的氨基酸序列在ncbi上accessionno为ajh78404.1、sfu79043.1、eim32270.1、erj96771.1、yp_002343630.1、ewc93538.1、yp_351518.1、eri79986.1。

将克隆得到的基因分别连接到petduet-1载体上，采用与实施例1同样的方法表达纯化羧基亚精胺脱氢酶。以腐胺和天冬半醛为底物，nadh为辅酶测定酶的活力，羧基亚精胺脱氢酶基因bccsdh、cccsdh、pbcsdh、rccsdh、cjcsdh、pccsdh、rscsdh、cscsdh各自表达的酶的比酶活分别为：1.3、13.2、34.1、1.2、22.6、47.8、36.2、24.3u/mg。

实施例3：羧基亚精胺脱羧酶的选择

羧基亚精胺脱羧酶广泛存在多种微生物中，本实施例分别从bacteroidescellulosilyticusdsm14838、clostridiumsymbiosumatcc14940、campylobacterjejunisubsp.jejuniatcc700819、rhodobactersphaeroidesatccbaa-808中得到羧基亚精胺脱羧酶基因，羧基亚精胺脱羧酶用于将羧基亚精胺生成亚精胺。基因bccsdc、cscsdc、cjcsdc、rscsdc编码的酶的氨基酸序列分别是eef87925.1、氨基酸序列是eri79985.1、yp_002344893.1、yp_351517.1。采用与实施例1同样的方法表达纯化羧基亚精胺脱羧酶。以羧基亚精胺为底物测定酶的活力，羧基亚精胺脱羧酶基因bccsdc、cscsdc、cjcsdc、rscsdc各自表达的酶的比活力分别为78.2，64.1，67.4，76.3u/mg。

实施例4：应用三种酶体外合成亚精胺

将bchsdh、pccsdh、cjcsdc三个基因分别连接到pedtduet-1载体上，采用与实施例1同样的方法表达纯化后得到三种纯酶。然后于100ml反应体系中加入这3种纯酶各1mg，腐胺10g/l，高丝氨酸10g/l，nad1g/l，ph8.0于35℃反应，时间1小时。转化结束后，利用液相色谱测定反应液中亚精胺的浓度为13.4g/l。

实施例5:重组大肠杆菌的构建

首先从实施例1和2中选择编码高活性的高丝氨酸脱氢酶和羧基亚精胺脱氢酶基因，参照表1，将这两种基因以及编码羧基亚精胺脱羧酶的基因与petduet-1、pacycduet-1、prsfduet-1质粒中一种或多种连接构建重组表达载体。得到三基因共表达重组质粒(单质粒或双质粒)，将重组质粒转化大肠杆菌escherichiacolibl21，利用氯霉素和/或氨苄青霉素平板筛选得到阳性转化子，即得到重组大肠杆菌。

诱导重组大肠杆菌表达这三种酶，完成诱导表达后收集菌体。于100ml反应体积中，细胞湿重为20g/l，腐胺10g/l，高丝氨酸10g/l，nad1g/l，ph8.0于35℃反应，时间3小时。转化结束后，利用液相色谱测定反应液中亚精胺的浓度，结果如表1所示。

表1各种重组菌的比较

实施例6:以重组大肠杆菌全细胞催化合成亚精胺

根据实施例1所述诱导表达方法，将escherichiacolibl21(de3)/petduet-1-pfhsdh-cccsdh-bscsdc进行诱导表达，诱导表达完成后收集菌体，于100ml反应体积中，细胞湿重为1g/l，腐胺1g/l，高丝氨酸1g/l，nad1g/l，ph9.0于35℃反应，时间1小时。转化结束后液相色谱测定反应液中亚精胺浓度0.1g/l。

实施例7:以重组大肠杆菌全细胞催化合成亚精胺

根据实施例1所述诱导表达方法，将escherichiacolibl21(de3)/petduet-1-bchsdh-pccsdh-cjcsdc诱导表达完成后收集菌体，于100ml反应体积中，细胞湿重为200g/l，腐胺100g/l，高丝氨酸200g/l，nad1g/l，ph7于40℃反应，时间48小时。转化结束后液相色谱测定反应液中亚精胺浓度133g/l。

实施例8:以重组大肠杆菌全细胞催化合成亚精胺

根据实施例1所述诱导表达方法，将escherichiacolibl21(de3)/prsfduet-1-lfhsdh-pbcsdh-cscsdc诱导表达完成后收集菌体，于100ml反应体积中，细胞湿重为50g/l，腐胺10g/l，高丝氨酸10g/l，ph5于15℃反应，时间48小时。转化结束后液相色谱测定反应液中亚精胺浓度0.1g/l。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。