检测preS/S区缺失情况的引物及试剂盒的制作方法

本发明属于体外核酸检测领域，具体涉及一种检测pres/s区缺失情况的引物及试剂盒。
背景技术：
：原发性肝癌是世界上最为常见的恶性肿瘤之一，其中肝细胞癌(hepatocellularcarcinoma,hcc)约占85％。国际癌症研究署(irac)2012年估计世界约有78.2万例新发肝癌病例，74.6万例肝癌死亡，其中新发肝癌例数中国占50.5％，肝癌死亡例数占51.3％。2014年我国肿瘤数据显示，新发肝癌例数36.5万，死亡数约31.9万，在男性新发恶性肿瘤中，位居第三位，在女性新发恶性肿瘤中，位居第七位；在男性所有恶性肿瘤死亡中，肝癌死亡占16.12％，位居第二位，在女性所有恶性肿瘤死亡中，肝癌死亡占10.07％，位居第三位。肝癌是严重危害中国人生命健康的最主要癌症之一，是亟需解决的重大公共卫生问题。肝癌的发生是一个多因素多阶段的过程，包括环境因素：慢性肝炎病毒(hbv/hcv)的感染，饮用水污染以及饮食中黄曲霉素的摄入，平时不良的生活习惯(吸烟、喝酒)等，其中乙型肝炎病毒hbv感染导致的肝癌占60％以上。乙肝患者慢性感染5年后，有10-20％的患者将发展为肝硬化，6-15％的慢性肝硬化病人和乙肝患者会发展为肝癌。《easl2017clinicalpracticeguidelinesonthemanagementofhepatitisbvirusinfection》(2017年easl临床实践指南：hbv感染的管理)中明确指出hbvdna的特殊突变与hcc发生风险相关。《updateonprevention,diagnosis,andtreatmentandofchronichepatitisb:aasld2018hepatitisbguidance》(美国肝病协会hbv管理指南2018年)中明确指出hbsag突变会导致检测hbsag假阴性，而研究表明pres/s的突变会导致hbsag表达异常。因此检测hbv基因组突变有助于医生给予乙肝患者更精准的医疗建议。hbv病毒复制过程无校对机制，在慢性感染的过程中发生基因突变的概率很高，预计每年病毒一个核苷酸突变发生率为1.4-3.2×10-5，因此1000个hbv病毒每年有44.8-102.4个核酸发生突变。突变可导致宿主免疫识别的病毒抗原表位改变，病毒免疫逃逸；病毒hbvdna复制能力增加；产生耐药机制；产生hbsag假阴性的隐匿性hbv感染性肝炎等系列疾病。hbvdna突变与肝病向肝纤维化、肝癌的疾病发展相关。hbv基因组由四个基因区，分别为s，c，p，x区。s区分为前s(pres)/s区，pres/s区负责编码组成hbsag的小膜蛋白(s)、中膜蛋白(m)、大膜蛋白(l)，pres/s区突变导致hbsag合成或者组装失败，细胞免疫系统识别不到hbsag，造成hbv病毒免疫逃逸，病毒持续复制；pres/s区突变导致大量蛋白无法排出肝细胞，造成肝细胞内压力增大，引起细胞内基因组不稳定，进而引起相应慢性肝病的发生，包括肝纤维化、肝癌。目前市面上对于hbv基因组s区缺失的检测方法主要是dna直接测序法，该方法为行业的金标准，但是检测过程过于复杂、耗时长，并且无法满足大量样本同时检测的要求。并且在野生型和缺失型同时存在时，测序结果会出现异常无法分析，需要制备单克隆挑选大量的克隆子测序验证，整个过程繁琐耗时。还有研究使用毛细管电泳进行pres/s区缺失情况，使用毛细管电泳需要采购专用的仪器设备，仪器设备较贵，需要专业人员进行操作，并且不同的毛细管电泳仪通量不同，在仪器和人工及维护等成本上均较高。使用普通的琼脂糖凝胶电泳进行检测，操作简单，不需要昂贵仪器，并且可适用于散样和大量样本的同时检测。技术实现要素：为了克服上述现有技术的缺陷，本发明所要解决的技术问题是：提供一种检测hbv基因组pres/s区缺失情况用于预测肝癌发生风险的引物及试剂盒。为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：检测pres/s区缺失情况的引物，包括一对引物ps-f2和ps-r1；所述引物ps-f2的核苷酸序列(seqidno:1)为：5’-cattttgbgggtcaccatattc-3’；所述引物ps-r1的核苷酸序列(seqidno:2)为：5’-aaaacmccgcctgtaacacg-3’。本发明还提供了另一种技术方案，检测pres/s区缺失情况的试剂盒，包括pcr反应液，所述pcr反应液包括上述的检测pres/s区缺失情况的引物。本发明的有益效果在于：本发明提供的检测hbv基因组pres/s区缺失情况用于预测肝癌发生风险的引物，选择pres/s区保守序列进行引物设计，检测结果与测序结果比较准确率高达100％，可同时检测pres/s野生型和缺失型；包含有上述引物的试剂盒，不受样本例数的限制，可分配检测样本例数、样本例数少时无需攒样、出具实验结果快速便捷。采用该试剂盒进行检测，分析结果简单快捷，准确性高，适用性广，配合阳性对照同时电泳，根据扩增条带的大小进行区分，根据hbv基因组pres/s区的缺失情况预测乙肝患者发生肝癌的风险，有助于医生给予乙肝患者更精准的医疗建议。附图说明图1所示为本发明具体实施方式的pres/s区检测结果示例图。具体实施方式为详细说明本发明的技术内容、所实现目的及效果，以下结合实施方式并配合附图予以说明。本发明最关键的构思在于：在常规pcr的基础结合电泳技术来实现pres/s区是否出现缺失的检测。本发明的检测pres/s区缺失情况的引物，包括一对引物ps-f2和ps-r1；所述引物ps-f2的核苷酸序列为：5’-cattttgbgggtcaccatattc-3’；所述引物ps-r1的核苷酸序列为：5’-aaaacmccgcctgtaacacg-3’。本发明提供的另一种技术方案，检测pres/s区缺失情况的试剂盒，包括pcr反应液，所述pcr反应液包括上述的检测pres/s区缺失情况的引物。从上述描述可知，本发明的有益效果在于：本发明提供的检测hbv基因组pres/s区缺失情况用于预测肝癌发生风险的引物，选择pres/s区保守序列进行引物设计，检测结果与测序结果比较准确率高达100％，可同时检测pres/s野生型和缺失型；包含有上述引物的试剂盒，不受样本例数的限制，可分配检测样本例数、样本例数少时无需攒样、出具实验结果快速便捷。采用该试剂盒进行检测，分析结果简单快捷，准确性高，适用性广，配合阳性对照同时电泳，根据扩增条带的大小进行区分，根据hbv基因组pres/s区的缺失情况预测乙肝患者发生肝癌的风险，有助于医生给予乙肝患者更精准的医疗建议。进一步的，所述pcr反应液还包括taq酶、dntp和ung酶。从上述描述可知，试剂盒中引入ung酶防污染系统，能更加准确、稳定的对样品进行检测。进一步的，所述dntp的浓度为2.5mm。进一步的，所述检测pres/s区缺失情况的试剂盒，还包括阳性质控品1、阳性质控品2和阴性质控品；所述阳性质控品1为已灭活的hbvpres/s区无缺失的血清样本；所述阳性质控品2为已灭活的hbvpres/s区缺失的血清样本；所述阴性质控品为灭菌纯化水。进一步的，所述阳性质控品1和阳性质控品2的浓度均为1000iu/ml。实施例一：检测pres/s区缺失情况的试剂盒，包括表1所示成分：表1序号组分成分1pcr反应液引物、taq酶、dntp、ung酶、水2阳性质控品1已灭活的hbvpres/s区无缺失的血清样本3阳性质控品2已灭活的hbvpres/s区缺失的血清样本4阴性质控品灭菌纯化水表1中所述引物为ps-f2和ps-r1；所述引物ps-f2的核苷酸序列为：5’-cattttgbgggtcaccatattc-3’；所述引物ps-r1的核苷酸序列为：5’-aaaacmccgcctgtaacacg-3’；所述阳性质控品1：已灭活的hbv病毒pres/s区无缺失血清样本，浓度为1000iu/ml；所述阳性质控品2：已灭活的hbv病毒pres/s区缺失血清样本，浓度为1000iu/ml。实施例二：1、样品dna的提取使用商业化病毒基因组提取试剂盒，提取制备待测样本和阳性质控品hbv基因组dna。2、pcr反应体系配制及加样根据样本例数制备pcr反应体系份数n(n＝样本例数+阳性对照×2+阴性对照)，每管荧光定量pcr管分装体系20μl，样本dna(dna模板)量添加10μl、阴性对照10μl、阳性对照10μl，充分混合后短暂离心后，准备上机；按表2所示配置pcr反应体系，并加样。表2组分30μl用量/μl10×pcrbuffer32.5mmdntp1taq/ung0.3dna模板10ps-f20.5ps-r10.5ddh2oto303、将上述荧光定量pcr管，放入荧光pcr仪中，程序设置如表2所示。表34、电泳检测配制1％琼脂糖凝胶电泳，根据实际不同的电泳仪选择不同的电压和电泳时间，本实施例使用的电泳电源为dyy-6c(北京六一)，按照130v45min，电泳结束后，拍照留存实验结果。5、结果分析阳性质控品1和阳性质控品2检测结果应满足以下条件：1、阳性质控品1电泳结果为540bp。2、质控2的电泳结果条带大小小于阳性质控品1。满足以上两个条件后，进行结果分析，否则实验失败，重新实验。结果判读：以阳性质控品1为标准，当样本条带目的条带唯一时且大小小于阳性质控品1时，为pres/s区缺失；当样本目的条带为唯一时且大小等于阳性质控品1时，为pres/s区无缺失；当样本条带有两条分别为等于小于阳性质控品1时，为pres/s区缺失和无缺失混合型。pres/s检测结果如图1所示，图1中1：阳性质控品1；2：阳性质控品2；3-7：检测样本；8：dnaladder：从上到下为2000、1000、750、500、250、100bp。图1结果判读：4为pres/s区缺失和无缺失混合型，3、5、6为pres/s区无缺失型，7为hbvdna阴性。实施例三：取18例样本，使用实施例一的试剂盒，根据实施例二的步骤对18例样本进行检测，同时对18例样本进行dna测序，结果如表4所示，检测结果与测序结果比较准确率高达100％。表4综上所述，本发明提供的本发明提供的检测hbv基因组pres/s区缺失情况用于预测肝癌发生风险的引物，选择pres/s区保守序列进行引物设计，检测结果与测序结果比较准确率高达100％，可同时检测pres/s野生型和缺失型；包含有上述引物的试剂盒，不受样本例数的限制，可分配检测样本例数、样本例数少时无需攒样、出具实验结果快速便捷。采用该试剂盒进行检测，分析结果简单快捷，准确性高，适用性广，配合阳性对照同时电泳，根据扩增条带的大小进行区分，根据hbv基因组pres/s区的缺失情况预测乙肝患者发生肝癌的风险，有助于医生给予乙肝患者更精准的医疗建议。以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等同变换，或直接或间接运用在相关的
技术领域：
，均同理包括在本发明的专利保护范围内。序列表<110>阿吉安（福州）基因医学检验实验室有限公司<120>检测pres/s区缺失情况的引物及试剂盒<160>2<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>22<212>dna<213>人工序列<400>1cattttgbgggtcaccatattc22<210>2<211>20<212>dna<213>人工序列<400>2aaaacmccgcctgtaacacg20当前第1页12