一种检测游离循环肿瘤DNATP53基因突变的方法与流程

本发明属于生物技术领域，涉及一种检测游离循环肿瘤dnatp53基因的方法，是一种用于外周血血浆中检测游离循环肿瘤dna人类tp53基因外显子突变的方法。

背景技术：

肿瘤的发生是一个长期、多步骤的过程，重要基因的突变在肿瘤的发生发展过程中具有非常重要的作用。这些突变被认为与肿瘤的发生发展及治疗预后等有关。其中最为广泛关注的就是tp53基因，该基因在调节细胞周期、细胞增殖、凋亡、维持基因组稳定性等方面均具有重要的作用，该基因编码的p53蛋白是细胞周期的关键点调节蛋白，在细胞受到dna损伤、低氧或原癌基因活化等应激刺激时负责阻滞细胞周期，从而使细胞可以修复或渡过应激状态，而p53蛋白突变后将导致细胞周期失调控、基因组不稳定、受损细胞的增殖失控等，这些均与肿瘤的发生及耐药有关。tp53基因突变在多种肿瘤如卵巢癌、肠癌、乳腺癌、肺癌及血液系统肿瘤中等均有发现，而且在包括血液系统肿瘤在内的多种肿瘤预后评估中具有重要的意义。在血液系统恶性肿瘤中，已经有骨髓增生异常综合征(mds)和急性髓系白血病(aml)两种疾病的nccn指南预后评估体系中把tp53突变作为高危预后因素进行推荐。美国梅奥医学中心(mayoclinic)关于多发性骨髓瘤(mm)的smart指南中，也把tp53突变作为多发性骨髓瘤的高危预后因素。而且，近年来越来越多的文献证实在部分非霍奇金淋巴瘤如弥漫大b细胞淋巴瘤(dlbcl)、滤泡淋巴瘤(fl)和外周t细胞淋巴瘤等的预后危险因素分析中，tp53突变都是独立的高危因素。因此，tp53作为一个重要的肿瘤相关突变基因，在血液系统恶性肿瘤的预后评估中具有重要的意义。

传统的基因突变检测方法有基于pcr的sanger直接测序法、基于定点突变位点检测的荧光定量pcr法等。这些方法均存在一定的不足，如pcr结合sanger直接测序法只能对所检测的目的片段进行无差别的序列检测，检测效率低，灵敏度低，工作量大。基于定点突变位点的荧光定量pcr法只能针对已知的特定位点进行检测，而不能检测可能存在的未知的突变位点，检测结果不够全面和准确。近年来，二代测序也越来越多地应用于肿瘤突变基因的检测，随着检测深度的提高可以达到更灵敏的目的，但缺点在于检测成本高，耗时长。因此，设计一种简单方便而灵敏高效的tp53突变检测方法对于解决临床的实际需要具有重要的意义和价值。

由于临床标本取材量有限，尤其是淋巴瘤病理取材以粗针穿刺为多，病理标本的大小限制了临床检测，除了提供常规免疫组织化学检测用于病理类型诊断外，目前无法保证每个患者都有足够的标本用于所有预后因子的评估。而且在淋巴瘤及骨髓瘤的治疗过程中，随着疾病进程的演化尤其是在复发难治病例中，包括tp53基因突变在内的新的遗传学变异发生的可能性也增加，及时获得足够的肿瘤遗传学变异信息对于治疗方案的调整尤其重要，但通常在疾病进程中这一需要难以实现。把来源于肿瘤细胞凋亡代谢产生的游离循环肿瘤dna(ctdna)所承载遗传学信息的来代替原发灶肿瘤的遗传学信息，用于肿瘤疾病演化过程中发现新的遗传学变异，及时调整治疗方案和预后评估等在多种实体肿瘤中已经被证明是切实可行的。目前，ctdna检测的主要技术手段包括：beaming、数字pcr、arms-pcr、tam-pcr、capp-seq、ngs等。sanger’s测序法是最早、最成熟的dna测序手段，但由于灵敏度较低，不能检测血液中微量的dna，在常规的液体活检中没有应用价值。ctdna检测技术中使用最广泛的是dpcr和arms，由于其成本低，灵敏度高，适合检测血液中微量的dna。但是依然无法克服dpcr或arms的缺点：低通量，不能检测未知突变。二代测序技术(ngs)能够很好的弥补dpcr的ctdna检测上的不足，但缺点是价格太高，目前难以在市场上推广。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种检测游离循环肿瘤dnatp53基因突变的方法，通过以下步骤实现：

1.游离循环肿瘤dna的提取：经edtana2抗凝的外周血，室温500g离心5分钟后，取上层血浆，经paxgenebloodccfdnatubes(qiagen,catno.768115)试剂盒按照说明书提取游离循环肿瘤dna，置于1.5mlep管中，冻存于-80℃，作为后续pcr的模板。

2.tp53基因4-8号外显子pcr扩增：以步骤1所获得的dna10ng作为第一轮pcr模板，配置含有特异性引物对、dna聚合酶、pcr常规组件的pcr反应体系进行两轮巢式pcr扩增。

3.tp53基因突变检测：经两轮巢式pcr产物扩增后，取15ulpcr产物用1％琼脂糖凝胶电泳进行电泳，对阳性条带进行割胶回收，连接到pgemt-easy载体，4℃连接过夜后转化感受态细菌，涂布氨苄青霉素平板后经蓝白斑筛选阳性克隆，挑取阳性克隆扩增后进行直接测序法检测tp53突变。

其中步骤2中所述特异性引物对由以下8对引物(seqidno.1-16)组成：

特异性引物对1由正义引物seqid4up1和反义引物seqid4dn1构成；

特异性引物对2由正义引物seqid5-6up1和反义引物seqid5-6dn1构成；

特异性引物对3由正义引物seqid7up1和反义引物seqid7dn1构成；

特异性引物对4由正义引物seqid8up1和反义引物seqid8dn1构成；

特异性引物对5由正义引物seqid4up2和反义引物seqid4dn2构成；

特异性引物对6由正义引物seqid5-6up2和反义引物seqid5-6dn2构成；

特异性引物对7由正义引物seqid7up2和反义引物seqid7dn2构成；

特异性引物对8由正义引物seqid8up2和反义引物seqid8dn2构成。

所述dna聚合酶为hot-stardna聚合酶，属热启动dna聚合酶。

所述pcr常规组件包括dntps混合液、含镁离子的pcr反应缓冲液、去离子水。

上述技术方案中，具体步骤2中第一轮pcr反应每50ulpcr反应体系中的组分如下：

正义引物1ul，反义引物1ul，模板dna10ng，10×缓冲液(含硫酸镁)5ul，dntps混合液(每种2.5mm)4ul，hot-stardna聚合酶0.25ul，用去离子水补充到50ul体积。第二轮pcr反应体积模板dna由5ul第一轮pcr产物代替，其余组成成分与第一轮pcr反应组成成分一致。

上述技术方案中，步骤2第一轮pcr反应条件为：95℃5分钟；94℃30秒，50℃30秒，68℃2分钟(25个循环)；68℃7分钟。第二轮pcr反应条件为：95℃5min；87℃30秒，52℃30秒，72℃15秒(30个循环)；72℃7分钟。

上述技术方案中，步骤3所测序获得的dna序列需经多序列对比进行分析从而鉴定突变位置。

本发明的原理是：具有生物学和临床意义的tp53突变主要是错义突变，而这些突变的分布不是随机的，dna结合区域(dna-bindingdomain,dbd)的突变发生比例高于其他区域，而且其中r175、g245、r248、r249、r273及r282被认为是最常见且最具有临床意义的热点突变。这些有意义的突变位点绝大多数都是由g到a或c到t的碱基突变所导致的。因此，检测tp53基因中这类突变就可以涵盖绝大部分这些有意义的突变类型。dna序列中g-c两个碱基对之间通过三个氢键连接，而a-t两个碱基对之间通过两个氢键连接，因此g-c含量高的dna片段所需的变性温度要高于a-t含量高达dna片段，如果基因片段发生了g/c到a/t的突变，突变后的dna片段在较低的变性温度情况下可以被选择性扩增，从而提高检测g/c到a/t突变的敏感度，更灵敏地检测到tp53基因中g/c到a/t的突变。

由于上述技术方案的运用，本发明与现有传统pcr为基础的sanger测序方法相比具有以下优点：1)灵敏度高，由于是选择性扩增g/c到a/t突变的序列，从而提高了检测的灵敏度，由于肿瘤相关的ctdna在外周血血浆中丰度低，而且与正常dna片段混合在一起，提高检测的灵敏度就会大大提高检测的效率；2)特异性高，由于本发明所用的技术方案可以对g/c到a/t突变的序列进行特异性扩增，而野生型tp53基因片段在87℃变性温度下扩增不能被变性扩增，pcr产物电泳为阴性，因此pcr产物阳性的标本就是tp53突变阳性的标本，通过巢式pcr对突变阳性的标本进行初筛，从而提高检测的特异性，减少工作量。本发明与特异性突变位点为基础的荧光定量pcr方法相比具有检测未知突变的优势，只要外显子中含有g/c到a/t的突变类型就可以检测到，因此检测结果更全面。本发明与二代测序方法相比具有以下优势：1)检测快速，通常2-3天既可以得到检测结果，而二代测序通常检测及后续分析需要1周左右时间；2)检测成本大大降低，本发明的方法检测一个标本成本在200-300元左右，而二代测序一个标本的成本在数千到万余元不等；3)适用平台广，本发明的方法只需要常规pcr仪等常规实验室设备即可完成检测，而二代测序需要特殊的仪器及一定的生物信息学处理知识才能进行检测分析。

因此，本发明用外周血血浆中的游离循环肿瘤dna替代肿瘤组织标本dna用于tp53基因突变的检测，从而能够实现简便、及时、动态地检测肿瘤患者疾病演化过程中的tp53基因变异情况，从而提供一种简单方便而灵敏高效的tp53突变检测方法，实现简便、及时、动态地检测tp53基因变异情况。

附图说明

图1为实施例1中弥漫大b细胞淋巴瘤患者xjx外周血ctdna经两轮巢式pcr反应后取不同变性温度(92℃-87℃)pcr产物琼脂糖电泳结果。m代表dna分子量标准，92℃至86℃代表不同pcr反应变性温度，negative代表pcr反应阴性对照。

图2(a-b)为实施例1中弥漫大b细胞淋巴瘤患者xjx外周血ctdnatp53基因8号外显子碱基突变分析结果。图中可见检测到g/c到a/t的碱基突变。

图3为实施例1中弥漫大b细胞淋巴瘤患者xjx外周血ctdnatp53基因8号外显子氨基酸突变分析结果。图中可见检测到氨基酸序列突变，且存在已报导的热点突变r273c。

图4(a-b)为实施例2中弥漫大b细胞淋巴瘤患者lzq外周血ctdnatp53基因8号外显子碱基突变分析结果。图中可见检测到g/c到a/t的碱基突变。

图5为实施例2中弥漫大b细胞淋巴瘤患者lzq外周血ctdnatp53基因8号外显子氨基酸突变分析结果。图中可见检测到氨基酸序列突变，且存在已报导的热点突变r273c。

图6(a-b)为实施例3中原发中枢神经系统弥漫大b细胞淋巴瘤患者fmz外周血ctdnatp53基因8号外显子碱基突变序列分析结果。图中可见检测到g/c到a/t的碱基突变。

图7为实施例3中原发中枢神经系统弥漫大b细胞淋巴瘤患者fmz外周血ctdnatp53基因8号外显子氨基酸突变序列分析结果。图中可见检测到氨基酸序列突变，且存在热点突变r283c。

图8(a-b)为实施例3中原发中枢神经系统弥漫大b细胞淋巴瘤患者fmz外周血ctdnatp53基因7号外显子碱基突变序列分析结果。图中可见检测到g/c到a/t的碱基突变。

图9为实施例3中原发中枢神经系统弥漫大b细胞淋巴瘤患者fmz外周血ctdnatp53基因7号外显子氨基酸突变序列分析结果。图中可见检测到氨基酸序列突变，且存在热点突变r245s。

图10(a-b)为实施例4中多发性骨髓瘤患者wjz外周血ctdnatp53基因8号外显子碱基突变分析结果。图中可见检测到g/c到a/t的碱基突变。

图11为实施例4中多发性骨髓瘤患者wjz外周血ctdnatp53基因8号外显子氨基酸突变分析结果。图中可见检测到氨基酸序列突变，且存在热点突变r283w。

图12(a-b)为实施例4中多发性骨髓瘤患者wjz外周血传统dnatp53基因7号外显子碱基突变分析结果。图中可见检测到g/c到a/t的碱基突变。

图13为实施例4中多发性骨髓瘤患者wjz外周血ctdnatp53基因7号外显子氨基酸突变分析结果。图中可见检测到氨基酸序列突变，且存在热点突变r245d。

图14(a-b)为实施例5中急性髓系白血病患者ycf外周血ctdnatp53基因8号外显子碱基突变分析结果。图中可见检测到g/c到a/t的碱基突变。

图15为实施例5中急性髓系白血病患者ycf外周血ctdnatp53基因8号外显子氨基酸突变分析结果。图中可见检测到氨基酸序列突变，且存在热点突变r273c、r283c及r283h。

具体实施方式

本发明结合附图和实施例作进一步的说明。

实施例1

弥漫大b细胞淋巴瘤患者xjx，取血常规检测后剩余外周血标本，按照室温500g离心5分钟，取上层血浆，经paxgenebloodccfdnatubes(qiagen,catno.768115)试剂盒按照说明书提取游离循环肿瘤dna，置于1.5mlep管中，冻存于-80℃，作为后续pcr的模板。

tp53基因突变的检测：游离循环肿瘤dna模板10ng作为第一轮pcr模板，按照本发明步骤2中方法进行巢式pcr反应，pcr引物如下：

特异性扩增引物对1(seqidno.1-2)：

4up1:5’-tcacccatctacagtccccc-3’

4dn1:5’-cggccaggcattgaagtct-3’

扩增产物342bp

特异性扩增引物对2(seqidno.3-4)：

5-6up1:5’-aggaggtgcttacgcatgtt-3’

5-6dn1:5’-ccagttgcaaaccagacctc-3’

扩增产物499bp

特异性扩增引物对3(seqidno.5-6)：

7up1:5’-ctcctaggttggctctgactg-3’

7dn1:5’-ggggatgtgatgagaggtgga-3’

扩增产物245bp

特异性扩增引物对4(seqidno.7-8)：

8up1:5’-gagctggagcttaggctccagaaaggacaa-3’，

8dn1:5’-gctggtgttgttgggcagtgctaggaa-3’，

扩增产物376bp

特异性扩增引物对5(seqidno.9-10)：

4up2:5’-cccatctacagtcccccttg-3’

4dn2:5’-ccaggcattgaagtctcatgg-3’

扩增产物336bp

特异性扩增引物对6(seqidno.11-12)：

5-6up2:5’-ccctgccctcaacaagatgt-3‘

5-6dn1:5’-gagaccccagttgcaaacca-3‘

扩增产物396bp

特异性扩增引物对7(seqidno.13-14)：

7up2:5’-aggttggctctgactgtacc-3’

7dn2:5’-agaaatcggtaagaggtgggc-3’

扩增产物203bp

特异性扩增引物对8(seqidno.15-16)：

8up2:5’-ttctcttttcctatcctgagtagtggtaa-3’，

8dn2:5’-aaaggtgataaaagtgaatctgaggcataa-3’，

扩增产物长度为235bp。

扩增体系及扩增条件如前所述。经不同变性温度扩增后，pcr产物经1％琼脂糖电泳分离鉴定如图1所示。

割取87℃扩增的第二轮pcr产物阳性条带经凝胶dna回收试剂盒回收dna，连接到pgemt-easy载体，4℃连接过夜后转化感受态细菌，涂布amp平板后经蓝白斑筛选阳性克隆，挑取阳性克隆扩增后进行直接测序法检测tp53突变。测序结果经多序列对比分析后如图2-1及图2-2所示。

该患者外周血游离循环肿瘤dna检测tp53基因8号外显子突变阳性，且存在已报导的热点突变r273c如图3所示。经一线r-chop方案化疗6次后1个月，病情进展，pfs8个月，改二线化疗后效果欠佳，生存期17个月。

实施例2

患者lzq，诊断为弥漫大b细胞淋巴瘤，edtana2抗凝外周血按照本发明所述方法提取ctdna，经前述巢式pcr方法扩增tp53基因外显子，对琼脂糖凝胶电泳验证后的阳性扩增产物进行单克隆扩增并测序。结果发现其8号外显子存在突变如图4所示。

该患者外周血游离循环肿瘤dna检测tp53突变阳性，且存在热点突变r273c如图5所示。经一线r-chop方案化疗4次后，病情进展，出现淋巴瘤中枢神经系统累计，pfs4个月，后经r-mtx-chop方案化疗1次，出院后病情进展去世，生存期6个月。

实施例3

患者fmz诊断为原发中枢神经系统弥漫大b细胞淋巴瘤，edtana2抗凝外周血按照本发明所述方法提取ctdna，经前述巢式pcr方法扩增tp53基因外显子，对琼脂糖凝胶电泳验证后的阳性扩增产物进行单克隆扩增并测序。结果发现其7号外显子及8号外显子均存在突变如图6和图7所示。

该患者外周血游离循环肿瘤dna检测tp53突变阳性，且存在热点突变r283c及r245s如图8和图9所示。经一线r-mtx方案化疗6次后，病情达到完全缓解。但6个月后疾病复发，后病情进展去世，生存期14个月。

实施例4

患者wjz诊断为多发性骨髓瘤，edtana2抗凝外周血按照本发明所述方法提取ctdna，经前述巢式pcr方法扩增tp53基因外显子，对琼脂糖凝胶电泳验证后的阳性扩增产物进行单克隆扩增并测序。结果发现其7号外显子及8号外显子均存在突变如图10和图11所示。

该患者外周血游离循环肿瘤dna检测tp53突变阳性，且存在热点突变r283w及r245d如图12和图13所示。经一线vtd(硼替佐米+沙利度胺+地塞米松)方案化疗3次后，病情进展。后改病灶局部放疗联合vrd方案(硼替佐米+沙利度胺+地塞米松)化疗4次后疾病缓解。但3个月后疾病进展。

实施例5

患者ycf诊断为急性髓系白血病(aml-m2)，edtana2抗凝外周血按照本发明所述方法提取ctdna，经前述巢式pcr方法扩增tp53基因外显子，对琼脂糖凝胶电泳验证后的阳性扩增产物进行单克隆扩增并测序。结果发现其8号外显子存在突变如图14所示。

该患者外周血游离循环肿瘤dna检测tp53突变阳性，且存在热点突变r273c、r283c及r283h，如图15所示。经ia方案化疗1疗程后，病情不能缓解，后改二线haa方案化疗1疗程后，病情仍不能缓解，发病4个月后疾病进展。

序列表

<110>浙江大学

<120>一种检测游离循环肿瘤dnatp53基因突变的方法

<160>16

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>20

<212>dna

<213>人工合成(unknown)

<400>1

tcacccatctacagtccccc20

<210>2

<211>19

<212>dna

<213>人工合成(unknown)

<400>2

cggccaggcattgaagtct19

<210>3

<211>20

<212>dna

<213>人工合成(unknown)

<400>3

aggaggtgcttacgcatgtt20

<210>4

<211>20

<212>dna

<213>人工合成(unknown)

<400>4

ccagttgcaaaccagacctc20

<210>5

<211>21

<212>dna

<213>人工合成(unknown)

<400>5

ctcctaggttggctctgactg21

<210>6

<211>21

<212>dna

<213>人工合成(unknown)

<400>6

ggggatgtgatgagaggtgga21

<210>7

<211>30

<212>dna

<213>人工合成(unknown)

<400>7

gagctggagcttaggctccagaaaggacaa30

<210>8

<211>27

<212>dna

<213>人工合成(unknown)

<400>8

gctggtgttgttgggcagtgctaggaa27

<210>9

<211>20

<212>dna

<213>人工合成(unknown)

<400>9

cccatctacagtcccccttg20

<210>10

<211>21

<212>dna

<213>人工合成(unknown)

<400>10

ccaggcattgaagtctcatgg21

<210>11

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<212>dna

<213>人工合成(unknown)

<400>11

ccctgccctcaacaagatgt20

<210>12

<211>20

<212>dna

<213>人工合成(unknown)

<400>12

gagaccccagttgcaaacca20

<210>13

<211>20

<212>dna

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<400>13

aggttggctctgactgtacc20

<210>14

<211>21

<212>dna

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<400>14

agaaatcggtaagaggtgggc21

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<212>dna

<213>人工合成(unknown)

<400>15

ttctcttttcctatcctgagtagtggtaa29

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