一种人脐静脉内皮原代分离培养方法与流程

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种人脐静脉内皮原代分离培养方法。

背景技术：

内皮细胞是覆盖于血管内表面的一种单层扁平磷状上皮细胞，位于血液和血管壁或组织的之间。过去学者们普遍认为内皮细胞仅构成一种简单的机械屏障，然而随着科学的进展，人们对内皮细胞的了解不断加深，内皮细胞在维持机体稳态中有着具足轻重的作用。在机体中，内皮细胞可以释放多种活性介质，调节血管紧张度、介导炎症反应、参与血管新生、血栓形成等多种病理生理过程。内皮细胞已经成为生命科学领域重要的研究工具，广泛应用于蛋白质组学、基因组学、遗传学、药物筛选、药物代谢、毒理研究、高血压治疗与诊断等众多领域。在众多内皮细胞中，人脐静脉内皮细胞(humanumbilicalendothelialcell,huvec)具有得天独厚的优势：标本易采集且对患者无任何伤害、脐静脉血管管径粗易操作，具有干细胞潜能传代能力强等。目前已经创建了多种永生的脐静脉内皮细胞系，如huv-ec-c,huvec-cs，t-huvec，t/huvec，huvec/tert2和pumc-huvec-t1等供研究者使用。但细胞系突破了衰老界限，其遗传物质与核型已经发生异倍化，此外其蛋白表达水平、细胞形态也与机体内正常细胞有较大出入，无法最大程度模拟体内过程。而原代细胞是指从供体取得组织细胞后在体外进行的首次培养，最常用的是组织块法和消化法，其细胞刚离体，生物学特性未发生很大变化，仍具有二倍体遗传特性，最接近和反映体内生长特性，一般在2～7代以内，能够最大程度利用模拟体内过程。目前市面上已有商品化一次性原代内皮细胞，但公司良莠不齐，细胞真实来源缺乏监管，市场鱼龙混杂，且其售价昂贵，因此一种便捷、高效、经济、稳定的提取和培养原代脐静脉内皮的方法有重要科研价值及经济学意义。

现有的脐静脉内皮原代分离与培养方法对标本时效性要求极高，脐带离体时间超过一小时若仍未开始分离，细胞活性严重下降，极大的影响了接种后细胞活力及传代次数，因此从产房将新鲜离体的标本转运至实验室导致的标本活力下降便是分离中第一难关；且所需试剂种类繁杂、价位昂贵，所提取出的原代细胞状态不稳定，细胞传代次数常少于3代便衰老皱缩死亡，难以满足基础科研的要求。

现有的方案对标本时效性要求极高，脐带离体后放入生理盐水中进行保存，时间超过一小时若仍未开始分离，细胞活性严重下降，极大的影响了接种后细胞活力及传代次数，脐带从产房将新转运至实验室这一路途中将导致细胞活力下降，因此亟待改进脐带储存液配方，在保证细胞活力的同时尽可能使得标本储存时间得以延长。即使能够标本离体后很快进行分离，内皮细胞专用培养基套装价位昂贵，培养过程所需试剂种类繁杂、且所提取出的原代细胞状态不稳定，通常细胞传代次数常少于3代便衰老皱缩死亡，难以满足基础科研的要求。因此亟待建立一种便捷、高效、经济、稳定的脐静脉内皮细胞原代分离与培养的方案。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题在于针对上述现有技术中的不足，提供一种便捷、高效、经济、稳定的脐静脉内皮细胞原代分离培养方法，可保证细胞活力的同时将脐带储存时间延长至6小时。

本发明采用以下技术方案：

一种人脐静脉内皮原代分离培养方法，采集术后脐带，然后加入胶原酶分离提取脐静脉内皮细胞制成单细胞悬液，培养得到p0代细胞，使用基于m199培养基的完全培养基将p0代细胞培养至p2代细胞；采用胰蛋白酶对p2代细胞进行消化，接种于t75培养瓶中，采用基于m199培养基的完全培养基培养，待细胞融合度为80～90％时，得到扩增培养后的人脐静脉内皮细胞p3代细胞。

具体的，采集术后脐带后，用pbs溶液冲洗脐静脉管腔，然后灌注i型胶原酶37℃消化，分离提取脐静脉内皮细胞制成单细胞悬液，在t25培养瓶中使用200mlm199培养基培养至细胞融合度为80～90％时，得到p0代细胞。

进一步的，i型胶原酶加入量为每10～15cm长的脐带组织灌注0.1％i型胶原酶3～8ml。

更进一步的，i型胶原酶消化时间8～15min。

进一步的，pbs溶液的体积为20～100ml。

进一步的，培养温度为36.5～37.5℃，co2浓度为4.5～5.5％。

具体的，胰蛋白酶的浓度为0.025％～0.125％。

具体的，胰蛋白酶的浓度为0.05％。

具体的，完全培养基为80mlm199培养基、20mlfbs溶液、1ml青链霉素混合溶液、1000u肝素钠注射液和2mlhepes缓冲液。

进一步的，m199培养基组成包括：

浓度25.0mg/l的丙氨酸0.28mm；浓度70.0mg/l的精氨酸0.33mm；浓度30mg/l的天冬氨酸0.22mm；浓度0.1mg/l的半胱氨酸5.68mm；浓度15mg/l的甲硫氨酸0.1mm；浓度25.0mg/l的苯丙氨酸0.15mm；浓度40mg/l的脯氨酸0.34mm；浓度25.0mg/l的丝氨酸0.23mm；浓度30.0mg/l的苏氨酸0.25mm；浓度10.0mg/l的色氨酸0.05mm；浓度58.0mg/l的络氨酸0.22mm；浓度25.0mg/l的缬氨酸0.21mm；浓度0.05mg/l的维生素c2.84mm；浓度0.01mg/l的维生素h4.09mm；浓度0.5mg/l的胆碱0.0035mm；浓度0.01mg/l的泛酸钙2.09mm；浓度0.01mg/l的也算2.26mm；浓度0.01mg/l的维他命k35.81mm；浓度0.025mg/l的烟酰胺2.04mm；浓度0.025mg/l的烟酸2.03mm；浓度0.05mg/l的对氨基苯甲酸3.64mm；浓度0.025mg/l的盐酸吡哆醛1.22mm；浓度0.025mg/l的盐酸吡哆醇1.21mm；浓度0.01mg/l的维生素b22.65mm；浓度0.01mg/l的盐酸硫胺素2.96mm；浓度0.1mg/l的维他命a3.04mm；浓度0.1mg/l的维他命d22.51mm；浓度0.01mg/l的生育酚1.8mm；浓度0.05mg/l的肌醇2.77mm；浓度200.0mg/l的cacl21.80mm；浓度0.7mg/l的fe(no3)-9h2o0.0017mm；浓度97.67mg/l的mgso40.87mm；浓度400.0mg/l的kcl5.33mm；浓度2200.0mg/l的nahco326.19mm；浓度6800.0mg/l的nacl117.24mm；浓度140.0mg/l的nah2po4-h2o1.01mm；浓度0.5mg/l的脱氧核糖0.0037mm；浓度10.0mg/l的硫酸腺嘌呤0.024mm；浓度0.2mg/l的5’-腺苷5.76mm；浓度1.0mg/l的三磷酸腺苷0.0016mm；浓度0.2mg/l的胆固醇5.16mm；浓度1000.0mg/l的葡萄糖5.55mm；浓度0.3mg/l的盐酸鸟嘌呤0.0015mm；浓度0.4mg/l的次黄嘌呤钠0.002mm；浓度20mg/l的酚红0.05mm；浓度0.5mg/l的核糖0.003mm；浓度50.0mg/l的醋酸钠0.6mm；浓度0.3mg/l的胸腺嘧啶0.0.002mm；浓度20.0mg/l的吐温浓度0.3mg/l的uracil尿嘧啶0.002mm；浓度0.34mg/l的黄嘌呤钠0.002mm。

与现有技术相比，本发明至少具有以下有益效果：

本发明提供了一种人脐静脉内皮原代分离培养方法，使用本发明中的脐带储存液可将脐带离体后保鲜时间延长至6h，保证了脐带转运途中的细胞活力，极大提高了实验操作的可行性，在分离脐静脉内皮细胞时，加入胶原酶使脐带血管腔内适度充盈，在此胶原酶浓度下，消化完成后收集消化液，离心接种，所收获的细胞活力好，可传至9～12代，经鉴定纯度高，符合要求，可满足基础科研对工具细胞的要求。

进一步的，在分离脐静脉内皮细胞时，使用20-100ml的无菌pbs溶液对采集的脐带内脐静脉管腔进行冲洗，可去除管腔内残留的血液，避免红细胞对后续细胞培养的干扰。

进一步的，在分离脐静脉内皮细胞时，使用浓度0.1％的i型胶原酶，i型胶原酶加入量优选为每10～15cm的脐带脐静脉中加入3～8ml，使脐带血管腔内适度充盈。

进一步的，在分离脐静脉内皮细胞时，胶原酶消化时间为8-15min，可使脐静脉内的血管内皮松动脱落至酶溶液中，既对内皮细胞进行了充分消化又可避免因过度消化导致的血管平滑肌脱落，最后获得的血管内皮纯度高，无其他杂细胞掺入。

进一步的，在培养原代脐静脉内皮细胞时，细胞培养箱设置为为36.5～37.5℃，co2浓度为4.5～5.5％，在这一条件下细胞处于最适ph值，利于其生长。

进一步的，在原代脐静脉内皮细胞传代时，胰蛋白酶的浓度为0.025％～0.125％，优选为0.05％，原代细胞贴壁较弱，使用低浓度的胰酶便可使其从培养瓶壁上脱落，若浓度过高会给细胞带来损伤。

进一步的，在培养原代脐静脉内皮细胞时，使用的培养基为m199培养基，，该培养基于1950年由morgan等设计，富含多种营养物质，是目前应用最广泛的培养基之一，可满足原代脐静脉内皮的生长需要。

进一步的，在培养原代脐静脉内皮细胞时，向培养基中加入肝素钠(14unit/ml)能够抑制成纤维细胞的生长，进而提高原代脐静脉内皮细胞的纯度，并能一定程度促进内皮细胞生长；此外还需向培养基中加入非离子两性缓冲液hepes(20mm)，使得细胞处于培养箱外时依然能维持较恒定的ph值。

下面通过附图和实施例，对本发明的技术方案做进一步的详细描述。

附图说明

图1为本发明中脐静脉内皮细胞原代分离的技术操作示意图，其中，(a)为将脐带远端三通打开，用20～100mlpbs溶液冲洗脐带去除血管内残血，直至流出清亮液体；(b)为关闭脐带远端三通，每10cm长度的脐带灌注0.1％i型胶原酶3-8ml至脐带适度充盈；(c)为拔掉注射器，关闭脐带近端三通，于37℃消化10min；(d)为打开三通，用50ml离心管收集脐带内消化液；

图2为分离培养出的原代脐静脉内皮进行免疫荧光的鉴定结果图，其中，(a)为按照本法所分离的细胞在p1代时特异表达脐静脉内皮标志物vwf、α-sma、cd31这三种标志物；(b)为按照本法所分离的细胞在p5代时特异表达脐静脉内皮标志物vwf、α-sma、cd31；(c)为按照本法所分离的细胞在p9代时特异表达脐静脉内皮标志物vwf、α-sma、cd31；(d)为按照本法所分离的细胞在p12代时特异表达脐静脉内皮标志物vwf、α-sma、cd31；

图3为脐带经不同方式存储所致的细胞活力差异图。

具体实施方式

本发明一种人脐静脉内皮原代分离培养方法，包括以下步骤：

s1、获得医院伦理委员会批准，标本采集前应详尽告知产妇研究目的、标本用途，在产妇同意后获得其签署的知情同意书方可在术后采集脐带；

s2、分离人脐静脉内皮细胞

在剖宫产术中，无菌条件下取人脐带，用pbs溶液冲洗脐静脉管腔，其后灌注i型胶原酶37℃消化，分离提取脐静脉内皮细胞制成单细胞悬液，在t25培养瓶中培养至细胞融合度为80～90％时，得到p0代细胞；

pbs溶液的体积为20～100ml，优选为40ml无菌pbs冲洗，至脐带另一端流出清亮液体。

胶原酶加入量为每10cm长的脐带组织灌注0.1％i型胶原酶3～8ml，其优选量为4ml。

胶原酶消化时间8～15分钟，优选量为消化10分钟。

s3、人脐静脉内皮细胞传代培养

取步骤s2得到的p0代细胞，在培养瓶中采用基于m199培养基的完全培养基培养至p2代；

收集脐带标本时所使用的储存液为200mlm199培养基，其内特别添加青链霉素混合液以及hepes缓冲液；m199培养基组成如表1所示

培养用的完全培养基是基于m199培养基独特配制的混合物，配方见表2：

表2完全培养基的组成

培养条件为温度36.5～37.5℃，co2浓度4.5～5.5％。

s4、人脐静脉内皮细胞扩大培养

取步骤s3得到的p2代细胞，采用胰蛋白酶消化后，接种于t75培养瓶中，采用基于m199培养基的完全培养基培养，待细胞融合度为80～90％时，得到扩增培养后的人脐静脉内皮细胞p3代细胞；

s5、重复步骤s4，得到扩增培养后的人脐静脉内皮细胞。

传代培养及扩大培养中使用的酶为胰蛋白酶，其浓度为0.025％～0.125％，优选为0.05％。

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。通常在此处附图中的描述和所示的本发明实施例的组件可以通过各种不同的配置来布置和设计。因此，以下对在附图中提供的本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

1.研究项目获得西北妇女儿童医院伦理委员会批准，标本采集前应详尽告知产妇研究目的、标本用途，在产妇同意后获得其签署的知情同意书；

2.准备操作所需的无菌器械包：止血钳、腰盘、缝合丝线、12号灌胃针(去掉针头并将断痕处进行抛磨钝化处理)、10ml注射器、20ml注射器、三通、50ml离心管；

3.准备操作所需的试剂：

①无菌脐带储存液：200mlm199培养基(hyclone,sh30243.01)，2ml青链霉素混合液(索来宝，p1400)，2ml1mhepes缓冲液(gibco，15630080)。其中m199培养基配方见表2；

②完全培养基配制(见表2),其中m199组成见表1；

③无菌pbs：称取0.24gkh2po4，8gnacl，0.2gkcl，2.9gna2hpo4·12h2o溶解于1l三蒸水中，分装后高压灭菌；

实施例1

①采集健康足月胎儿脐带。脐带采集前需审阅产妇检查结果，排除有感染性疾病(艾滋病、乙型肝炎、丙型肝炎、梅毒等)的产妇，确保实验操作人员的安全；

②无菌环境下取长度15cm的脐带，剪去脐带两端的止血钳夹痕，轻轻挤出血管内残血，将脐带放入储存液，放置于冰上转运回实验室；

③向t25培养瓶中加入3ml0.1％明胶溶液，放入36.5℃，co2浓度为4.5％的培养箱内30min，接种前倒掉明胶溶液，并用2ml无菌pbs溶液润洗培养瓶瓶壁；

④将脐带转移至超净台内灭菌腰盘，用75％酒精棉球擦拭脐带表面，去除表面污血；将12号灌胃针插入脐静脉两端，用无菌丝线缝扎，将灌胃针针头牢牢固定于脐静脉中，并在其后连接三通；在近端三通连接注射器，打开远端三通阀门，用20mlpbs溶液冲洗脐带去除血管内残血，可见脐带另一端流出清亮液体(图1a)；

⑤用2ml0.1％胶原酶冲洗脐静脉，随后关闭远端三通，注入4.5ml0.1％胶原酶溶液，此时脐静脉适度充盈(图1b)；去掉注射器关闭近端三通，将脐带转移至装有100mlpbs溶液的预热无菌饭盒中，放入36.5℃，co2浓度为4.5％的培养箱孵育8min(图1c)；

⑥孵育后，将脐带取回至超净台内，轻揉脐带5min，促进内皮细胞从血管壁脱落；打开远端三通(图1d)，用50m无菌离心管收集脐静脉内消化液，并用10mlpbs溶液再次冲洗管腔，一并收集至上述离心管，800rpm离心5min，用5ml完全培养基重悬细胞沉淀，接种至明胶包被的t25培养瓶内，放入36.5℃，co2浓度为4.5％的培养箱进行培养，至细胞80％融合时传代。

人脐静脉内皮的扩大培养及冻存

用0.05％的胰酶进行消化，以1:2的比例进行传代，每周换液2～3次；冻存条件为：92％胎牛血清，8％dmso；

实施例2

①采集健康足月胎儿脐带；脐带采集前需审阅产妇检查结果，排除有感染性疾病(艾滋病、乙型肝炎、丙型肝炎、梅毒等)的产妇，确保实验操作人员的安全；

②无菌环境下取长度20cm的脐带，剪去脐带两端的止血钳夹痕，轻轻挤出血管内残血，将脐带放入储存液，放置于冰上转运回实验室；

③向t25培养瓶中加入3ml0.1％明胶溶液，放入37.5℃，co2浓度为5.5％的培养箱内30min，接种前倒掉明胶溶液，并用2mlpbs溶液润洗培养瓶瓶壁；

④将脐带转移至超净台内灭菌腰盘，用75％酒精棉球擦拭脐带表面，去除表面污血；将12号灌胃针插入脐静脉两端，用无菌丝线缝扎，将灌胃针针头牢牢固定于脐静脉中，并在其后连接三通；在近端三通连接注射器，打开远端三通阀门，用100ml无菌pbs溶液冲洗脐带去除血管内残血，可见脐带另一端流出清亮液体(图1a)；

⑤用2ml0.1％胶原酶冲洗脐静脉，随后关闭远端三通，注入16ml0.1％胶原酶溶液，此时脐静脉适度充盈(图1b)；去掉注射器关闭近端三通，将脐带转移至装有100mlpbs溶液的预热无菌饭盒中，放入37.5℃，co2浓度为5.5％的培养箱孵育15min(图1c)；

⑥孵育后，将脐带取回至超净台内，轻揉脐带5min，促进内皮细胞从血管壁脱落；打开远端三通(图1d)，用50m无菌离心管收集脐静脉内消化液，并用10mlpbs溶液再次冲洗管腔，一并收集至上述离心管，800rpm离心5min，用5ml完全培养基重悬细胞沉淀，接种至明胶包被的t25培养瓶内，放入37.5℃，co2浓度为5.5％的培养箱进行培养，至细胞80％融合时传代；

人脐静脉内皮的扩大培养及冻存

用0.05％的胰酶进行消化，以1:2的比例进行传代，每周换液2～3次；冻存条件为：92％胎牛血清，8％dmso。

实施例3

①采集健康足月胎儿脐带；脐带采集前需审阅产妇检查结果，排除有感染性疾病(艾滋病、乙型肝炎、丙型肝炎、梅毒等)的产妇，确保实验操作人员的安全；

②无菌环境下取长度30cm的脐带，剪去脐带两端的止血钳夹痕，轻轻挤出血管内残血，将脐带放入储存液，放置于冰上转运回实验室；

③向t25培养瓶中加入3ml0.1％明胶溶液，放入37℃，co2浓度为5％的培养箱内30min，接种前倒掉明胶溶液，并用2mlpbs溶液润洗培养瓶瓶壁；

④将脐带转移至超净台内灭菌腰盘，用75％酒精棉球擦拭脐带表面，去除表面污血；将12号灌胃针插入脐静脉两端，用无菌丝线缝扎，将灌胃针针头牢牢固定于脐静脉中，并在其后连接三通；在近端三通连接注射器，打开远端三通阀门，用40ml无菌pbs溶液冲洗脐带去除血管内残血，可见脐带另一端流出清亮液体(图1a)；

⑤用2ml0.1％胶原酶冲洗脐静脉，随后关闭远端三通，注入12ml0.1％胶原酶溶液，此时脐静脉适度充盈(图1b)；去掉注射器关闭近端三通，将脐带转移至装有100mlpbs溶液的预热无菌饭盒中，放入37℃，co2浓度为5％的培养箱孵育10min(图1c)；

⑥孵育后，将脐带取回至超净台内，轻揉脐带5min，促进内皮细胞从血管壁脱落；打开远端三通(图1d)，用50m无菌离心管收集脐静脉内消化液，并用10mlpbs溶液再次冲洗管腔，一并收集至上述离心管，800rpm离心5min，用5ml完全培养基重悬细胞沉淀，接种至明胶包被的t25培养瓶内，放入37℃，co2浓度为5％的培养箱进行培养，至细胞80％融合时传代；

人脐静脉内皮的扩大培养及冻存

用0.05％的胰酶进行消化，以1:2的比例进行传代，每周换液2～3次；冻存条件为：92％胎牛血清，8％dmso。

实施例4

①采集健康足月胎儿脐带；脐带采集前需审阅产妇检查结果，排除有感染性疾病(艾滋病、乙型肝炎、丙型肝炎、梅毒等)的产妇，确保实验操作人员的安全；

②无菌环境下取长度20cm的脐带，剪去脐带两端的止血钳夹痕，轻轻挤出血管内残血，将脐带放入储存液，放置于冰上转运回实验室；

③向t25培养瓶中加入3ml0.1％明胶溶液，放入37.1℃，co2浓度为5.2％的培养箱内30min，接种前倒掉明胶溶液，并用2ml无菌pbs溶液润洗培养瓶瓶壁；

④将脐带转移至超净台内灭菌腰盘，用75％酒精棉球擦拭脐带表面，去除表面污血；将12号灌胃针插入脐静脉两端，用无菌丝线缝扎，将灌胃针针头牢牢固定于脐静脉中，并在其后连接三通；在近端三通连接注射器，打开远端三通阀门，用50mlpbs溶液冲洗脐带去除血管内残血，可见脐带另一端流出清亮液体(图1a)；

⑤用2ml0.1％胶原酶冲洗脐静脉，随后关闭远端三通，注入23ml0.1％胶原酶溶液，此时脐静脉适度充盈(图1b)；去掉注射器关闭近端三通，将脐带转移至装有100mlpbs溶液的预热无菌饭盒中，放入37.1℃，co2浓度为5.2％的培养箱孵育15min(图1c)；

⑥孵育后，将脐带取回至超净台内，轻揉脐带5min，促进内皮细胞从血管壁脱落；打开远端三通(图1d)，用50m无菌离心管收集脐静脉内消化液，并用10mlpbs溶液再次冲洗管腔，一并收集至上述离心管，800rpm离心5min，用5ml完全培养基重悬细胞沉淀，接种至明胶包被的t25培养瓶内，放入37.1℃，co2浓度为5.2％的培养箱进行培养，至细胞80％融合时传代；

人脐静脉内皮的扩大培养及冻存：

用0.05％的胰酶进行消化，以1:2的比例进行传代，每周换液2～3次；冻存条件为：92％胎牛血清，8％dmso。

请参阅图2，为本发明中原代脐静脉内皮在不同代数的鉴定图，其中(a)为按照本法所分离的细胞在p1代时特异表达脐静脉内皮标志物vwf、α-sma、cd31这三种标志物，(b)为按照本法所分离的细胞在p5代时特异表达脐静脉内皮标志物vwf、α-sma、cd31，(c)为按照本法所分离的细胞在p9代时特异表达脐静脉内皮标志物vwf、α-sma、cd31，(d)为按照本法所分离的细胞在p12代时特异表达脐静脉内皮标志物vwf、α-sma、cd31，细胞纯度高,无成纤维细胞等混杂。

请参阅图3，脐带在本发明的保鲜液和生理盐水中分别放置不同时间后进行细胞分离，所分离的原代细胞种于96孔板中进行cck-8细胞活力测定，置于生理盐水组的脐带所分离出的细胞在4小时内于脐带保鲜液无显著差异，而在6小时后活力不断下降，因此本发明中的脐带保鲜液可延长标本贮存时间。

以上内容仅为说明本发明的技术思想，不能以此限定本发明的保护范围，凡是按照本发明提出的技术思想，在技术方案基础上所做的任何改动，均落入本发明权利要求书的保护范围之内。