一种基于CRISPR/Cas和恒温扩增的一步法核酸检测方法和试剂盒与流程

本发明属于生物技术领域，涉及crispr/cas系统和rpa恒温扩增系统，具体是一种基于crispr/cas12a和恒温扩增的一步法核酸检测方法和试剂盒。

背景技术：

核酸检测在疾病诊断，病原体检测等领域有重要意义。其中在病原体检测领域中，因为核酸片段较蛋白抗原更稳定，也不像rna那样易受样品背景的影响，利用病原体核酸特异序列的病原体核酸检测技术有重要意义。

目前核酸的检测方法检测包括rt-pcr、real-timeqpcr、基因芯片、lamp、nasba、hrm、pcr、rpa以及oxfordnanopore测序技术等。rt-pcr方法进行核酸检测时，首先进行逆转录，将rna转录成cdna，然后再进行特异dna序列的扩增和检测，这是常规rna检测方法；实时荧光定量pcr采用特异性标记的荧光探针，利用荧光信号积累实时监测整个pcr进程，使每一个循环变得“可见”，实时监测靶标的扩增情况；环介导等温扩增(lamp)技术通过一系列的链置换扩增反应，该方法能够在1h内就可以将靶基因扩增10⁹倍，能够高效、特异、快速的在等温条件下完成；依赖核酸序列的扩增技术(nasba)是一项以rna为模板，以转录原理为基础的快速等温扩增技术，一种高通量的方法，非常适用于大规模样品的筛查；高分辨率熔解(hrm)分析是一门新兴的技术，它仅仅通过pcr之后的熔解曲线分析，就能检测pcr片段的微小序列差异，从而实现特异性的核酸识别和检测。

这些方法虽然可以有效且定性检测特异性核酸序列，但是大都需要特殊的仪器，价格成本昂贵，或需要较复杂的操作及较长的检测时间。为了解决这一问题，人们开发了恒温扩增技术，而单纯的恒温扩增技术通常面临特异性不佳和检测结果展示不方便的问题。如何更加快速、简便、低成本、高特异性、高灵敏度且在缺乏仪器设备的条件下的特异性检测目标核酸是一个亟待解决的问题。

crispr/cas系统由成簇的、有规律间隔的短回文重复序列(clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats，crispr)和它的辅助蛋白(crispr-associated，cas)构成。crispr是生命进化历史上，细菌和病毒进行斗争产生的免疫武器，crispr/cas系统是一种原核生物的免疫防御系统，用来抵抗外来遗传物质的入侵，比如噬菌体病毒等。同时，它为细菌提供了获得性免疫(类似于哺乳动物的二次免疫)，当细菌遭受病毒入侵时，会产生相应的“记忆”。当病毒二次入侵时，crispr系统可以识别出外源dna，并将它们切断，沉默外源基因的表达，抵抗病毒的干扰。正是由于这种精确的靶向功能，crispr/cas系统被开发成一种高效的基因编辑工具，为实现快速便捷灵敏的特异性核酸检测提供了有利依据。

技术实现要素：

为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种基于crispr/cas12a和恒温扩增的一步法核酸检测方法。该方法是用于检测核酸并通过荧光或侧流免疫层析试纸呈现可视化检测结果的现场快速检测方法。具体通过crispr/cas12a与rpa恒温扩增系统相结合，以侧流免疫层析试纸呈现可视化检测核酸。

本发明的另一目的在于提供一种靶标核酸分子的检测试剂盒。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种基于crispr/cas12a和恒温扩增的一步法核酸检测方法，该方法用于非诊断或治疗目的，包括如下步骤：向含有待测靶标核酸分子的体系中加入检测目标核酸特异性crrna序列、lbacas12a、报告单链dna分子、冻干rpa反应微球、醋酸镁、rehydrationbuffer(rpa无引物再水合缓冲液)、rpa上下游引物进行一步反应，然后将反应产物进行侧流免疫层析试纸或荧光检测；

具体包括如下步骤：

(1)对待测靶标核酸，设计靶点特异性的crrna，根据设计的crrna序列，再构建crrna体外转录载体并进行体外转录和纯化，或者直接合成；

(2)针对步骤(1)所述的待测靶标核酸的靶点设计rpa上下游引物；

(3)将上述纯化后的crrna体外转录产物或合成的crrna分子、lbacas12a、报告单链dna分子，rpa上下游引物，冻干rpa反应微球，醋酸镁、rehydrationbuffer(rpa无引物再水合缓冲液)与待测靶标核酸以适当比例混合于适当体系中进行反应；

(4)反应产物通过侧流免疫层析试纸或荧光检测获得检测结果。

优选的，步骤(1)所述的待测靶标核酸为dna；

优选的，步骤(1)中所述的将设计的crrna序列的合成方法为：构建crrna体外转录载体并进行体外转录和纯化，或直接化学合成，但不限于此。

优选的，步骤(3)中所述的lbacas12a可以由重组表达和纯化获得或使用neblbacase12a产品；

优选的，步骤(3)中的报告单链dna分子设计：用于侧流免疫层析试纸检测时，两端分别带有fam和biotin基团的12碱基随机序列单链dna分子5′-fam-nnnnnnnnnnnn-biotin-3′，但不限于此；

用于荧光检测时，两端分别带有fam和bhq1基团的12碱基随机序列单链dna分子5′-fam-nnnnnnnnnnnn-bhq1-3′，但不限于此。

优选的，步骤(3)所述的反应体系为20μl体系，包含50～250nmlbacas12a，100～500nmcrrna，1000nm报告单链dna分子，10urnaseinhibitor(takara)，2μl待测靶标核酸，1×rehydrationbuffer(rpa无引物再水合缓冲液)，冻干rpa反应微球，rpa上下游引物各0.48μm，14mm醋酸镁；其中，lbacas12a与crrna的摩尔比为1：2。

优选的，步骤(3)所述的反应体系配制方法为先配制18μl包含待测靶标核酸，rehydrationbuffer(rpa无引物再水合缓冲液)，冻干rpa反应微球，rpa上下游引物，醋酸镁的mixa，37℃孵育0.5～10分钟，加入lbacas12a，crrna，报告单链dna分子，rnaseinhibitor并定容至20μl。

优选的，步骤(3)中所述的反应的条件为37℃反应1～1.5小时；更优选为1小时。

优选的，步骤(4)中侧流免疫层析试纸的设计：测流免疫层析试纸采用商业化mileniahybridetect1(twistdx，cambridge，uk)试纸，在侧流免疫层析试纸上依次有上样区，gold-np抗fitc抗体区，strepavidin条带(即control条带)，抗抗体条带(即检测条带)。

优选的，步骤(4)中的侧流免疫层析试纸的检测方法为将步骤(3)检测反应体系按体积比1：5稀释于hybridetectassaybuffer，将试纸上样区浸泡至上述稀释后的样本中，室温下反应5分钟即可见检验条带。

优选的，步骤(4)中的荧光检测所用的检测装置可以为常用的酶标仪或任何能在fam荧光通道上进行荧光激发并检测的荧光检测装置；

更优选的，步骤(4)中的荧光检测采用的检测条件为使用波长492nm的激发光激发荧光，在波长522nm处检测荧光强度。

一种靶标核酸分子的检测试剂盒，包括检测目标核酸特异性crrna序列、lbacas12a、报告单链dna分子、冻干rpa反应微球、醋酸镁、rehydrationbuffer(rpa无引物再水合缓冲液)、rpa上下游引物。

本发明的机理是：

lbacas12a蛋白是来自lachnospiraceaebacteriumnd2006细菌crispr系统的一个dna酶。lbacas12a酶在crrna引导下可以特异性识别指定序列并激活产生非特异性单链dna酶切活性。对于特定的核酸保守序列，利用crispr/cas12a的单链dna酶切特异性切割报告分子，报告分子的断裂使分子两端荧光基团和猝灭基团分离，发出荧光，即实现目标核酸的检测。

链置换酶聚合酶扩增技术(rpa)是一种实现条件简单，快速灵敏的恒温扩增技术。rpa反应的最适温度在37℃～42℃之间，无需变性，在常温下即可进行。这无疑能大大加快pcr的速度。此外，由于不需要温控设备，rpa可以真正实现便携式的快速核酸检测。rpa检测的灵敏度很高，能够将痕量的核酸(尤其是dna)模板扩增到可以检出的水平。而且rpa无需复杂的样品处理，适用于无法提取核酸的实地检测。rpa既可以扩增dna也可以扩增rna。利用上述cas12a识别特定核酸序列并激发非特异性单链dna剪切活性的原理，可以以cas12a系统报告rpa恒温扩增产物，实现快速便捷灵敏的特异性核酸检测。

本发明以合适的分子修饰dna单链作为报告分子，根据荧光猝灭原理，通过荧光的激发指示报告分子的切割，进而指示检测结果。或者通过修饰分子设计，配合侧流免疫层析试纸，实现肉眼检测而不需要特殊的仪器。

通过适当的体系设计结合rpa恒温扩增体系和cas12a靶向反应体系，使恒温扩增和cas12靶向反应同时进行，以缩短检测时间。

本发明通过设计特异性crrna及rpa引物，结合lbacas12a蛋白可以实现在缺乏实验条件的情况下，对核酸进行快速的检测区分，其中通过侧流试纸方法可以实现不需要仪器的肉眼结果读取。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

本发明利用crrna的特异性有效保证对对检测的正确度，且常温下1～2小时之内即可通过试纸或荧光确定检测样品中是否含有检测核酸，相比传统的检测方法精确度，操作简便度有所提高。本发明可以形成配有纯化的冻干lbacas12a，crrna及rpa体系试剂盒，可以在现场方便快速地对特定序列的核酸片段进行检测，且不需要复杂的控温仪器如pcr仪和其他电泳离心等设备，只需要一个恒温装置和荧光检测设备甚至只需要肉眼观测即可快速灵敏地检测特定序列核酸。

附图说明

图1是在10^-14m，10^-15m的核酸浓度下本发明中侧流免疫层析试纸方法的检测结果，另设有不加靶标核酸的空白对照组bc；1：bc，2：10^-14m，3：10^-15m。

图2是在10^-9m，10^-11m，10^-13m，10^-15m，10^-17m，0m的核酸浓度下本发明荧光方法的检测结果。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

下列实施例中未注明具体实验条件的试验方法，通常按照常规实验条件或按照制造厂所建议的实验条件。

实施例1

本发明实施例中，基于crispr/cas12a技术现场快速侧流免疫层析试纸检测核酸，该方法用于非诊断或治疗目的，包括如下步骤：

1)设计并转录crrna：在待测靶标核酸序列中寻找符合tttn18n原则的crrna靶向序列(如seqidno：1)，并从中确定crrna序列。在靶向序列两端200bp内设计rpa上下游扩增引物(如seqidno：2～3)。

crrna体外转录的方法为：在以下体系中37℃反应16小时：nuclease-freewater加至20μl，ntp各1.5μl，10×reactionbuffer1.5μl，templatedna1μg，t7rnapolymerasemix1.5μl。

crrna纯化方法：20μl体外转录产物与160μlnuclease-freewater及20μl3m醋酸铵混合，使用1：1苯酚氯仿混合液萃取，去除有机相，用氯仿重复萃取两次，收集水相至新的无酶1.5ml离心管，加入两倍体积(400μl)无水乙醇混合均匀，-20℃保温30分钟以沉淀rna，10000g离心10分钟收集rna沉淀，弃去上清，用冷的75％乙醇漂洗沉淀两次，离心收集沉淀，弃去上清，用50μl0.1mmedta溶液溶解rna沉淀获得rna溶液。

2)报告单链dna分子的设计：两端分别带有fam和bhq1基团的12碱基随机单链dna分子5′-fam-nnnnnnnnnnnn-biotin-3′(如seqidno：4)。

3)将上述纯化后的crrna体外转录产物、待测靶标核酸、neblbacas12a、报告单链dna分子以适当比例混合于适当体系中进行反应。

4)反应体系为：20μl体系中，250nmlbacas12a，500nmcrrna，1μm报告单链dna分子，10urnaseinhibitor(takara)，2μl待测靶标核酸，rpa上下游引物各0.48μm，1×rehydrationbuffer(rpa无引物再水合缓冲液)，冻干rpa反应微球，14mm醋酸镁。反应体系在37℃反应1小时。

5)反应体系配制方法为先配制18μl包含待测靶标核酸，rehydrationbuffer(rpa无引物再水合缓冲液)，冻干rpa反应微球，rpa上下游引物，醋酸镁的mixa，37℃孵育0.5～10分钟，加入lbacas12a，crrna，报告单链dna分子，rnaseinhibitor并定容至20μl。

6)反应产物通侧流免疫层析试纸测获得检测结果：将检测反应体系20μl与100μlhybridetect1assaybuffer充分混匀，将hybridetect1试纸上样区浸泡至上述混合液中室温孵育5min，肉眼读取试纸条带以获得检测结果。

结果如图1所示，表明靶标核酸浓度在10^-15m及以上通过本核酸检测方法可以得到阳性结果。

实施例2

本发明实施例中，基于crispr/cas12a技术现场快速荧光检测核酸，该方法用于非诊断或治疗目的，包括如下步骤：

1)设计并转录crrna：在待测靶标核酸序列中寻找符合tttn18n原则的crrna靶向序列(如seqidno：1)，并从中确定crrna序列。在靶向序列两端200bp内设计rpa上下游扩增引物(如seqidno：2～3)。

crrna体外转录的方法为：在以下体系中37℃反应16小时：nuclease-freewater加至20μl，ntp各1.5μl，10×reactionbuffer1.5μl，templatedna1μg，t7rnapolymerasemix1.5μl。

crrna纯化方法：20μl体外转录产物与160μlnuclease-freewater及20μl3m醋酸铵混合，使用1：1苯酚氯仿混合液萃取，去除有机相，用氯仿重复萃取两次，收集水相至新的无酶1.5ml离心管，加入两倍体积(400μl)无水乙醇混合均匀，-20℃保温30分钟以沉淀rna，10000g离心10分钟收集rna沉淀，弃去上清，用冷的75％乙醇漂洗沉淀两次，离心收集沉淀，弃去上清，用50μl0.1mmedta溶液溶解rna沉淀获得rna溶液。

2)报告单链dna分子的设计：两端分别带有fam和bhq1基团的12碱基随机单链dna分子5′-fam-nnnnnnnnnnnn-bhq1-3′(如seqidno：5)。

3)将上述纯化后的crrna体外转录产物、待测靶标核酸、neblbacas12a、报告单链dna分子以适当比例混合于适当体系中进行反应。

4)反应体系为：20μl体系中，50nmlbacas12a，100nmcrrna，1μm报告单链dna分子，10urnaseinhibitor(takara)，2μl待测靶标核酸，rpa上下游引物各0.48μm，1×rehydrationbuffer(rpa无引物再水合缓冲液)，冻干rpa反应微球，14mm醋酸镁。反应体系在37℃反应1小时。

5)反应体系配制方法为先配制18μl包含待测靶标核酸，rehydrationbuffer(rpa无引物再水合缓冲液)，冻干rpa反应微球，rpa上下游引物，醋酸镁的mixa，37℃孵育0.5～10分钟，加入lbacas12a，crrna，报告单链dna分子，rnaseinhibitor并定容至20μl。

6)反应产物通过荧光检测获得检测结果，设定激发光波长为492nm，检测光波长为522nm。

结果如图2所示，表明靶标核酸浓度在10^-17m及以上通过本核酸检测方法可以得到阳性结果。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110>华南理工大学

<120>一种基于crispr/cas和恒温扩增的一步法核酸检测方法和试剂盒

<160>5

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>21

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

tttacatgagtacgagtagta21

<210>2

<211>31

<212>dna

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