一种促进抗菌多肽短杆菌肽合成的培养基及其培养方法与流程

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种促进抗菌多肽短杆菌肽合成的培养基及其培养方法。

背景技术：

短短芽孢杆菌属中的短短芽孢杆菌(brevibacillusbrevis)能合成短杆菌肽(lineargramicidin)、短杆菌酪肽(cyclopeptidetycocidine)等多种多肽抗生素。由于多肽抗生素抗菌活性高，抗菌谱广，种类多，可供选择的范围广，靶菌株不易产生抗性突变等原因，在医药工业上有着广阔的应用前景。

常规多选用营养琼脂培养基(namedium)用于培养短短芽孢杆菌的固体培养，而选用营养肉汤培养基(nbmedium)用作液体培养。常规na、nb培养基培养短短芽孢杆菌短杆菌肽(lineargramicidin)和短杆菌酪肽(cyclopeptidetycocidine)产量较低，而且产量不稳定。

经无数次研究发现：将短短芽孢杆菌atcc8185接种到脱脂乳培养基(skimmilkmedium)预培养，再接种到牛肉膏培养基中37℃，培养24小时有利于诱导短杆菌酪肽(cyclopeptidetycocidine)的合成。目前，对短短芽孢杆菌中促进多肽抗生素线性短杆菌肽(lineargramicidin)合成的培养基及培养条件研究较少，存在培养方式复杂等不足，迫切需要筛选合适的培养基以及改进培养方式以提高其合成产量，促进其提取纯化及开发应用。

技术实现要素：

为了解决上述问题，制备出合适的培养基以至于提高多肽抗生素线性短杆菌肽的合成产量，进而促进线性短杆菌肽的提取纯化及开发利用，本发明的研究人员多年来致力于线性短杆菌肽的合成培养研究，成功研制出一种能促进线性短杆菌肽高效合成的sam液体培养基，并提出sam液体培养基的制备方法及其配套培养方法。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种促进抗菌多肽短杆菌肽合成的培养基，所述培养基的ph值为7.0，包括以下原料组成：

碳源15～25份、氮源2～3份、k2hpo41～3份、mgso4·7h2o1～3份。

优选的，所述培养基的ph值为7.0，包括以下原料组成：

碳源20份、氮源2份、k2hpo41份、mgso4·7h2o1份。

优选的，所述碳源为蔗糖或甘油或两者的组合物。

进一步地，所述碳源选用蔗糖与甘油的组合物时，两者的组合比为5:1～2。

优选的，所述氮源为天冬酰胺或脯氨酸。

优选的，所述培养基在线性短杆菌肽合成培养上的培养温度为30～35℃，培养时间为45～50h。

优选的，所述培养基在线性短杆菌肽合成培养上的培养温度为32℃，培养时间为48h。

优选的，所述培养基制备方法如下：

a、预算需要制备的液体培养基的总体积；

b、称取所需重量份碳源、氮源、k2hpo4溶解于占预算总体积4/5的双蒸水中，混合溶解完全，摇匀，配制得溶液a；

c、称取所需重量份的mgso4·7h2o，溶解于占预算总体积1/5的双蒸水中，溶解完全，摇匀，配制得溶液b；

d、将溶液a与溶液b分别进行118～123℃的高压灭菌，灭菌时间分别为20～30min；灭菌结束后放置超净工作台自然冷却至室温，将两者混合均匀，即得成品sam液体培养基。

在本发明中，所述多肽抗生素线性短杆菌肽在sam培养基中的培养方法如下：

s1、菌种活化：从-80℃超低温冰箱中取出短短芽孢杆菌gzdf3菌种，吸取5μl于lb固体培养基上，三区划线法进行活化，37℃恒温培养过夜，挑取单菌落接种于50mllb液体培养基中，在温度37℃、200rpm的条件下摇床振荡培养24h；

s2、种子液培养：在超净工作台中，用移液枪取100μl步骤s1培养的短短芽孢杆菌gzdf3培养液，接种到100mlnb培养基中，在温度37℃、200rpm的条件下摇床振荡培养培养24h，获得种子液；

s3、大量培养：将上述种子液按5％的接种量接入装有150ml发酵培养基sam的锥形瓶中，培养基容积为300ml，在温度32℃、200rpm的条件下摇床发酵培养48h，即可获得大量的多肽抗生素线性短杆菌肽。

本发明的有益效果是：

与现有技术相比，成品sam液体培养基能大大促进多肽抗生素线性短杆菌肽合成酶编码基因在培养基中的表达，表达量约是常规nb液体培养基的7～9倍，大幅度提高线性短杆菌肽的合成量，所培养出的线性短杆菌肽能满足研究需求，促进线性短杆菌肽的提取纯化与开发应用；

同时，本发明提供的培养基在制备过程中，硫酸镁溶液单独配制，有效提高了成品sam液体培养基的特性，提升线性短杆菌肽在sam液体培养基上的合成效果。

附图说明

图1为本发明实施例中的抑菌活性对比图。

图中，a—牛肉膏蛋白胨培养基，即nb培养基培养线性短杆菌肽上清过滤液对白色念珠菌抑菌圈；

b—本发明中sam培养基培养线性短杆菌肽上清过滤液对白色念珠菌抑菌圈。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进一步作详细的说明，但本发明提供的技术方案不仅包括实施例中展现的内容。

实施例1

本实施例配制1lsam液体培养基，配制方法如下：

步骤一、称取蔗糖15g、天冬酰胺2g、k2hpo41g溶解于800ml双蒸水中，混合溶解完全，摇匀，配制得溶液a；

步骤二、称取所需重量份的mgso4·7h2o1g，溶解于200ml双蒸水中，溶解完全，摇匀，配制得溶液b；

步骤三、将溶液a与溶液b分别进行121℃的高压灭菌，灭菌时间分别为25min；灭菌结束后自然冷却至室温，将两者混合均匀，调节ph值至7.0，即得成品sam液体培养基。

实施例2

本实施例配制1lsam液体培养基，配制方法如下：

步骤一、称取甘油25g、脯氨酸3g、k2hpo41g溶解于800ml双蒸水中，混合溶解完全，摇匀，配制得溶液a；

步骤二、称取所需重量份的mgso4·7h2o2g，溶解于200ml双蒸水中，溶解完全，摇匀，配制得溶液b；

步骤三、将溶液a与溶液b分别进行123℃的高压灭菌，灭菌时间分别为22min；灭菌结束后自然冷却至室温，将两者混合均匀，调节ph值至7.0，即得成品sam液体培养基。

实施例3

本实施例配制1lsam液体培养基，配制方法如下：

步骤一、称取蔗糖20g、脯氨酸2g、k2hpo42g溶解于800ml双蒸水中，混合溶解完全，摇匀，配制得溶液a；

步骤二、称取所需重量份的mgso4·7h2o1g，溶解于200ml双蒸水中，溶解完全，摇匀，配制得溶液b；

步骤三、将溶液a与溶液b分别进行118℃的高压灭菌，灭菌时间分别为30min；灭菌结束后自然冷却至室温，将两者混合均匀，调节ph值至7.0，即得成品sam液体培养基。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，任何未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。

培养实验

在本发明中，分别选用实施例1、实施例2、实施例3制备的sam液体培养基进行线性短杆菌肽的合成培养，并选用nb液体培养基作参照组，具体培养方法及培养结果如下：

s1、菌种活化：从-80℃超低温冰箱中取出短短芽孢杆菌gzdf3菌种，吸取5μl于lb固体培养基上，三区划线法进行活化，37℃恒温培养过夜，挑取单菌落接种于50mllb液体培养基中，在温度37℃、200rpm的条件下摇床振荡培养24h；

s2、种子液培养：在超净工作台中，用移液枪取100μl步骤s1培养的短短芽孢杆菌gzdf3培养液，接种到100mlnb培养基中，在温度37℃、200rpm的条件下摇床振荡培养培养24h，获得种子液；

s3、大量培养：将上述种子液按5％的接种量接入装有150ml发酵培养基sam的锥形瓶中，培养基容积为300ml，在温度32℃、200rpm的条件下摇床发酵培养48h，即得大量成活的线性短杆菌肽；

s4、参照组培养：选择nb液体培养基替换sam液体培养基，重复s1、s2、s3的培养步骤，进行线性短杆菌肽在nb培养基中的发酵培养；

s5、短短芽孢杆菌中的线性短杆菌肽合成酶基因表达量测定：

收集大量培养结束的nb培养发酵液和sam培养的发酵液，离心收集菌体。采用同位素相对标记和绝对定量技术分析两种培养基培养菌体中的线性短杆菌肽合成酶的表达，并准确进行相对或绝对定量。

短短芽孢杆菌中线性短杆菌肽合成基因簇包括lgra、lgrb、lgrc、lgrd4个合成酶基因。经过itraq技术分析，4个线性短杆菌肽合成酶在nb培养基培养菌体与sam培养基培养菌体中的表达结果见表1所示，统计分析结果见表2所示。

表1：4个短杆菌肽合成酶在nb培养基与sam培养基培养菌体中的表达情况如下：

表1

表2：4个短杆菌肽合成酶在nb培养基与sam培养基培养菌体中的表达分析结果：

表2

由表1和表2的统计结果显示，短短芽孢杆菌中的线性短杆菌肽lineargramicidin合成基因簇中lgra、lgrb、lgrc、lgrd4个合成酶在nb培养基中表达量相对较低，而在sam培养基培养的菌体中，lgra、lgrb、lgrc、lgrd合成酶表达均为上调，其中尤以lgra表达上调最大，约7.5倍。表明sam培养基能大大促进短杆菌肽lineargramicidin的合成。

s6、抑菌实验：

为进一步验证sam培养基能促进线性短杆菌肽lineargramicidin的合成。采用琼脂打孔法研究nb培养上清液及sam培养上清液对白色念珠菌的抑菌活性，验证方法如下：

a、将病原真菌白色念珠菌candidaalbicans接种于pda固体培养基中活化，挑取单菌落，接种于pda液体培养基中，在温度28℃，200rpm的条件下振荡培养24h，制得孢子悬液备用；

b、取种子液按5％的接种量接入到150mlsam液体培养基中，于温度32℃，200rpm的条件下摇床上摇48h后，于12000rpm的转速下离心10min，取上清液，通过0.22μm的微孔滤膜过滤除菌备用；

c、琼脂打孔法：步骤a中培养好的孢子悬液均匀涂布于pda平板上，每个平板分别用打孔器在距离平板中央2cm处打孔，直径8mm，每板打2个孔，分别在每孔加入150μlnb培养上清过滤液及sam上清过滤液，于28℃的温度下恒温培养2d后，测量抑菌圈大小。

所述抑菌圈结果如图1所示。

通过上述培养实验分析和抑菌实验分析，可明确得知成品sam液体培养基能大大促进线性短杆菌肽合成酶编码基因在培养基中的表达，表达量约是常规nb液体培养基的7～9倍，大幅度提高线性短杆菌肽的合成量；同时，所述sam液体培养基的培养上清对白色念珠菌的抑菌效果也完全优异于常规nb培养基，即sam液体培养基对线性短杆菌肽的合成表达效果大大优于常规nb培养基。

综上所述，与现有技术相比，本发明提供的能促进线性短杆菌肽高效合成的sam液体培养基比常规的nb等培养基对线性短杆菌肽的合成促进效果高出很多，在培育线性短杆菌肽合成方面，其能所起到的作用是常规nb等培养基所不能达到的。