一种对在微载体上培养的细胞进行取样计数的方法与流程

本发明涉及细胞培养领域，具体涉及一种对在微载体上培养的细胞进行取样计数的方法。

背景技术：

动物细胞的大规模工业化培养技术对于生物制药、疫苗生产、细胞治疗等生物行业至关重要。传统的二维细胞培养方法，有着诸多的不便利因素，例如所需空间大，产量低，不易控制等，这使得大规模培养动物细胞受到制约。微载体细胞培养技术的出现使得工业化生产动物细胞的过程简便起来，是目前公认的最有发展前途的一种培养模式。虽然这门新兴的细胞培养技术是未来医学、制药等领域的热门应用技术，但是目前还存在一些需要优化和改进的方面。其中，细胞在微载体上悬浮培养的过程中，取样计数就是一个需要优化和提高精确性的程序。

传统上对于培养中的微载体上的细胞，计数要求是取均匀悬浮培养的微载体培养基悬液,然后分离微载体上的细胞再进行计数。这一取样的过程对均一性要求极高，并且每一次取样的过程和手法要保持稳定，然而因为微载体的密度比培养基大很多，容易出现沉降，在实际取样过程中很难保证微载体均匀悬浮于培养基中，因此虽然同样吸取同等体积的混悬液，其中的微载体含量会因原液不是均质的混悬液而有所偏差。而在细胞产业中一般采用大体积的生物反应器等仪器对细胞进行大规模培养，这类培养工艺更加不容易均匀采样，进而导致按照悬液体积进行细胞计数和换算整个培养体系中的细胞数量和真实的细胞数量存在很大误差，造成细胞计数不准确，无法精确地测量细胞的生长情况。因此，开发出一个新的取样计数方法对于应用微载体悬浮培养细胞非常重要。

技术实现要素：

本发明提供一种新的采样思路，不以微载体和培养基的混合体积为标定进行采样和换算培养体系中的细胞数，而是要求采样者确保采集的样本中的微载体含量一致，且与标准重量的微载体体积一致，从而实现精准采样的结果。本发明可以通过使用带有固定刻度的微载体取样管，在使用微载体悬浮培养细胞时，可以应用该取样管对于培养基中悬浮的微载体进行取样，即每次取样时只需将微载体沉淀加到取样管的标示刻度处即可，从而提高了取样的一致性和细胞计数的准确性。

第一方面，本发明要求保护一种对在微载体上培养的细胞进行取样的方法。

本发明所要求保护的对在微载体上培养的细胞进行取样的方法，叫做微载体定量取样法，其可包括如下步骤：

(a1)称取一定重量的用于细胞培养的微载体，放入取样管，加入液体以模拟细胞培养过程，在4-60℃浸泡0-24小时后，在所述取样管上标定所述微载体占据的体积所对应的刻度，作为标准刻度；

(a2)按照如下对在所述微载体上培养的细胞进行取样：用所述取样管从细胞培养体系中对所述微载体进行采样，使所述微载体的体积达到所述标准刻度处。

第二方面，本发明要求保护第一方面中所述的方法的如下用途：对在所述微载体上培养的细胞进行细胞总数和/或细胞密度的计算。

第三方面，本发明要求保护一种对在微载体上培养的细胞进行总数和/或密度的计算的方法。

本发明所要求保护的对在微载体上培养的细胞进行总数和/或密度计算的方法，可包括如下步骤：

(a1)称取一定重量的用于细胞培养的微载体，放入取样管，加入液体以模拟细胞培养过程，在4-60℃浸泡0-24小时后，在所述取样管上标定所述微载体占据的体积所对应的刻度，作为标准刻度；

(a2)按照如下对在所述微载体上培养的细胞进行取样：用所述取样管从细胞培养体系中对所述微载体进行采样，使所述微载体的体积达到所述标准刻度处；

(a3)对(a2)中收集的所述微载体中的细胞进行计数；

(a4)根据(a1)中所称取的所述微载体的重量、(a3)中计得的细胞数目，以及整个细胞培养体系中所述微载体的总重量，计算可得到整个细胞培养体系中细胞的总数；进而得到细胞密度。

在第一方面和第三方面中，步骤(a1)中，向装有微载体的取样管中加入液体4-60℃浸泡0-24小时的过程为微载体的充分浸泡溶胀过程。

其中，加入的所述液体可为与本发明用于在所述微载体上进行细胞培养的培养基的粘稠度、亲水性、ph、离子浓度相同或相似的液体(如本发明用于细胞培养的培养基或pbs)。

将所述微载体进行浸泡溶胀时的温度和时间，根据不同的微载体，溶胀要求不同。可以根据不同厂家的微载体说明书进行。比如，使用ge的微载体cytodex1，干燥的微载体在pbs中在室温下浸泡膨胀至少3小时，比例为30-50ml/g。再比如使用北京华龛生物科技有限公司的3dflotrix微载体(货号cnf-f01t-50)在pbs中室温下浸泡溶胀0.5-24小时；具体可为6小时，比例为10～1000μl：1mg；具体可为10μl：1mg、10～15μl：1mg、5～15μl：1mg或250～350μl：1mg。

在第一方面和第三方面中，步骤(a1)中，在将所述微载体在所述液体中浸泡后，还包括自然沉淀或离心沉淀(如1500rpm离心2分钟)的步骤。目的是使所述微载体尽快沉淀下来。

在第一方面和第三方面中，步骤(a2)中，用所述取样管从细胞培养体系中对所述微载体进行采样可按照包括如下步骤的方法进行：吸取细胞培养体系中的悬液，加入到所述取样管，待所述微载体自然沉淀或经离心沉淀(离心为了加快沉淀，所述离心的速率可为50～1610×g，具体可为200×g，时间可为1～10min，具体可为2min)后，观察所述微载体体积是否达到步骤(a1)标定的标准刻度，如果未达到则继续吸取悬液直至达到所述标准刻度，如果超出则从所述取样管中取出多余的所述微载体。

在第一方面和第三方面中，步骤(a3)中，对(a2)中收集的所述微载体中的细胞进行计数可按照包括如下步骤的方法进行：将(a2)中的所述取样管离心(如200×g离心2分钟)，弃除上清，向沉淀中加入细胞消化液将细胞从所述微载体上消化下来，然后计数。

在第一方面和第三方面中，步骤(a4)中，整个细胞培养体系中细胞的总数等于(a3)中计得的细胞数目乘以所述微载体的总重量比上(a1)中所称取的所述微载体的重量。

在第一方面和第三方面中，步骤(a4)中，总数除以所述微载体总重量或者总个数或者培养体系的总体积获得不同单位的细胞密度，如细胞/mg微载体、细胞/个微载体、细胞/ml培养体系。

在本发明中，所述细胞具体可为动物贴壁细胞。

在本发明的具体实施方式中，所述细胞具体为间充质干细胞。

在本发明的具体实施方式中，所述微载体为北京华龛生物科技有限公司的3dflotrix微载体(货号cnf-f01t-50)。

在本发明的具体实施方式中，所述取样管具体为1.5ml微型离心管。

在本发明的具体实施方式中，步骤(a1)中称取的所述微载体的重量为5mg；所述取样管为1.5ml微型离心管；所述标准刻度为0.1ml刻度线；细胞培养体系中的所述微载体的重量为200mg，初始培养的细胞数为200万，培养体系中的培养基为60ml；取样于细胞培养72h后进行。

实验证明：与传统的悬液定量取样法相比，利用本发明所提供的微载体定量取样法对微载体培养体系中的细胞进行计数的三个样品重复性较好(方差较小)，且与实际总数非常接近。

附图说明

图1为5mg微载体达到的刻度正好符合1.5ml微型离心管上的0.1ml的刻度。

图2为悬液定量取样法吸取的1ml悬液自然沉淀后的状态。a1-a3表示三次重复。

图3为本发明微载体定量取样法吸取的悬液自然沉淀后的状态。b1-b3表示三次重复。

图4为悬液定量取样法和微载体定量取样法所得细胞总数与实际情况的比较结果。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中所涉及的微载体为北京华龛生物科技有限公司的3dflotrix微载体(货号cnf-f01t-50)。

下述实施例中所涉及的细胞为间充质干细胞。

实施例1、微载体定量取样法的建立及应用

设计构思：本发明通过测量一定重量的微载体的体积，标定出一个标准刻度后，在使用微载体培养细胞时，要求进行采样的微载体体积(与培养基体积无关联)达到标准刻度后，进行细胞计数再换算到整个培养体系中获取总的细胞数，此方法为微载体定量取样法。

具体方案举例：

1、称取5mg微载体加入1.5ml取样管(微型离心管)中，溶于1mlpbs中，充分浸泡溶胀后，经过1500rpm，2分钟离心，标定微载体在取样管中占据的体积。本实施例中发现5mg微载体经过沉淀后，达到的刻度正好符合1.5ml取样管上的0.1ml的刻度(图1)。

2、将200万个细胞重悬于60ml培养基后，加入200mg微载体，在37^℃，5％co2培养箱进行培养。

3、72小时后，采用两种取样方法，具体如下：

(a)通过摇晃培养容器将微载体尽量均匀地悬浮于60ml培养基中，而后尽快吸取1ml悬液加入1.5ml取样管中。共吸取3管(如图2)。此为悬液定量取样法。

(b)通过摇晃培养容器将微载体悬浮于培养基中，吸取悬液加入1.5ml取样管中，等待数分钟后，微载体沉淀，观察微载体体积是否达到步骤1中标定的标准刻度，本实施例采用0.1ml的标准刻度(对应5mg微载体，图1)。如果未达到则继续吸取悬液直至达到刻度，如果超出则从取样管中取出多余微载体。共吸取3管(如图3)。此为微载体定量取样法。

4、将上述取样管经过1500rpm，2分钟离心，弃除上清，加入细胞消化液将细胞从微载体上消化下来后，进行计数后，根据取样法的不同按照相应的公式反推培养体系中的总细胞数量。

(a)悬液定量取样法：1ml悬液样品的细胞数量×培养体系总悬液体积(即60ml)＝总细胞数量。

结果如表1所示。

表1悬液定量取样法三次重复所得细胞总数统计结果

(b)微载体定量取样法：5mg微载体(即0.1ml微载体体积)样品的细胞数量×培养体系的总微载体重量(即200mg)＝总细胞数量。

结果如表2所示。

表2微载体定量取样法三次重复所得细胞总数统计结果

5、将200mg微载体，60ml培养基的培养体系中的所有微载体悬液取出，经过1500rpm，2分钟离心，弃除上清，加入细胞消化液将细胞从微载体上消化下来后，进行计数得到实际总数后，与步骤4中的取样计数的数据进行对比。

结果如图4所示。结果显示微载体定量取样法的三个样品重复性较好(方差较小)而与实际总数更为接近。