一种脱氮副球菌菌株筛选及其在除臭中的应用的制作方法

本发明属于微生物
技术领域：
，具体涉及一种脱氮副球菌菌株筛选及其在除臭中的应用。
背景技术：
：恶臭污染物是指一切刺激嗅觉感官引起人们不愉快及损害生活环境的气体物质，其物质种类繁多，影响范围大，其治理也逐渐得到人们的重视。禽畜粪便及生活垃圾中存在大量的除臭微生物，在垃圾填埋和堆肥过程中会产生大量的氨气和硫化氢，不仅对人的身体造成严重危害，还污染环境、污染地下水源等。目前常规的除臭方法有：物理除臭法、化学除臭法、生物除臭法。物理除臭法是依靠固、液、气三相之间的转化消除恶臭气味，仅仅只降低了嗅觉对气味的感知程度，然而其化学性质没有根本改变。化学除臭法是添加某些化学试剂，改变其化学结构以破坏其除臭基团，转变为无臭味或臭味较低的物质。生物法是近年来开发的一种新型的恶臭处理方法，因其投资和运行成本低、处理效率高、不产生二次污染等优点，正逐步发展成除臭的主流方法。生物法包括生物洗涤法、生物滤池法和生物滴滤法。与其他两种方法相比，生物滴滤塔可精确控制反应条件(如湿度、ph等)，明显的提高了脱除效率。在堆肥厂、垃圾填埋场、养殖场除臭过程中，将高效菌剂接入到脱臭反应器中，能够快速的脱除臭气，做到无异味，无二次污染等，是堆肥除臭，垃圾填埋场等环境净化的较好选择，可以广泛推广应用。技术实现要素：本发明的目的是提供一株可以高效脱氮脱硫的脱氮副球菌，该菌株具有良好的降解氨氮、硝氮及硫化物的能力。不仅可用于降解处理含氨氮、硝氮及无机硫化物的废水，同时可适用于生物滴滤反应器用于处理氨气、硫化氢等有毒有害气体。为实现上述发明目的，本发明所采用的技术方案是：一种脱氮副球菌，菌种名称：脱氮副球菌，paracoccusdenitrificansts-1，保藏编号：cgmccno.17605。优选的，所述脱氮副球菌ts-1的16srdna序列如seqidno.1所示。优选的，所述脱氮副球菌在除臭中的应用。优选的，所述脱氮副球菌在除臭中的应用，具体步骤为：(1)将脱氮副球菌ts-1培养为脱氮副球菌ts-1菌液，所述菌液中脱氮副球菌ts-1的活菌量为108～109cfu/ml；(2)将为脱氮副球菌ts-1生长提供所需营养的溶液加入装有填料的生物滴滤塔中，然后加入步骤(1)所得的脱氮副球菌ts-1菌液；(3)以4～6l/min的空气流速、气体浓度40～60mg/m3的硫化氢进气量及气体浓度40～60mg/m3的氨气进气量向生物滴滤塔中同时通入空气、硫化氢及氨气，在环境温度25～27℃、ph6.5～7.5、湿度38％～45％的条件下挂膜驯化6～8d；(4)挂膜驯化完成后向生物滴滤塔中通入待处理气体。优选的，所述步骤(1)中，将脱氮副球菌ts-1培养为脱氮副球菌ts-1菌液的条件为培养温度为27～33℃、培养基ph为6.0～7.0且培养基中c/n为12～18。优选的，所述步骤(1)中，将脱氮副球菌ts-1培养为脱氮副球菌ts-1菌液的条件为培养温度为30℃、培养基ph为6.5且培养基中c/n比为15。优选的，所述步骤(4)中，在通入待处理气体的同时向生物滴滤塔内加入为脱氮副球菌ts-1生长提供所需营养的溶液。优选的，所述脱氮副球菌在无水处理中的应用。本发明具有以下有益效果：1、发明涉及的脱氮副球菌ts-1的营养类型为兼性营养型，在异养条件下实现菌体的快速繁殖，在自养条件下实现高效脱硫。利用有机碳源异养培养基对菌株进行扩大培养获得高密度菌体，不仅可在异养环境下高效降解氨氮，同时可在自养条件下实现对硫化物的氧化降解。2、本发明涉及的脱氮副球菌ts-1具有很快的氨氮降解速率，在最适条件下10h可降解170mg/l氨氮，降解速率可达17.0mg/(l﹒h)。3、本发明涉及的脱氮副球菌ts-1具有较快的硝氮降解速率，该菌株可以在好氧条件下实现反硝化功能，将氨氮转化为硝氮后，再次降解硝氮生成氮气，达到对铵根离子的彻底去除。在其最适条件下，10h内可降解约167mg/l，即1.67mg/(l·h)。4、本发明涉及的脱氮副球菌ts-1的脱硫效率较快，在自养条件下6h内实现了100％的硫化物去除率，以及4.5h时单质硫最大转化率可达63.71％。5、本发明符合生物安全法规，该脱氮副球菌ts-1从被高氨氮高硫化物长期胁迫的选择环境中筛选得到，不会对周围环境和生态平衡造成危害。附图说明图1为本发明的脱氮副球菌ts-1在扫描电子显微镜下的细胞形态。图2为本发明的脱氮副球菌ts-1在异养lb培养基中培养的生长曲线。图3为本发明的脱氮副球菌ts-1在降解氨氮实验过程中氨氮降解率随时间的变化情况；图4为本发明的脱氮副球菌ts-1在降解硝氮实验过程中硝氮降解率随时间的变化情况；图5为本发明的脱氮副球菌ts-1在脱硫实验过程中硫化物去除率随时间的变化情况；图6为本发明的脱氮副球菌ts-1在脱硫实验过程中单质硫转化率随时间的变化情况；图7是本发明的脱氮副球菌ts-1脱硫形成的单质硫在扫描电子显微镜下的形态；图8脱氮副球菌ts-1的系统发育树。具体实施方式以下结合实施例详细说明本发明。实施方案方便于更好的理解本发明，但并非对本发明的限制。在下述实施例中涉及到的培养基为：活性污泥驯化培养基(/l)：kh2po41.0g，k2hpo44.0g，mgcl20.5g，feso40.01g,葡萄糖5.0g，氨氮及硫化物；其中氨氮及硫化物的添加量见下表：表一活性污泥驯化培养基(/l)中氨氮及硫化物添加量ⅰⅱⅲⅳⅴna2s1.02.03.04.05.0(nh4)2so40.81.62.43.24.0脱氮除硫培养基一(/l):葡萄糖5.0g，nacl2.0g，kh2po41.0g，mgcl20.5g，feso40.01g，(nh4)2so42.0g，na2s1.2g，用1mol/l的hcl溶液调节ph至7.0。脱氮除硫培养基二(/l)：nahs5g。lb培养基(/l)：胰蛋白胨10.0g，酵母提取物5.0g，nacl10.0g，ph7.0。所述lb培养基用于扩大培养。循环培养基(/l)：葡萄糖6g，kh2po41.0g，k2hpo41.0g，mgcl20.4g，nahco30.4g。实施例1：菌株筛选采集四川双流某污水处理厂二沉池活性污泥4l加入反应器中，并配以1l活性污泥驯化培养基进行曝气培养，按照设计好的浓度梯度由低浓度向高浓度分别以每个浓度处理5天、5天、5天、7天、8天为周期，由低浓度至高浓度驯化30天后完成驯化培养。取少量上清液于液体脱氮除硫培养基一中富集2天，重复4～5次后进行梯度稀释，从10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7稀释度下吸取0.2ml于脱氮除硫培养基一平板涂布，30℃恒温培养，经多次分离后获得多个菌落，挑取生长情况最好的单菌落于脱氮除硫培养基一培养，重复5次以上获得纯菌，该菌命名为ts-1。该菌的生理生化性质如下表：表2脱氮副球菌cgmccno.17605的生理生化性质检测项目检测结果检测项目检测结果革兰氏染色-v.p-菌体形状球形接触酶+氧化酶-m.r-淀粉水解+明胶+硝酸盐还原试验+好/厌氧性好氧葡萄糖-麦芽糖-l-阿拉伯糖-乳糖-木糖-油脂+注：“+”表示阳性，“-”表示阴性实施例2：菌株鉴定将分离纯化的菌株按照相同的接种量接种于脱氮除硫培养基一中，置于不同温度的摇床中(5℃、10℃、24℃、27℃、30℃、33℃、36℃、40℃、45℃、50℃)培养12h，通过测定od600确定菌株生长温度为10～50℃，最适生长温度为30℃。采取不同初始ph(3.0、4.0、5.0、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、9.0、10.0、11.0)在30℃下培养24h，测定od600确定该菌生长ph为4.0～10.0，最适生长ph为6.5。采取不同c/n(1、5、10、15、20、25、30)在ph为6.5、温度为30℃的条件下测量od600确定该菌株的耐受范围是c/n为5～25，最适c/n为15。将分离纯化的菌株在扫描电子显微镜(sem)下观察，结果如图1所示；该菌为短杆状、长0.5～0.9μm、宽0.4～0.7μm、无鞭毛；革兰氏染色鉴定该菌为阴性。采用细菌全基因组快速抽提试剂盒，提取纯菌株的全基因组，通过选用细菌16srdna通用引物27f和1492r进行pcr扩增，然后测序分析。测序结果经ncbi数据库中的blast比对，鉴定该菌株为脱氮副球菌，命名为paracoccusdenitrificansts-1，即为本发明的保藏菌株脱氮副球菌paracoccusdenitrificansts-1，于2019年4月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101，保藏编号为cgmccno.17605。对脱氮副球菌ts-1进行生长曲线研究，选用lb培养基进行培养，结果如附图2所示：脱氮副球菌ts-1可以在有机碳源异养培养基中快速生长，培养21h时菌液od600值就达到1.0288，42h后菌液od600值维持在1.23左右，并且平稳期长达72h。该菌株在异养培养基中繁殖增长快速，且稳定期较长。在工程应用中可以使用有机碳源异养培养基快速获得高密度菌体，不仅对高效快速去除废水中氨氮及硫化物有较强优势，在生物除臭滴滤塔中更是可以快速挂膜，快速启动，为工程除臭更是提供了较好菌源。实施例3：使用脱氮除硫培养基一进行脱氮除硫试验将100ml脱氮除硫培养基一溶液在灭菌锅中115℃条件先灭菌30min，然后按照5％接种量接入培养24h的脱氮副球菌菌液，用好氧塞塞住瓶口，置于摇床中震荡(30℃、200r/min)。对照组加入与接种量等量的无菌水，每个实验组设置三个重复，每隔2h测定氨氮、硝氮、亚硝氮浓度；每隔0.5h取样测定硫化物以及单质硫浓度，结果取平均值。与空白对照组相比，添加ts-1菌株的培养基内氨氮去除效率明显提高，在12h时氨氮降解率达到95.35％，空白对照组培养基内的氨氮浓度没有明显变化，其去除率仅为0.27％，说明该菌株具有较强的降解氨氮的能力。添加ts-1菌株的培养基初始硝氮约为70mg/l，在12小时内硝氮浓度可降至4mg/l，对硝氮的降解率为94.28％。空白对照组中的硝氮浓度在12h内并未下降反而些许升高，证明该菌反硝化效果显著。添加ts-1菌株的培养基硫化物浓度比对照明显降低，6h时硫化物去除率达到53％，12h是硫化物去除率达到98％。ts-1培养基中的单质硫在4.5h时其转化率已达到60％，最大单质硫生成量可达到486.58mg/l。对比于空白对照组中的硫化物和硫单质转化率可得知，空白对照组中的硫化物的去除只是单纯的物理性移除，并不是生物转化去除，而接种该脱氮副球菌的培养基中，硫化物发生了价态变化，证明其参与了生物反应。实施例4：使用脱氮除硫培养基二进行脱氮除硫试验将100ml脱氮除硫培养基二溶液在灭菌锅中115℃条件先灭菌30min，然后按照5％接种量接入培养24h的脱氮副球菌菌液，用好氧塞塞住瓶口，置于摇床中震荡(30℃、200r/min)，测定初始氨氮浓度为170mg/l，初始硫化物浓度为556mg/l。对照组加入与接种量等量的无菌水，每个实验组设置三个重复，每隔2h测定氨氮、硝氮、亚硝氮浓度；每隔0.5h取样测定硫化物以及单质硫浓度，结果取平均值。12h后其测定结果，如附图3～6所示。与空白对照组相比，添加ts-1菌株的培养基内氨氮去除效率明显提高，在12h时氨氮降解率达到99.6％，空白对照组培养基内的氨氮浓度没有明显变化，其去除率仅为0.27％，说明该菌株具有较强的降解氨氮的能力。附图4所示为该脱氮副球菌ts-1在降解硝氮实验过程中的各因素变化情况。添加ts-1菌株的培养基初始硝氮约为170mg/l，在10小时内硝氮浓度可降至3mg/l，对硝氮的降解率高达98.23％。空白对照组中的硝氮浓度在10h内并未下降反而些许升高，证明该菌反硝化效果显著。附图5所示为ts-1对培养基内硫化物的降解能力，可看出其硫化物浓度比对照明显降低，6h时硫化物去除率达到58％,12h时硫化物的去除率可高达100％。而附图6中也可发现ts-1培养基中的单质硫在4.5h时其转化率已达到66.7％，最大单质硫生成量可达到523.46mg/l。对比于空白对照组中的硫化物和硫单质转化率可得知，空白对照组中的硫化物的去除只是单纯的物理性移除，并不是生物转化去除，而接种该脱氮副球菌的培养基中，硫化物发生了价态变化，证明其参与了生物反应。综合实施例2和实施例3中的摇瓶实验，可发现脱氮副球菌ts-1不仅具有较高的异样硝化、好氧反硝化的能力，同时还具有较强的去除硫化物的能力，是一株同时具有三种功能的菌株。实施例5：生物滴滤塔除臭实验一将脱氮副球菌ts-1在lb培养基中培养24h得到脱氮副球菌ts-1菌液。脱氮副球菌ts-1在lb培养基中培养的过程中，培养温度为27℃、培养基ph为6.0且培养基中c/n为12。向装有多面空心球填料的生物滴滤塔中加入循环培养基，然后将2l培养24h的脱氮副球菌ts-1菌液用蠕动泵循环注入装有填料的生物滴滤塔，同时以4l/min的空气流速、气体浓度40mg/m3的硫化氢进气量及气体浓度40mg/m3的氨气进气量向生物滴滤塔中同时通入空气、硫化氢及氨气，保持环境温度25℃、ph6.5、湿度38％，在此条件下挂膜驯化6天，使该菌能够稳定的附着在填料上。然后向生物滴滤塔中通入氨气及硫化氢气体进行去除氨气及硫化氢的验证试验。在通入氨气及硫化氢气体进行去除氨气及硫化氢的验证实验过程中向生物滴滤塔内加入循环培养基，循环培养基为脱氮副球菌ts-1提供生长所需营养。本发明中，挂膜驯化是在多面空心填料表面产生一层能够适应并处理硫化氢和氨气的微生物膜。对照组加入空白填料，不进行菌种挂膜实验。以自来水代替循环液进行实验。待实验组挂膜完成的同时通入相同浓度的氨气及硫化氢。然后分别记录两塔入口及出口处的气体浓度，从而观察脱氮副球菌ts-1对气体污染物的去除和降解能力。其结果如下表所示。表3实施例5中脱氮副球菌ts-1除臭效果项目指标对照组实验组氨气去除率(％)27.22100.0硫化氢去除率(％)17.2396.34实施例6：生物滴滤塔除臭实验二将脱氮副球菌ts-1在lb培养基中培养24h得到脱氮副球菌ts-1菌液。脱氮副球菌ts-1在lb培养基中培养的过程中，培养温度为30℃、培养基ph为6.5且培养基中c/n为15。向装有多面空心球填料的生物滴滤塔中加入循环培养基，然后将2l培养24h的脱氮副球菌ts-1菌液用蠕动泵循环注入装有填料的生物滴滤塔，同时以5l/min的空气流速、气体浓度50mg/m3的硫化氢进气量及气体浓度50mg/m3的氨气进气量向生物滴滤塔中同时通入空气、硫化氢及氨气，保持环境温度26℃、ph7、湿度41％，在此条件下挂膜驯化6天，使该菌能够稳定的附着在填料上。然后向生物滴滤塔中通入氨气及硫化氢气体进行去除氨气及硫化氢的验证试验。在通入氨气及硫化氢气体进行去除氨气及硫化氢的验证实验过程中向生物滴滤塔内加入循环培养基，循环培养基为脱氮副球菌ts-1提供生长所需营养。本发明中，挂膜驯化是在多面空心填料表面产生一层能够适应并处理硫化氢和氨气的微生物膜。对照组加入空白填料，不进行菌种挂膜实验。以自来水代替循环液进行实验。待实验组挂膜完成的同时通入相同浓度的氨气及硫化氢。然后分别记录两塔入口及出口处的气体浓度，从而观察脱氮副球菌ts-1对气体污染物的去除和降解能力。其结果如下表所示。表4实施例6中脱氮副球菌ts-1除臭效果项目指标对照组实验组氨气去除率(％)27.22100.0硫化氢去除率(％)17.2397.36实施例7：生物滴滤塔除臭实验三将脱氮副球菌ts-1在lb培养基中培养24h得到脱氮副球菌ts-1菌液。脱氮副球菌ts-1在lb培养基中培养的过程中，培养温度为33℃、培养基ph为7且培养基中c/n为18。向装有多面空心球填料的生物滴滤塔中加入循环培养基，然后将2l培养24h的脱氮副球菌ts-1菌液用蠕动泵循环注入装有填料的生物滴滤塔，同时以6l/min的空气流速、气体浓度60mg/m3的硫化氢进气量及气体浓度60mg/m3的氨气进气量向生物滴滤塔中同时通入空气、硫化氢及氨气，保持环境温度27℃、ph7.5、湿度45％，在此条件下挂膜驯化7天，使该菌能够稳定的附着在填料上。然后向生物滴滤塔中通入氨气及硫化氢气体进行去除氨气及硫化氢的验证试验。在通入氨气及硫化氢气体进行去除氨气及硫化氢的验证实验过程中向生物滴滤塔内加入循环培养基，循环培养基为脱氮副球菌ts-1提供生长所需营养。本发明中，挂膜驯化是在多面空心填料表面产生一层能够适应并处理硫化氢和氨气的微生物膜。对照组加入空白填料，不进行菌种挂膜实验。以自来水代替循环液进行实验。待实验组挂膜完成的同时通入相同浓度的氨气及硫化氢。然后分别记录两塔入口及出口处的气体浓度，从而观察脱氮副球菌ts-1对气体污染物的去除和降解能力。其结果如下表所示。表5实施例7中脱氮副球菌ts-1除臭效果项目指标对照组实验组氨气去除率(％)27.22100.0硫化氢去除率(％)17.2395.93综合实施例5～7的除臭试验，可发现脱氮副球菌ts-1对臭气中氨气的去除率可达100％，对硫化氢气体的去除率最高可达97.36％，除臭效果好，能有效去除硫化氢、氨气等有毒有害气体，从而应用于除臭及污水处理中。而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。序列表<110>西安工程大学中国科学院成都生物研究所<120>一种脱氮副球菌菌株筛选及其在除臭中的应用<160>1<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>1327<212>dna<213>脱氮副球菌(paracoccusdenitrificansts-1)<400>1tcgctgcctccattgctggttagcgcacggccgtcgggtagacccaactcccatggtgtg60acgggcggtgtgtacaaggcccgggaacgtattcaccgcggcatgctgttccgcgattac120tagcgattccaacttcatggggtcgagttgcagaccccaatccgaactgagatggctttt180ggggattaacccactgtcaccaccattgtagcacgtgtgtagcccaacccgtaagggcca240tgaggacttgacgtcatccacaccttcctccgacttatcatcggcagttctcttagagtg300cccaaccaaatgctggcaactaagagtgtgggttgcgctcgttgccggacttaaccgaac360atctcacgacacgagctgacgacagccatgcagcacctgtccacaggtctcttacgagaa420aactccatctctggagcggtcctgcgatgtcaagggttggtaaggttctgcgcgttgctt480cgaattaaaccacatgctccaccgcttgtgcgggcccccgtcaattcctttgagttttaa540tcttgcgaccgtactccccaggcggaatgcttaatccgttaggtgtgtcaccgaacagca600tgctgcccgacgactggcattcatcgtttacggcgtggactaccagggtatctaatcctg660tttgctccccacgctttcgcacctcagcgtcagtatcgagccagtgagccgccttcgcca720ctggtgttcctccgaatatctacgaatttcacctctacactcggaattccactcacctct780ctcgaactccagaccgatagttttgaaggcagttccgaggttgagccccgggatttcacc840cccaactttccggtccgcctacgtgcgctttacgcccagtaattccgaacaacgctagcc900ccctccgtattaccgcggctgctggcacggagttagccggggcttcttctgctggtaccg960tcattatcttcccagctgaaagagctttacaaccctagggccttcatcactcacgcggca1020tggctagatcagggttgcccccattgtctaagattccccactgctgcctcccgtaggagt1080ctgggccgtgtctcagtcccagtgtggctgatcatcctctcaaaccagctatggatcgtc1140ggcttggtaggccattaccccaccaactacctaatccaacgcgggctaatcctttgccga1200taaatctttcccccaaagggcgtatacggtattactcccagtttcccggggctattccgt1260agcaaagggcatattcccacgcgttactcacccgtccgccgctaaccccgaagggtcgct1320cgactgc1327当前第1页12