Bar单抗杂交瘤细胞株、产生的抗体及其制备方法与流程

本发明涉及生物工程领域，具体涉及bar单抗杂交瘤细胞株、产生的抗体及其制备方法。
背景技术：
：转有抗除草剂基因作物的种植，使在田间喷洒除草剂成为有效防除杂草方式，也因而使抗除草剂性状成为农业生产中最具优势的性状之一。目前，抗除草剂作物占全球转基因作物的80％以上。从发展趋势上看，转基因的作物比例仍在不断增加。链霉菌(streptomyces)中bar基因表达的蛋白在乙酰辅酶a存在的情况下能催化乙酰辅酶a与除草剂草铵膦的游离氨基结合，使l-草铵膦变为乙酰-l-草铵膦，从而使除草剂失活，赋予转基因作物抗除草剂特性。bar基因作为遗传转化中的标记基因广泛应用于基因工程育种中。随着转基因作物的飞速发展带来巨大经济利益的同时，人们也越来越关注转基因作物可能带来的不可预期的食用安全及环境安全性问题。因此建立合适的方法对转基因食品中转基因成分进行鉴定与检测，能够促进农业转基因生物的安全管理，保障人、动物以及微生物的安全，能够保护生态环境。为了对转基因水稻或者其衍生物中bar蛋白进行快速的定量或定性分析，研究并得到抗除草剂bar蛋白的单克隆抗体具有非常大的意义。技术实现要素：本发明的目的在于提供bar单抗杂交瘤细胞株(pa1-18030030/1b83d6)和bar单抗杂交瘤细胞株(pa1-18030030/6f51d2)、两种产生的抗体及其制备方法。为实现上述目的，本发明提供了bar单抗杂交瘤细胞株的制备方法，包括以下步骤：a)通过原核表达得到bar重组蛋白；b)免疫动物：将bar重组蛋白作为抗原免疫balb/c小鼠；c)细胞融合：收集免疫balb/c小鼠的脾细胞并与sp2/0细胞进行融合；d)细胞建株：通过有限稀释法进行亚克隆，亚克隆5-7天进行elisa检测，直至筛选出稳定分泌阳性抗体的杂交瘤细胞株进行扩大再培养和保存。上述制备方法在另一种实施方式中，小鼠的脾细胞与sp2/0细胞的融合比例为1:(5-10)。本发明还提供了上述制备方法制备出的bar单抗杂交瘤细胞株，包括生物保藏编号为cgmccno.17083的bar单抗杂交瘤细胞株(pa1-18030030/1b83d6)以及生物保藏编号为cgmccno.17084的bar单抗杂交瘤细胞株(pa1-18030030/6f51d2)。本发明还提供了上述bar单抗杂交瘤细胞株所产生的单克隆抗体，所述bar单抗杂交瘤细胞株为bar单抗杂交瘤细胞株(pa1-18030030/1b83d6)及bar单抗杂交瘤细胞株(pa1-18030030/6f51d2)。上述单克隆抗体在另一种实施方式中，bar单抗杂交瘤细胞株(pa1-18030030/1b83d6)以及bar单抗杂交瘤细胞株(pa1-18030030/6f51d2)所产生的单克隆抗体的类型均为igg1。上述单克隆抗体在另一种实施方式中，bar单抗杂交瘤细胞株(pa1-18030030/1b83d6)以及bar单抗杂交瘤细胞株(pa1-18030030/6f51d2)所产生的单克隆抗体通过间接elisa检测所得到的效价依次为1:1024000和1:640000。本发明还提供了上述单克隆抗体的制备方法，将bar单抗杂交瘤细胞株接种到小鼠腹腔中制备腹水，然后进行proteina-琼脂糖亲和层析柱纯化，得到单克隆抗体。本发明还提供了上述单克隆抗体在检测bar抗除草剂蛋白中的应用。本发明还提供了上述单克隆抗体在制备elisa法检测bar抗除草剂蛋白的试剂中的应用。本发明还提供了上述单克隆抗体在制备elisa双抗体夹心法检测bar抗除草剂蛋白的试剂中的应用。本发明提供的bar单抗杂交瘤细胞株(pa1-18030030/1b83d6)和bar单抗杂交瘤细胞株(pa1-18030030/6f51d2)，已依次于2018年12月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。邮编：100101，保藏编号依次为cgmccno.17083和cgmccno.17084。与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：本发明利用工程菌株表达、纯化得到的高纯度抗除草剂蛋白bar作为抗原，通过杂交瘤技术制备了2株分泌抗bar的特异、灵敏单抗的bar单抗杂交瘤细胞株(pa1-18030030/1b83d6)以及bar单抗杂交瘤细胞株(pa1-18030030/6f51d2)，所述细胞株分泌单抗腹水纯化后得到的抗体间接elisa效价分别为1:1024000和1:640000，抗体亚型均为igg1，所述单抗可以特异识别原核表达的重组bar蛋白及转基因水稻中的内源bar蛋白，分泌抗bar抗除草剂蛋白的鼠单抗杂交瘤细胞株的构建为转基因水稻中该蛋白的检测提供了物质和技术支撑。附图说明图1为bar重组蛋白sds-page电泳结果图。图2为bar重组蛋白单抗筛选western结果图。图3为bar单抗杂交瘤细胞株(pa1-18030030/1b83d6)和bar单抗杂交瘤细胞株(pa1-18030030/6f51d2)纯化的单克隆抗体的sds-page电泳结果图。图4为bar单抗杂交瘤细胞株(pa1-18030030/1b83d6)所产生的单克隆抗体滴度图。图5为bar单抗杂交瘤细胞株(pa1-18030030/6f51d2)所产生的单克隆抗体滴度图。具体实施方式下面结合附图和实施例对本发明作详细描述，但本发明的实施不仅限于此。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径可购得。实施例1bar单抗杂交瘤细胞株获得及其单克隆抗体的制备1.免疫抗原的制备1)重组蛋白bar表达菌株构建、菌体培养及裂解bar编码基因扩增：以转基因水稻t1c-19基因组dna为模板，用高保真fastpfu进行pcr扩增，扩增到的pcr产物经(1.0％)琼脂糖凝胶电泳鉴定后，将目的条带切胶回收，用universaldna纯化回收试剂盒(天根)回收，回收产物经限制性内切酶ndei和xhoi酶切、经胶回收与进行同样酶切、胶回收处理的pet28a质粒片段于4℃过夜连接，转化trans10感受态细胞(北京全式金)，挑取克隆，进行菌落pcr鉴定，阳性克隆由北京六合华大基因公司进行测序。将鉴定正确的重组表达载体pet28a-bar转化大肠杆菌bl21(de3)感受态细胞，菌液涂布于含卡那霉素(50μg/ml)的lb平板上，37℃过夜培养。次日在平板上挑取单克隆接种含相同浓度卡那霉素的液体lb培养基中，于37℃过夜培养。所得的表达菌株菌液与50％的甘油溶液等体积混匀，于-80℃冻藏。将保存的重组蛋白bar表达菌株复苏培养，菌液涂布于含卡那霉素(50μg/ml)的lb平板上，37℃过夜培养。挑取单克隆接种液体lb(含卡那霉素50μg/ml)培养基中37℃过夜培养。第二天以1％接种量接种，于37℃培养至od600为0.8左右，加入1mmiptg于16℃过夜诱导表达蛋白。诱导结束将菌液冰浴，于4℃，4000rpm，10min离心收集菌体，弃上清，菌体经pbs洗涤后用裂解液(50mmtrisph7.5，300mmnacl，5％glycerol和20mm咪唑)悬浮；超声破碎(2son/4soff，amp：45％，time：3min)；4℃15000rpm离心1hr，收集上清。2)重组蛋白纯化菌体裂解液上清与经裂解液平衡的nisepharose6ffbeads(gehealthcare)混合，于4℃结合2-3hrs，3000rpm离心3min弃上清；已结合蛋白的nisepharose6ffbeads经清洗液(50mmtrisph7.5，300mmnacl，5％glycerol和50mm咪唑)洗2-3次；再用洗脱液(50mmtrisph7.5，300mmnacl，5％glycerol和200mm咪唑)洗脱。收集洗脱液即为蛋白粗纯溶液。将亲和纯化得到的蛋白样品透析至蛋白储存溶液(50mmtrisph7.5，300mmnacl，5％glycerol)，并用经相同溶液平衡的superdex200increase10/30gl(gehealthcare)进一步纯化，收集蛋白峰组分并经sds-page检测蛋白样品的纯度，通过图1可得，经过凝胶过滤最后获得电泳纯的bar蛋白，分子量约为70kda。2.免疫动物用步骤2)中质控合格的bar重组蛋白作为抗原免疫8只8周龄的spf级balb/c雌性小鼠(购置于湖北省实验动物研究中心，许可证号：scxk(鄂)2015-0018)，抗原与等体积完全弗氏佐剂(首免)和不完全弗氏佐剂(加强免疫)混合并进行乳化，充分混合至油包水状态进行皮下多点免疫，2-3次加强免疫，每次免疫间隔周期2周，之后进行效价检测，高于>1:10000后1周内进行腹腔冲击，直接将免疫剂量的抗原溶于250μl的pbs中，具体免疫次数及免疫剂量如表1所示：表1免疫次数及免疫剂量免疫示例：一免中，将50ug的抗原溶于pbs，然后与佐剂按体积1:1混合。3.细胞融合末次冲击3天后，收集阳性对照血，取脾脏，制备成单细胞悬液；处于对数期的sp2/0细胞处理后，与脾细胞以一定比例混合(1:5-1:10)，50％peg1450作用1min，以基础培养基dmem稀释终止，低速离心后，再用含20％胎牛血清的hat培养基轻轻悬浮并混匀，按照2×107/板铺至预先准备好的饲养层细胞板里，置于5％co2，37℃下培养。4.细胞建株1)融合板检测：待融合板换液细胞长至中等大小约1万个细胞以上开始检测，在elisa质控合格(即阴性对照od450<0.2，阳性对照od450>1.0)后挑选阳性孔(一般od450≥0.5)作亚克隆。2)亚克隆方法及检测：挑出融合板中检测阳性值高(od450>2.0)的孔进行有限稀释，以每板60％的单克隆孔数量计数做亚克隆，每次均挑取阳性值较高的单克隆孔进行有限稀释，每次亚克隆5-7天即可进行elisa检测，直到最终筛选出能稳定分泌阳性抗体的单克隆细胞株进行扩大培养。3)细胞株建立：将亚克隆阶段筛选出的稳定分泌阳性抗体的细胞株，扩大培养于24孔板，扩大后收集上清进行抗原检测，采用elisa梯度稀释及western-blotting验证其稳定性，通过图2可知，bar单抗杂交瘤细胞株(pa1-18030030/1b83d6)和bar单抗杂交瘤细胞株(pa1-18030030/6f51d2)分泌的单抗能特异检测到内源样本和重组蛋白bar，收集细胞扩大于10cm培养皿中，再次收集上清并检测其中抗体的效价，挑选出od450>2.0的2株细胞株培养于细胞瓶中，进行冻存，即bar单抗杂交瘤细胞株(pa1-18030030/1b83d6)和bar单抗杂交瘤细胞株(pa1-18030030/6f51d2)，已依次于2018年12月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称cgmcc)，保藏编号依次为cgmccno.17083和cgmccno.17084。4)细胞株冻存鉴定在细胞株冻存完毕后必须复苏同一批次中的一支进行鉴定，鉴定标准：①复苏活细胞数≥100万个细胞/支；②活细胞中有活力细胞≥50万/株；③复苏细胞中不能有除细胞株细胞以外的其它微生物(如:细菌.真菌.支原体等)出现；④复苏细胞生长到一定数目后选出生长好的细胞作单克隆计数铺板，并检测单克隆的分泌抗体能力是否全阳或有抗体分泌；⑤细胞培养上清也需作elisa(od450>2.0)，以确定是否分泌阳性抗体的同时做western-blotting的鉴定，通过图3可知，bar单抗杂交瘤细胞株(pa1-18030030/1b83d6)和bar单抗杂交瘤细胞株(pa1-18030030/6f51d2)分泌的单抗能特异检测到内源样本和重组蛋白bar。5.制备腹水先用降植烷或液体石蜡行小鼠腹腔注射，一周后分别将bar单抗杂交瘤细胞株(pa1-18030030/1b83d6)和bar单抗杂交瘤细胞株(pa1-18030030/6f51d2)接种到两只小鼠腹腔中，细胞定株后扩大培养选用10％胎牛血清培养基，当细胞密度达到以1×106-2×106/ml时，800rpm离心，收集沉淀，并用pbs重悬后，腹腔注入到小鼠(液体石蜡)体内，7-10天后，收集腹水准备纯化。6.抗体纯化收集后的腹水经过预处理后选用proteina-琼脂糖亲和层析柱纯化，具体步骤如下：1)缓冲液：起始缓冲液为ph7.0，20mm磷酸缓冲液；洗脱缓冲液为ph2.70.1mm甘氨酸盐酸。2)准备收集管：取1.5ml离心管，每支离心管加70μlph9.01mtris-hcl。3)样品准备：经50％sas沉淀得到的样品，置起始缓冲液进行透析过夜，并经0.22μm微孔滤膜滤过。4)纯化过程：用足够的起始缓冲液(8-10ml)平衡proteina-琼脂糖亲和层析柱(hitrapproteina1ml，pharmaciabiotech)。取待纯化的样品(每毫升样品含蛋白10.2-21.1mg)15-25ml上柱，流速为0.5ml/min，然后以同样的流速依次用起始缓冲液7-8ml、洗脱缓冲液6-7ml、起始缓冲液5ml洗涤，每管1ml收集洗脱液。5)纯度及活性鉴定纯化的单克隆抗体(mcab)用sds-page鉴定其纯度，详见图3，通过图4可知，bar单抗杂交瘤细胞株(pa1-18030030/1b83d6)和bar单抗杂交瘤细胞株(pa1-18030030/6f51d2)单克隆抗体经纯化去除几乎所有杂蛋白，有2条特异性主条带(55kda和30kda)。7.单克隆抗体的亚类鉴定和效价测定将纯化好的单抗与sigma公司的标准抗balb/c小鼠igg1，igg2a，igg2b，igg3，igm抗体进行elisa检测，检测结果表明：单抗类型为igg1，以重组蛋白bar为抗原，用间接elisa方法检测纯化单抗效价，通过图4可知，经elisa测定，纯化得到的bar单抗杂交瘤细胞株(pa1-18030030/1b83d6)单抗滴度为1:1024000；通过图5可知，经elisa测定，纯化得到的bar单抗杂交瘤细胞株(pa1-18030030/6f51d2)单抗滴度为1:640000。表2bar单抗杂交瘤细胞株(pa1-18030030/1b83d6)所产生的单克隆抗体的浓度及亚型表3bar单抗杂交瘤细胞株(pa1-18030030/6f51d2)所产生的单克隆抗体的浓度及亚型转基因水稻蛋白提取方法:组织液氮速冻，磨碎，加1ml(按样品量，一般0.5g加1-2ml)蛋白提取液，4℃混匀30分钟，(12,000rpm4℃离心15min，取上清)，蛋白提取液配方见表4：表4蛋白提取液配方成分用量1mtris,ph7.5500ul1mnacl1.5ml0.5medta20ul50％glycerol2ml10％sds1ml双蒸水(ddh2o)配成10ml蛋白酶抑制剂(roche)用时添加一片1mmpmsf(苯甲基磺酰氟,sigma)用时添加50ul以上公开的仅为本发明的具体实施例，但是，本发明并非局限于此，任何本领域的技术人员能思之的变化都应落入本发明的保护范围。当前第1页12