转伴矿景天SpHMA2和SpNramp5的重金属超富集转基因工程油菜的创制及应用的制作方法

本发明属于转基因植株和重金属污染治理领域，具体涉及转伴矿景天sphma2和spnramp5双基因的重金属超富集转基因工程油菜的创制方法及应用。

背景技术：

重金属污染问题已成为一个世界性重大环境问题，重金属污染不仅威胁动植物、微生物生产发育，还通过食物链等威胁人类健康乃至生命。导致土壤污染的重金属主要有as、cd、co、cr、cu、hg等，一般为几种重金属的复合污染。重金属矿区、经济高速发展区的重金属污染情况尤为严重，导致我国许多农产品由于重金属超标而被拒绝进入国际市场。

各国对重金属污染的生态效应和防治的研究越来越重视，已探索出多种治理技术。然而传统的重金属污染技术如土壤固化、玻璃化、淋滤化、洗土法、客土法、电化学法等物理化学方法，不仅成本高昂，难以大规模使用，而且常常导致土壤结构破坏、土壤生物活性下降和土壤肥力退化。因此，寻求一种廉价而永久有效，又可以维持土壤肥力的替换方法一直是国际上研究的难点和热点。

利用绿色植物清除污染物的策略，即植物修复技术具有成本低，环境友好和可再利用等特点，是一种非常有前景的环境污染原位治理途径。广义的植物修复指通过植物萃取、转化、固定、挥发、降解作用将土壤及水体中有机污染物、重金属等污染物清除的过程。通过种植具有重金属富集能力的植物，将植物收割并妥善处理(如灰化等)，以到达将重金属移出土壤环境，清除土壤重金属污染的目的。

基因是决定植物对土壤重金属吸收积累特性的最重要因素，重金属富集植物耐重金属的机制主要包括三个方面，第一，排斥机制，阻碍重金属的吸收或体内运输，吸收后又排出体外；第二，局域化机制，使重金属在植物的液泡、表皮毛、细胞壁等特定部位积累，从而与细胞中的其他组分隔离，达到解毒的效果；第三，络合机制，植物体内物质与重金属络合，包括与无机物络合形成硫化物，与小分子有机物如gsh、草酸、组氨酸和柠檬酸等络合后在液泡中聚集，与大分子的金属鏊合蛋白络合。但目前，野生重金属富集植株存在耐性有限、成长缓慢、生物量小、生长环境特殊、以及重金属重返等问题。基因工程技术是目前土壤重金属修复研究中最具前景的高新生物技术，因此，将植物的重金属超富集基因克隆并转移到生物量大、生产迅速的植物上以提高植物修复的能力，是解决土壤重金属污染问题的有效方法。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种转伴矿景天sphma2和spnramp5双基因的重金属超富集转基因工程油菜的创制方法及应用，解决野生重金属富集植株存在耐性有限、成长缓慢、生物量小、生长环境特殊、以及重金属重返等问题。

为实现上述目的，本发明提供一种转伴矿景天sphma2和spnramp5双基因的重金属超富集转基因工程油菜的创制方法，具体指重金属超富集转双基因工程油菜的构建方法，包括：

(1)重金属超富集双基因的克隆，分别克隆伴矿景天中sphma2和spnramp5基因，伴矿景天(sedumplumbizincicola)是在我国南方矿区发现的一种重金属超富集植物。因其对重金属具有超强的抗性和富集能力，是目前重金属污染土壤修复试验的一种主要的修复植物。sphma2蛋白对镉、锌等二价金属阳离子具有特异转运能力，spnramp5蛋白对镉、锌等二价金属阳离子具有特异根部聚集能力，研究结果表明，sphma2和spnramp5是伴矿景天进行镉等重金属吸收与转运的关键基因，对植株在含镉土壤环境中维持幼叶正常生长发育及镉解毒发挥重要的作用；

(2)超量表达双元载体的构建，以植物表达载体为基础，构建包含强启动子、筛选基因的转化载体，将步骤(1)克隆得到的spnramp5基因通过双酶切法连接到所述转化载体得到中间转化载体，再将克隆得到的sphma2基因通过同源重组方法插入到中间转化载体，获得双基因超量表达双元载体；；

(3)重金属超富集转双基因植株构建，将步骤(2)所得的双基因超量表达双元载体通过根癌农杆菌转入油菜下胚轴切段中，用筛选培养基进行筛选培养，获得的转双基因抗性油菜下胚轴切段经过诱导、分化、生根、转基因苗的锻炼和移栽，筛选获得双基因聚合表达的转基因阳性植株；

其中，所述sphma2基因核苷酸序列如seqidno:1所示，所述sphma2基因核苷酸序列如seqidno:2所示，所述油菜品种为甘蓝型油菜k407。

较佳地，所述步骤(1)中，克隆伴矿景天中sphma2和spnramp5双基因的方法为：

以伴矿景天的cdna为模板，以如seqidno:3和seqidno:4所示的序列为引物进行pcr扩增，得到sphma2基因；以如seqidno:5和seqidno:6所示的序列为引物进行pcr扩增，得到spnramp5基因。

较佳地，所述植物表达载体为pcambia1301载体，所述强启动子为2×camv35s启动子，所述筛选基因为hyg筛选基因。采用包含2×camv35s启动子的转化载体，目的基因表达量高，遗传稳定性好，实际应用前景突出，且强化了目标基因的高转化，有望获得目标基因高效转化的转基因材料。

较佳地，上述所述转化载体的构建方法包括以下步骤：

(a)采用hindⅲ和bamhi酶切pcambia1301载体上的camv35s启动子，使用1％的琼脂糖进行电泳，回收小条带；

(b)使用35s-f/r以上一步回收产物为模板进行pcr，回收1000bp左右的条带，使用hindⅲ和bamhi酶切回收产物及pcambia1301载体，并回收酶切产物；

(c)将上述酶切片段和酶切载体的回收产物使用t4连接酶进行连接；

(d)所得载体为pcambia1301-2×35s，即转化所用载体；

(e)使用bglⅱ和bsteⅱ酶切pcambia1301-2×35s载体；

(f)以spnramp5-f/r为上下游引物，以spnramp5-19t为模板进行pcr，回收大小1.6kb左右的条带，并使用bglⅱ和bsteⅱ酶切pcambia1301-2×35s载体和pcr回收产物，并对上述酶切产物进行回收；

(g)使用t4连接酶对上述回收产物进行连接，得到中间载体；

(h)使用xbai和bamhi对(g)所得的中间载体进行酶切，并回收酶切产物；

(i)以sphma2-f/r为上下游引物，以sphma2-19t为模板进行pcr，回收大小2.9kb左右的条带，并回收pcr产物；

(j)使用同源重组酶对(h)中所得的酶切回收产物及(i)中所得的pcr回收产物进行同源重组，得到转化所用载体。

具体地，所述2×camv35s启动子的核苷酸序列如seqidno:7所示，所述hyg筛选基因核苷酸序列如seqidno:8所示。

较佳地，所述植物表达载体为pcambia1301载体，所述强启动子为2×camv35s启动子，所述筛选基因为hyg筛选基因。采用包含2×camv35s启动子的转化载体，目的基因表达量高，遗传稳定性好，实际应用前景突出，且强化了目标基因的高转化，有望获得目标基因高效转化的转基因材料。

较佳地，所述camv35s启动子通过hindⅲ和bamhi酶切pcambia1301载体获得，克隆camv35s启动子基因的pcr引物序列如seqidno:9和seqidno:10所示。

较佳地，所述hyg筛选基因为所述pcambia1301载体自带的筛选基因。

较佳地，所述筛选培养基含有潮霉素。

较佳地，步骤(2)中，所述双基因超量表达双元载体的构建包括以下步骤：

采用pcr扩增反应克隆sphma2基因，所述克隆sphma2基因的同源重组pcr引物包含xbai和bamhi酶切位点。

较佳地，所述克隆sphma2基因的同源重组pcr引物序列如seqidno:11和seqidno:12所示，所述克隆spnramp5基因的pcr引物序列如seqidno:13和seqidno:14所示。

较佳地，所述根癌农杆菌为gv3101。

本发明还提供一种转伴矿景天sphma2和spnramp5双基因的重金属超富集转基因工程油菜的创制方法中所得的重金属超富集转基因植株在土壤重金属修复中的应用。

与现有技术相比，本发明提供的转伴矿景天sphma2和spnramp5双基因的重金属超富集转基因工程油菜的创制方法具有如下几方面的优点：第一、选择转化的目标基因功能明确，来自于野生重金属超富集植物伴矿景天，其编码蛋白对镉等重金属的转运吸收的效率高，因此有望获得可供实践使用的超富集转基因植株；第二、构建包含强启动子的转化载体，目的基因表达量高，遗传稳定性好，实际应用前景突出；第三、采用强启动子启动目标基因，强化了目标基因的高转化，因此有望获得目标基因高效转化的转基因材料；第四、受体材料品种选择特殊，本发明选用的油菜品种为甘蓝型油菜k407，遗传转化效果好，并且生物量大，适应性广，可在南北方广大地区使用，因此在土壤修复中的应用前景广阔。第五、进行两个负责重金属转运基因的共转化，聚合两基因的功能，能够显著提高转基因工程材料的重金属富集能力。

附图说明

图1分别为sphma2和spnramp5基因电泳图(左为sphma2和右为spnramp5)；

图2分为克隆sphma2和spnramp5基因菌落pcr电泳图(上为sphma2和下为spnramp5)；

图3为p2×35s-sphma2&spnramp5-hyg双基因超量表达双元载体图；

图4为sphma2和spnramp5转双基因遗传转化阶段图；

图5为sphma2和spnramp5转双基因阳性植株鉴定图；

图6为sphma2和spnramp5转双基因阳性植株定量鉴定图；

图7为sphma2和spnramp5转双基因植株重金属吸附水平鉴定图。

具体实施方式

为更好地说明本发明的目的、技术方案和有益效果，下面将结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。需说明的是，下述实施所述方法是对本发明做的进一步解释说明，不应当作为对本发明的限制。本发明的实施例中所用的材料、试剂若无特殊说明皆可从商业途径获得。

实施例1sphma2和spnramp5双基因克隆

将伴矿景天幼苗使用液氮研磨成粉末状，使用trizol法提取其rna，使用toyobo反转录试剂盒将其反转录成cdna，根据ncbi提供的sphma2基因的cdna序列使用primer5设计其上下游引物，并合成引物，设计引物的核苷酸序列为：

上游序列：5'gaacacgggggactctagaggatcc3'(如seqidno:3所示)；

下游序列：5'catttatttcaaccggtccgacc3'(如seqidno:4所示)。

根据ncbi提供的spnramp5基因的cdna序列使用primer5设计其上下游引物，并合成引物，设计引物的核苷酸序列为：

上游序列：5'ttccgcactcgactttgacg3'(如seqidno:5所示)；

下游序列：5'aacttgatccgattcgcaca3'(如seqidno:6所示)。

待引物合成后，使用1×te进行溶解，接着进行pcr扩增，以伴矿景天cdna为模板，使用高保真酶gxlpremix分别对其进行扩增，将扩增产物使用1％的琼脂糖凝胶进行电泳，将目标条带切下(sphma2：2910bp和spnramp5：1638bp)，使用胶回收试剂盒进行回收，扩增产物电泳图如图1所示(左为sphma2和右为spnramp5)。然后分别将回收产物与pmd19-t(simple)载体进行过夜连接，分别将连接产物使用热激法转化大肠杆菌感受态top10，挑单克隆做菌液pcr，扩增结束后，将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，电泳图如图2所示(上为sphma2和下为spnramp5)。将阳性菌株进行测序，测序正确后将菌液接入lb-amp培养基摇菌，提质粒备用。

实施例2重金属超富集转双基因植物的转化载体的构建

包含2×camv35s启动子、hyg筛选基因转化载体的构建基于实验室自有的pcambia1301载体，通过以下步骤进行改造后获得：

使用primer5设计camv35s启动子基因的pcr上下游引物，并合成引物，设计引物的核苷酸序列为：

上游序列：5'aagctttgagacttttcaacaaagggt3'(如seqidno:9所示)；

下游序列：5'ggatcctcagcgtgtcctctccaaatg3'(如seqidno:10所示)。

①获取2×camv35s启动子：将含有pcambia1301载体的菌株接入lb-kan的培养基中，摇菌提取质粒。使用hindⅲ和bamhi酶切pcambia1301，酶切产物进行1％的琼脂糖凝胶进行电泳，回收小条带(约678bp)。小条带为camv35s启动子。

②构建转化载体：将pcambia1301使用hindⅲ和bamhi进行酶切，将酶切产物进行1％的琼脂糖凝胶进行电泳，回收大条带。将之前准备好的2×camv35s启动子使用t4连接酶与之进行连接，将连接产物使用热激法转化大肠杆菌感受态top10，挑取单克隆进行菌液pcr，将阳性菌株接入lb-kan培养基摇菌，提质粒使用hindⅲ和bamhi再次进行酶切验证。将验证正确的菌进行摇菌提取质粒备用，表达载体构建完成。2×camv35s启动子的核苷酸序列如seqidno:7所示，hyg筛选基因核苷酸序列如seqidno:8所示。

实施例3重金属超富集转基因植株的sphma2和spnramp5双基因超量表达双元载体

根据sphma2基因的orf区两端设计同源重组引物，设计的同源重组引物的核苷酸序列为：

上游序列(如seqidno:11所示)：

5‘agagaacacgggggactctagaatggccttaggcgacgaaaag3’；

下游序列(如seqidno:12所示)：

5‘acgatcggggaaattcgagctcctactccacaacaatctcggacaatc3’。

根据spnramp5基因的orf区两端设计pcr引物，设计的pcr引物的核苷酸序列为：

上游序列(如seqidno:13所示)：

5‘gaagatctatggcatcaactgtcggaaacgc3’；

下游序列(如seqidno:14所示)：

5‘gggtaaccctactctaagacagctctgcgtt3’。

分别以含有sphma2的19t载体和含有spnramp5的19t载体为模板使用高保真酶进行pcr扩增。将pcr产物进行1％的琼脂糖凝胶进行电泳，回收目的条带，备用。将构建好的表达载体首先使用bglⅱ和bsteⅱ双酶切，将酶切产物直接进行胶回收，备用。将spnramp5片段用bglⅱ和bsteⅱ进行酶切，并用t4连接酶进行连接，将连接产物使用热激法转化大肠杆菌感受态top10，挑取单克隆进行菌液pcr，将验证正确的菌株送测序公司测序，将测序正确的菌株提取质粒并使用xbai和bamhi进行双酶切，将sphma2的扩增片段与酶切后的载体进行同源重组，并将同源重组产物使用热激法转化大肠杆菌感受态top10，挑取单克隆进行菌液pcr，将验证正确的菌株送测序公司测序，将测序正确的菌株提取质粒。将测序正确的质粒通过电转法转入根癌农杆菌gv3101，将转化后的菌液涂布在yep-kan平板上，待其长出来单克隆菌落时，挑取单克隆摇菌，做菌液pcr，将阳性菌株保存备用。构建成功的sphma2和spnramp5双基因超量表达双元载体，p2×35s-sphma2&spnramp5-hyg双基因转化载体图谱如图3所示。

实施例4转双基因植株遗传转化

选取饱满、均匀、色泽正常的k407油菜种子，使用乙醇和次氯酸钠消毒后，置于营养培养基sgmedium(每升中含ms110ml、ms25ml、ms35ml、ms45ml、ms55ml、ms65ml、sucrose10g、agar6g，ph5.8)上，使其发芽。5-7天后切下油菜的下胚轴，将其切成5-8毫米的小段，使用之前准备好的根癌农杆菌gv3101菌株进行侵染，侵染之后置于共培养培养基comedium(每升中含ms120ml、ms210ml、ms310ml、ms410ml、ms510ml、ms610ml、ms710ml、sucrose30g、2,4-d1ml、agar6g、as(母液为20mg/ml)1ml，ph5.8；其中，50×ms1母液：nh4no382.5g/l、kno395g/l、kh2po48.5g/l、100×ms2母液：mgso4*7h2o37g/l，100×ms3母液：cacl2*2h2o44g/l，100×ms4：h3bo3620mg/l、mgso42.23g/l、znso4*7h2o2.23g/l、namoo4*2h2o25mg/l、cuso4*5h2o2.5mg/l、cocl*6h2o2.5mg/l，100×ms5：83mg/l，100×ms6：na2edta3.73g/l、feso4·7h2o2.78g/l，100×ms7：烟酸100mg/l、盐酸硫胺素b110mg/l、盐酸吡哆素b650mg/l、肌醇10g/l、甘氨酸200mg/l)上2天，之后将其置于含潮霉素(浓度为：50mg/l)的筛选培养基上，其中，p2×35s-sphma2&spnramp5-hyg双基因转化载体使用含潮霉素的筛选培养基(每升中含ms120ml、ms210ml、ms310ml、ms410ml、ms510ml、ms610ml、ms710ml、sucrose30g、6-ba(母液浓度为1mg/ml)4ml、naa(母液浓度为1mg/ml)50ul、agar6g、agno3(母液浓度为5mg/ml)1ml，ph5.8)。随后，每隔15-20天后更换一次筛选培养基直至愈伤组织分化出再生芽。将再生芽切下，置于生根培养基rimedium(每升中含ms110ml、ms25ml、ms35ml、ms45ml、ms55ml、ms65ml、ms75ml、sucrose15g、agar6g、iba(母液为1mg/ml)100ul，ph5.8)上，每隔15-20天后更换一次生根培养基，直至其长出根，然后将再生苗移栽到营养土上进行土培，获得阳性转双基因植株。sphma2和spnramp5转双基因油菜遗传转化阶段图如图4所示。

实施例5阳性转双基因植株鉴定及吸附水平测定

对转双基因植株进行鉴定，获得转双基因阳性植株，将获得的转双基因阳性植株用镉重金属进行处理，检测其中重金属含量，并与对照处理进行比较，分析其吸附能力。阳性转双基因植株鉴定图如图5所示，阳性转双基因植株定量鉴定图如图6所示。根据阳性植株鉴定结果，挑选部分转化水平高且表达稳定的转基因株系进行重金属吸附水平鉴定，结果如图7所示。综合数据结果得出，本发明提供的转伴矿景天sphma2和spnramp5双基因的重金属超富集转基因工程油菜的创制方法是解决重金土壤污染问题的有效方法。

最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

<110>深圳市沃地污染修复技术有限公司

西北农林科技大学

<120>转伴矿景天sphma2和spnramp5的重金属超富集转基因工程油菜的创制及应用

<160>14

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>2913

<212>dna

<213>伴矿景天(sedumplumbizincicola)

<400>1

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