一种海马应激响应的评价体系及评价方法与流程

本发明属于动物应激响应评价技术领域，具体涉及一种海马应激响应的评价体系及评价方法。

背景技术：

海马（hippocampus）属国家二级保护动物，国际华盛顿公约指定保护动物，是重要的水族观赏动物和名贵的中药材，经济价值极高。在长期进化过程中，海马演化出了独特生理构造和行为方式，但由于资源的过度开发和生境的严重破坏，野生海马已濒临灭绝，因此，海马的人工繁育显得越来越重要。近10年来，我国海马工厂化养殖发展迅速，但是由于海马喜静、泳动度低、活动范围小、大部分时间攀附于附着基上，对环境因子变化和人为干扰极为敏感，所以养殖难度很大。

而且在海马的养殖过程中，极易对温度、盐度、污染物、溶氧、病原、人为操作等因素的变化产生应激反应，甚至是罹患疾病，进而影响养殖效益，所以很需要对海马应激响应的检测和评价体系。但是现有技术没有这方面的评价体系，使得海马养殖从业者无法及时、客观地评估各种因素变化对海马免疫应激的影响，严重制约了海马工厂化养殖的快速发展。

技术实现要素：

为了弥补现有技术的不足，本发明提供了一种海马应激响应的评价体系及评价方法，用于科学地对海马的应激响应状态进行评价，进而指导海马工厂化养殖业的健康发展。

一种海马应激响应的评价体系包括外部指标、免疫组化、抗菌肽基因、免疫因子、血细胞五个方面26个指标，26个指标的症状区间及对应的得分，总分以及评价结论；

所述外部指标包括体重、体长、肛门炎症严重程度、摄食状态、腹水严重程度，共5个指标；免疫组化包括杯状细胞数量、炎症细胞数量，共2个指标；抗菌肽基因包括hepcidin基因、leap基因、lysozyme基因、piscidin基因，共4个指标；免疫因子包括il-1β因子、il-1βreceptor因子、il-2因子、il-10因子、ifn因子、tnf-α因子、tlr5因子，共7个指标；血细胞包括白细胞、中性粒细胞、淋巴细胞、红细胞压积、血小板数、血小板压积、中间细胞、中间细胞比率，共8个指标；

所述26个指标的症状区间及对应的得分情况分别为：所述体重>3.8g得0分，体重在3.7-3.8g之间得1分，体重在3.6-3.7g之间得2分，体重＜3.6g得3分；所述体长正常得0分，体长中速得1分，体长低速得2分，体长停滞得3分；所述肛门炎症严重程度为程度正常得0分，程度轻微得1分，程度中等得2分，程度严重得3分；所述摄食状态为可以自主捕食漂浮的糠虾得0分，捕食能力稍弱但可以自主寻找食物得1分，捕食能力严重减弱只吃漂浮到嘴边的食物得2分，捕食能力丧失得4分；所述腹水严重程度为正常得0分，轻微得1分，中等得2分，严重得3分；所述杯状细胞数量为少量得0分，微量得1分，中等得2分，大量得3分；所述炎症细胞数量为少量得0分，微量得1分，中等得2分，大量得3分；所述hepcidin抗菌肽基因为0-1得1分，1-2得2分，2-4得3分，大于4得4分；所述leap基因为0-1得1分，1-2得2分，2-4得3分，大于4得4分；所述lysozyme基因为0-1得1分，1-2得2分，2-4得3分，大于4得4分；所述piscidin基因为0-1得1分，1-2得2分，2-4得3分，大于4得4分；所述il-1β因子为0-1得1分，1-2得2分，2-4得3分，大于4得4分；所述il-1βreceptor因子为0-1得1分，1-2得2分，2-4得3分，大于4得4分；所述il-2因子为0-1得1分，1-2得2分，2-4得3分，大于4得4分；所述il-10因子为0-1得1分，1-2得2分，2-4得3分，大于4得4分；所述ifn因子为0-1得1分，1-2得2分，2-4得3分，大于4得4分；所述tnf-α因子为0-1得1分，1-2得2分，2-4得3分，大于4得4分；所述tlr5因子为0-1得1分，1-2得2分，2-4得3分，大于4得4分；所述白细胞为0-60得1分，60-120得2分，120-180得3分，大于180得4分；所述中性粒细胞为0-0.4得1分，0.4-0.8得2分，0.8-1.2得3分，大于1.2得4分；所述淋巴细胞为0-50得1分，50-100得2分，100-150得3分，大于150得4分；所述红细胞压积为0-10得1分，10-20得2分，20-30得3分，大于30得4分；所述血小板数为0-50得1分，50-70得2分，70-100得3分，大于100得4分；所述血小板压积为0-0.04得1分，0.04-0.08得2分，0.08-0.1得3分，大于0.1得4分；所述中间细胞为0-0.2得1分，0.2-0.8得2分，0.8-1.5得3分，大于1.5得4分；所述中间细胞比率为0-0.5得1分，0.5-1得2分，1-1.5得3分，大于1.5得4分；

所述总分是指所述26个指标得分的总和；

所述评价结论是指：当所述总分为30-45分，海马应激响应程度为正常（+）；当所述总分为45-60分，海马应激响应程度为轻微（++）；当所述总分为60-75分，海马应激响应程度为中度（+++）；当所述总分为75-90分，海马应激响应程度为较重（++++）；当所述总分为>90分，海马应激响应程度为重度（+++++）

一种海马应激响应的评价方法是根据前述的评价体系对海马应激响应进行评价，具体包括以下步骤：

（1）分别对海马样本进行体重、体长、肛门炎症严重程度、摄食状态、腹水、白细胞、中性粒细胞、淋巴细胞、红细胞压积、血小板数、血小板压积、中间细胞、中间细胞比率、杯状细胞数量、炎症细胞数量，hepcidin基因、leap基因、lysozyme基因、piscidin基因、il-1β因子、il-1βreceptor因子、il-2因子、il-10因子、ifn因子、tnf-α因子、tlr5因子，共26个指标的检测，并根据检测结果分别确定所述26个指标的症状区间；

（2）根据所述26个指标的症状区间，分别确定所述症状区间对应的得分，之后将26个指标的得分相加，得到所述海马样本的总分，之后根据所述总分对所述海马样本的应激响应进行评价，确定海马应激响应程度为正常、轻微、中度、较重或重度。

作为一种优选的方案，所述hepcidin基因的检测方法为荧光定量pcr分析法，使用的上游引物hepcidin-f为5’-tcgtgctcgcctttatttg-3’，下游引物hepcidin-r为5’-gttgctttgccgcttgtgt-3’；所述leap基因的检测方法为荧光定量pcr分析法，使用的上游引物leap-f为5’-gcaggcggaaggcaaag

tc-3’，下游引物leap-r为5’-tggcaaaaagcaccaaaag-3’；所述lysozyme基因的检测方法为荧光定量pcr分析法，使用的上游引物lysozyme-f为5’-tggtaaagaacaagacggaa-3’，下游引物lysozyme-r为5’-gacgaaa

acacgactggaga-3’；所述piscidin基因的检测方法为荧光定量pcr分析法，使用的上游引物piscidin-f为5’-ctggtcacgctcttcctg-3’，下游引物piscidin-r为5’-tgtcggttctcccaagc-3’。

更为优选的是，所述il-1β因子的检测方法为荧光定量pcr分析法，使用的上游引物il-1β-f为5’-caagcacaaccctaaccaca-3’，下游引物il-1β-r为5’-gagacctccaggctcaatcc-3’；所述il-1βreceptor因子的检测方法为荧光定量pcr分析法，使用上游引物il-1βreceptor-f为5’-cacgtcaggttgct

tcaagc-3’，下游引物il-1βreceptor-r为5’-gtcacgcctactgtgaggac-3’；

所述il-2因子的检测方法为荧光定量pcr分析法，使用的上游引物il-2-f为5’-actcgctccactggcttcc-3’，下游引物il-2-r为5’-ccctgctctgtgc

tcctca-3’；所述il-10因子的检测方法为荧光定量pcr分析法，使用的上游引物il-10-f为5’-tctcttcctcataaacgaca-3’，下游引物il-10-r为5’-cacccaataaaaacacactg-3’；所述ifn因子的检测方法为荧光定量pcr分析法，使用的上游引物ifn-f为5’-gagtgacaggtgtctgtctctgc-3’，下游引物ifn-r为5’-tcctccttctgtctgtgcatgac-3’；所述tnf-α因子的检测方法为荧光定量pcr分析法，使用的上游引物tnf-α-f为5’-tgccagcacagcagttcg-3’，下游引物tnf-α-r为5’-ttgccgccgtcc

gttt-3’；所述tlr5因子的检测方法为荧光定量pcr分析法，使用的上游引物tlr5-f为5’-caggaagttggtgctgggtt-3’，下游引物tlr5-r为5’-attgagtcggttttgagaga-3’。

本发明的有益效果在于：为海马应激反应提供系统的检测体系，为海马应激反应的用药提供参考。

本发明具有以下优势：

①海马具有特殊的生理构造，如肠道内壁为褶皱状、杯状细胞和炎症细胞的数量和分布与其它鱼类差异显著，缺乏脾脏和胸腺等中枢免疫器官等，使得海马的免疫应激响应具有明显的特异性，本发明针对这些特殊的生理构造，建立了针对海马的特异性应激响应评价体系和评价方法，客观地评估海马免疫应激的程度，对海马养殖从业者具有一定的指导意义。

②海马具有自身的独特生活习性，如运动能力较弱，喜欢栖息在附着基上，使得海马对环境因子变化和人为干扰极为敏感，养殖难度很大。本发明针对这些独特生活习性，建立了针对海马的特异性应激响应评价体系和评价方法，客观地评估各种因素变化对海马免疫应激的影响，为海马工厂化养殖业提供了有效的指导，促进了行业的健康发展。

③本发明的一种海马应激响应的评价体系及评价方法不仅针对海马的特殊的生理构造和独特生活习性，而且还针对海马自身特异的免疫基因进行分子水平的检测和分析，使得此评价体系和评价方法更具有科学性、客观性和预见性，对海马养殖业的快速发展具有不可估量的作用。

④本发明的一种海马应激响应的评价体系及评价方法涵盖生长、生理以及免疫指标，能够从行为、解剖以及分子层面系统评估海马的应激反应，这些指标能够从不同方面、多个层次检测海马的应激响应，而且评价体系能够反映应激的触发时间、响应模式以及强度，帮助我们掌握海马对不同胁迫因子的应激响应特征。

附图说明

图1是本发明实施例1中不同取样时间海马体重和体长的变化图；

图2是本发明实施例1中不同取样时间海马肛门炎症严重程度与腹水严重程度的变化图；

图3是本发明实施例1中不同取样时间应激响应后海马肠道免疫组化分析结果图；

图4是本发明实施例1中不同取样时间不同组别应激响应后海马血液免疫指标变化图；

图5是本发明实施例1中不同取样时间不同组别应激响应后海马肠道抗菌肽基因指标变化图；

图6是本发明实施例1中不同取样时间不同组别应激响应后海马肠道组织免疫因子指标变化图。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

以细菌侵染诱发肠炎为例，对海马的应激响应进行评价，具体过程包括：细菌侵染海马样品制备，26个指标的症状区间检测及对应的得分确定，海马应激响应程度的确定。

1.细菌侵染海马样品制备

选择120条5月龄的健康海马，平均体重和标准体长分别为（3.86±0.023）g和（9.58±0.037）cm。将其分为四组，且雌雄分开培养。以冷冻的糠虾作为食物，每天饲喂三次，每次饲喂两小时后将残留的食物残渣和粪便吸出。

用无菌生理盐水（pss）将致病菌株（edwardsiellatardayt1）分别稀释成10⁵cfu/ml、10⁷cfu/ml、10⁹cfu/ml，每个浓度注射25条海马，每条注射100ul，另有一组海马只注射100ul的pss。在相同饲喂条件下，每个浓度每次取样5条，其中3条用于分子生物学指标的检测，2条取肠道用于固定进行组织切片，实验过程中发现10⁹cfu/ml在21天内有死亡，无法保证取样的完整，因此将该数据舍弃。

2.26个指标的症状区间检测及对应的得分确定

将上述四组样品，分别在第0、1、3、7、14、21天取样，记录数据。首先称量海马的体重和体长；然后拍照记录外部症状；之后断尾取血，检测海马血液免疫指标的变化；解剖海马，记录腹腔内的病变情况；取肠道样品固定后进行免疫组化分析；其余肠道样品用于提取rna，并利用荧光定量分析免疫基因。

(1)外部指标

首先对应激后海马的体重、体长、肛门炎症严重程度、腹水严重程度、摄食状态进行了详细记录，具体见表1。结果显示海马的体重、体长、肛门炎症严重程度、腹水严重程度和摄食状态均对肠炎致病菌做出应激反应，具体结果见图1，应激响应之后海马的体长不再增加，体重显著下降；海马肛门炎症严重程度以及腹水的严重程度变化趋势一致，均在第14天时达到最严重的状态，具体见图2。

表1外部指标及得分情况

(2)免疫组化

肠道样品固定进行免疫组化检测和分析，结果结果见表2和如图3。结果显示：肠道组织中的杯状细胞数量在应激第1天处于下降状态，并在第14天达到最大值；炎症细胞数量在处理后第7天达到最大值，其后慢慢恢复，第21天数量与对照组数量一致。

表2免疫组化指标及得分情况

(3)血细胞

对海马的血细胞指标进行检测，结果见表3和图4。结果显示，应激响应后，白细胞、红细胞压积、淋巴细胞、血小板数、血小板压积、中间细胞、中间细胞比率、中性粒细胞在处理第七天显著升高（p<0.05），随后恢复。

表3血细胞指标及得分情况

（4）抗菌肽基因、免疫因子

根据海马的基因组设计需要检测基因的荧光定量分析引物，具体见表4，并进行荧光定量pcr分析，结果见表5、图5和6。结果显示所有11个指标都对肠炎致病菌的产生了应激做出反应，且变化趋势较为一致。

表4荧光定量分析引物序列

表5抗菌肽基因、免疫因子指标及得分情况

3.海马应激响应程度的确定

根据上述26个指标的症状区间，分别确定所述症状区间对应的得分，之后将26个指标的得分相加，得到所述海马样本的总分，之后根据所述总分对所述海马样本的应激响应进行评价，确定海马应激响应程度，具体结果见表6。

表6海马应激响应程度的确定

应当理解，以上所描述的具体实施例仅用于解释本发明，并不用于限定本发明。由本发明的精神所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之中。

序列表

<110>鲁东大学

<120>一种海马应激响应的评价体系及评价方法

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