一种大肠杆菌特异基因的引物及检测大肠杆菌的方法与流程

本发明属于大肠杆菌生物技术领域，更具体的涉及一种基于大肠杆菌特异基因检测大肠杆菌的方法。

背景技术：

大肠埃希菌(escherichiacoli)又称大肠杆菌，分类于肠杆菌科，归属于埃希氏菌属。大部分大肠杆菌是人和动物肠道中的正常寄居菌，大肠杆菌不断随粪便排出体外，污染周围环境和水源、食品等。取样检查时，样品中大肠杆菌越多，表示样品被粪便污染越严重，也表明样品中存在肠道致病菌的可能性越大。故应对饮水、食品、饮料进行卫生细菌学检查。大肠杆菌的感染可通过饮用受污染的水或进食未熟透的食物(特别是免治牛肉、汉堡扒及烤牛肉)而感染。饮用或进食未经消毒的奶类、芝士、蔬菜、果汁及乳酪而染病的个案亦有发现，此外，若个人卫生欠佳，亦可能会通过人传人的途径，或经进食受粪便污染的食物而感染该种病菌。患病或带菌动物往往是动物来源食品污染的根源。如牛肉、奶制品的污染大多来自带菌牛。带菌鸡所产的鸡蛋、鸡肉制品也可造成传播。带菌动物在其活动范围内也可通过排泄的粪便污染当地的食物、草场、水源或其他水体及场所，造成交叉污染和感染，危害极大。

大肠杆菌作为饮水、食品等的粪源性污染卫生细菌学指标；而且其再外界存活时间与一些主要肠道病原菌相近。它的出现也可能预示某些肠道病原菌(如沙门氏菌、志贺氏菌)的存在。大肠杆菌是国际上公认的卫生监测指示菌，因此大肠杆菌的检测技术显得十分重要。

化妆品是人们日常生活中必需品，但因为其成分中含有丰富的蛋白质、脂肪、多种维生素、无机盐和水分等，且ph＝4～7，极有利于微生物的生长和繁殖，《化妆品卫生规范》中规定，每克或每毫升产品中不得检出粪大肠菌群，长期以来，化妆品的微生物检验方法对一些致病性粪大肠菌群检出率很低。

目前病原菌的检测主要依靠常规的细菌学培养方法、免疫学方法、核酸探针技术等。细菌学培养方法需经富集培养、选择性分离、形态特征观察、生理生化反应、血清学鉴定等过程，一般需4到7天，操作繁琐、费时耗力并且敏感性低、特异性差，且无法检测受损菌及死菌；免疫学方法易污染，且交叉反应比较严重、假阳性多、灵敏度偏低；核酸探针检测技术的最大优点是特异性强，但探针检测技术中也存在一定的问题，如灵敏度不够高；检测一种菌就需制备一种探针。

聚合酶链式反应(pcr)一种用于放大扩增特定的dna片段的分子生物学技术，它可看作是生物体外的特殊dna复制，pcr的最大特点，是能将微量的dna大幅增加。因此，无论是化石中的古生物、历史人物的残骸，还是几十年前凶杀案中凶手所遗留的毛发、皮肤或血液，只要能分离出一丁点的dna，就能用pcr加以放大，进行比对。环介导等温扩增法(lamp)一种全新的核酸扩增方法，lamp法的特征是针对靶基因上的六个区域设计四条引物，利用链置换型dna聚合酶在恒温条件下进行扩增反应，可在15-60分钟内实现快速扩增，反应能产生大量的扩增产物即焦磷酸镁白色沉淀，可以通过肉眼观察白色沉淀的有无来判断靶基因是否存在。

本发明利用生物信息学寻找出大肠杆菌特异基因，并针对其设计引物，分别建立了pcr和lamp两种大肠杆菌的检测方法，实现了简便、快速、准确的检测出大肠杆菌的目的。

技术实现要素：

为解决上述现有技术存在的问题，本发明的目的在于本发明目的在于通过生物信息学手段获取可用于鉴定大肠杆菌的基因，该基因为假定蛋白(hypotheticalprotein)基因(genbank登录号为13702648)，其核苷酸序列如seqidno:5所示，该基因为大肠杆菌特有。

为达到上述目的，本发明的技术方案为：一种大肠杆菌特异基因的引物，所述大肠杆菌特异基因的核苷酸序列如seqidno:5所示，所述引物包括外游引物和内游引物，所述外游引物为b3，f3，分别如seqidno:1，seqidno:2所示，所述内游引物bip，fip，分别如seqidno:3，seqidno:4所示。

一种基于所述引物检测大肠杆菌的方法包括应用聚合酶链式反应检测大肠杆菌和应用环介导等温扩增检测大肠杆菌。

进一步的，所述方法用于水、食品、饮料以及化妆品的检测。

进一步的，应用聚合酶链式反应检测大肠杆菌，包括以下步骤：

(1)提取待检测样品的模板dna；

(2)pcr扩增反应：

反应体系：2×tsingkemastermix12.5μl，10μm的外游引物b3和f3各1.0μl，模板dna1.0μl，加去核酸酶水补足25μl；反应条件：95℃5min；95℃30s,54℃30s,72℃30s,30个循环；72℃7min；

(3)用琼脂糖凝胶电泳方法判断检测结果。

进一步的，应用环介导等温扩增检测大肠杆菌，包括以下步骤：

(1)提取待检测样品的模板dna；

(2)环介导等温扩增：

反应体系：8ubst2.0，内游引物fip和bip各1.6μm，外游引物b3和f3各0.2μm，模板dna1.0μl，1.0mmdntp，7.6mmmgso4，2.5μl10×biolabsbuffer，加去核酸酶水补足25μl；反应条件：65℃扩增35min，80℃变性2min；

(3)用琼脂糖凝胶电泳方法判断检测结果或者直接用肉眼观察反应体系是否变浑浊判断检测结果。

进一步的，经琼脂糖凝胶电泳检测，阳性结果出现条带，阴性结果无阳性扩增产物。

一种基于所述引物应用pcr检测大肠杆菌的试剂盒，由2×tsingkemastermix12.5μl，10μm的外游引物b3和f3各1.0μl，模板dna1.0μl，加去核酸酶水补足25μl组成。

一种基于所述引物应用环介导等温扩增检测大肠杆菌的试剂盒，由8ubst2.0，内游引物fip和bip各1.6μm，外游引物b3和f3各0.2μm，模板dna1.0μl，1.0mmdntp，7.6mmmgso4，2.5μl10×biolabsbuffer，加去核酸酶水补足25μl组成。

相对于现有技术，本发明的有益效果为：

1、通过本地blast比对分析，获得大肠杆菌的特异基因；针对特异基因设计特异引物，特异性高，该引物可以快速、简便、准确的检测大肠杆菌。

2、本发明利用pcr反应，灵敏度高，不需要分离病毒或细菌及培养细胞。

3、本发明还提供了lamp检测大肠杆菌，可在1.5小时内完成检测，检测结果可用肉眼观察，检验结果灵敏特异。该检验仅需65℃恒温即可完成检测，无需其他特殊试剂与设备，检测快捷廉价。同时，该反应体系加入样本后，无需再次打开反应管进行操作，可有效避免气溶胶污染导致的假阳性。

4、本发明可用于水、食品、饮料以及化妆品等样本中大肠杆菌的检测，具备灵敏度高、特异性好、检测方便快捷的特点。

附图说明

图1为本发明pcr鉴定体系的特异性检测结果，泳道1至泳道6的反应模板依次为铜绿假单胞菌、金黄色葡萄菌、表皮葡萄球菌、粪肠球菌、志贺氏菌和肺炎克雷伯菌，泳道7至泳道12为大肠杆菌的基因，泳道13为阴性对照。

图2为本发明pcr鉴定体系的灵敏度检测结果，泳道1到泳道9的反应模板菌液梯度稀释做模板，其浓度依次为10⁸、10⁷、10⁶、10⁵、10⁴、10³、10²、10¹、10⁰泳道，泳道10为去核酸酶水作为模板的阴性对照。

图3为本发明lamp鉴定体系的特异性检测结果，其中泳道1到泳道6的反应模板为大肠杆菌的基因组，泳道7到泳道12反应模板依次为铜绿假单胞菌、金黄色葡萄菌、表皮葡萄球菌、粪肠球菌、志贺氏菌和肺炎克雷伯菌，泳道13为阴性对照。

图4a为本发明lamp鉴定体系的灵敏度检测结果，泳道1到泳道10为质粒梯度稀释做模板，其浓度依次为10⁹、10⁸、10⁷、10⁶、10⁵、10⁴、10³、10²、10¹、10⁰；泳道11为去核酸酶水作为模板的阴性对照，图4b为其中直接裂解梯度稀释后菌液做模板的结果，泳道1到泳道9的反应模板是，其浓度依次为10⁸、10⁷、10⁶、10⁵、10⁴、10³、10²、10¹、10⁰，泳道10为去核酸酶水作为模板的阴性对照。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式对本发明技术方案做进一步详细描述：

实施例1：特异性靶基因筛选及引物设计

1、本地blast分析

从ncbi(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/)中下载大肠杆菌全基因组序列，对本地的核酸数据库进行本地blast检索，获取得到菌种各序列片段与数据库比对结果。

2、blast重确认

使用在线blast功能，使用2种策略确认其菌种特异性和菌种鉴定可用性。一种策略为blast时排除目的菌种，结果显示无任何相似序列者为目的菌种特异基因；第二种策略为blast时选择在目的菌种内进行检索，结果返回大量相似序列者是目的菌种的不同菌株共有序列。结合两种策略，最终找出符合两种策略标准的目的基因。

3、引物设计

本试验以hypotheticalprotein基因，genebank登陆号为13702648(4076657..4077097)设计特异引物。特异引物通过在线设计特异性寡核苷酸引物工具primerexplorerv5software(https://primerexplorer.jp/lampv5/index.html)设计完成，包括一对外游引物和一对内游引物，该引物用于lamp技术检测，其中外游引物还用作pcr反应的上、下游引物，用于大肠杆菌的鉴定。

实施例2：检测方法的建立

一、dna的提取

(1)用北京庄盟国际生物基因科技有限公司的细菌基因组dna小量提取试剂盒进行抽提回收，步骤如下：

①取细菌培养液5ml，12,000rpm离心1分钟，尽量吸净上清。

②向留有菌体沉淀的离心管中加入500μl细胞悬浮液，使用移液器或涡旋振荡器彻底悬浮细菌细胞沉淀，37℃温浴30分钟。每隔10分钟颠倒混匀数次。12,000rpm离心2分钟，尽量吸净上清。

③向菌体沉淀中加入225μl缓冲液a，振荡至菌体彻底悬浮。

④向管中加入6μlrnasea溶液，振荡15秒，室温放置5分钟。

⑤向管中加入10μl蛋白酶k溶液，颠倒混匀。

⑥加入25μl裂解缓冲液s，颠倒混匀。

⑦加入250μl缓冲液b，振荡10秒，70℃放置10分钟。12，000rpm离心1分钟，取上清放入一新管中，弃去沉淀。

⑧加入250μl无水乙醇，充分振荡混匀15秒，此时可能会出现絮状沉淀，瞬时离心以去除管盖内壁的水珠。

⑨将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱中(吸附柱放入收集管中)，12,000rpm离心30秒，倒掉废液，将吸附柱放入收集管中。

⑩向吸附柱中加入500μl缓冲液c，12,000rpm离心30秒，倒掉废液，将吸附柱放入收集管中。

向吸附柱中加入700μl漂洗液w2，12,000rpm离心30秒，倒掉废液，将吸附柱放入收集管中。

向吸附柱中加入500μl漂洗液w2，12，000rpm离30秒，倒掉废液，将吸附柱放回收集管中。然后12,000rpm离心2分钟。将吸附柱置于一个新的1.5ml离心管中，室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。

将吸附柱转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加100μl洗脱缓冲液te，室温放置2分钟，12,000rpm离心2分钟，将溶液收集到离心管中。

(2)使用直接裂解液，其配方为：

溶液a：125mmnaoh，1mmedta,0.1％tween20；

溶液b：125mmhcl，10mmtris-hcl.

取菌样加入10μl溶液a65℃孵育10min，加入10μl溶液b，混匀即可。

二、阳性质粒载体构建及获得

(1)靶序列pcr扩增

以大肠杆菌的基因组dna为模板，对特异基因进行pcr扩增，将其扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳验证。

(2)目的产物的回收

从琼脂糖凝胶中切下目的片段，用北京庄盟国际生物基因科技有限公司的小量琼脂糖凝胶dna回收试剂盒进行抽提回收，步骤如下：

①将单一的目的dna条带从琼脂糖凝胶中切下(尽量切除多余部分)放入干净的离心管中，称取重量。

②向胶块中加入2倍体积溶胶液，55℃水浴10分钟，其间不断温和地上下翻转离心管，以确保胶块充分溶解。

③将上一步所得溶液加入一个吸附柱中，12,000rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放入收集管中。

④向吸附柱中加入700μl漂洗液w2，12,000rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放入收集管中。

⑤向吸附柱中加入500μl漂洗液w2，12,000rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放入收集管中。

⑥将吸附柱放入收集管中，12,000rpm离心2分钟，尽量除去漂洗液。

⑦将吸附柱置于室温放置数分钟，彻底晾干。将吸附柱放入一个干净离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加30μl的洗脱缓冲液te，室温放置2分钟。12,000rpm离心2分钟，收集dna溶液。

(3)连接、转化及筛选

1)大肠杆菌dh5α感受态细胞的制备

①挑取单个dh5α菌落，接种于3ml不含氨苄青霉素的lb培养基中，37℃培养过夜，次日取上述菌液按比例1:100再接种于50mllb培养基中，37℃振荡2小时。当od600值达到0.35时，收获细菌培养物。

②将细菌转移到一个50ml预冷的无菌聚丙烯管中，冰上放置10分钟，使培养物冷却。

③于4℃下4100rpm离心10分钟，吸出培养液，并将管倒置l分钟以使残留的培养基流尽。

④每50ml初始培养液且30ml预冷的0.1mol/lcacl2-mgcl2溶(80mmol/lmgcl2，20mmol/lcacl2)重悬细胞沉淀。

⑤于4℃下4100rpm离心10分钟，吸出上清液，并将管倒置l分钟以使残留的液体流尽。

⑥每50ml初始培养物用2ml预冷的0.1mol/lcacl2溶液重悬细胞沉淀，分装后备用。

2)连接到pmd19-tsimple

①在微量离心管中加入1μltakarapmd19-tsimple载体、4μl目的基因基因pcr产物及5μl的连接酶缓冲混合物。

②16℃反应过夜。

3)转化dh5α

①全量(10μl)加入至100μldh5α感受态细胞中，冰中放置30分钟。

②42℃加热90秒后，再在冰中放置1分钟。

③加入37℃温浴过的lb培养基890μl，37℃缓慢振荡培养60分钟。

④取200μl涂布于含有氨苄青霉素的lb培养基上，37℃培养16h以形成单菌落。

(4)阳性克隆的筛选

挑取上述单菌落于含氨苄青霉素的lb培养基中，37℃缓慢振荡培养4h，以m13f和m13r为引物进行菌落pcr扩增。对扩增产物用1.5％琼脂糖凝胶电泳后紫外观察，将经pcr验证正确的阳性克隆送上海生物工程有限公司进行测序。

(5)阳性质粒提取

挑取上述单菌落于含氨苄青霉素的lb培养基中，37℃缓慢振荡培养4h，进行pcr扩增。扩增引物及扩增条件同前述最优反应条件。将经pcr确证的阳性克隆，接种于lb液体培养基，37℃，160rpm培养过夜。取每个菌株过夜培养液5ml，用北京庄盟国际生物基因科技有限公司小量质粒提取试剂盒进行质粒抽提，具体操作步骤如下：

1)取5ml过夜培养的菌液，加入离心管中，12,000rpm离心1分钟，尽量吸除上清。

2)向留有菌体沉淀的离心管中加入250μl溶液1，使用移液器或涡旋振荡器彻底悬浮细菌沉淀。

3)向离心管中加入250μl溶液2，温和地上下翻转6－8次使菌体充分裂解。

4)向离心管中加入350μl溶液3，立即温和地上下翻转6–8次，充分混匀，即出现白色絮状沉淀。12,000rpm离心10分钟，此时在离心管底部形成沉淀。将上一步收集的上清液用移液器转移到吸附柱中，12,000rpm离心60秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放入收集管中。

5)向吸附柱中加入700μl漂洗液w2，12,000rpm离心30-60秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放入收集管中。

6)向吸附柱中加入500μl漂洗液w2，12,000rpm离心60秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放入收集管中。

7)将吸附柱放入收集管中，12,000rpm离心2分钟，置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。

8)将吸附柱置于一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位滴加60μl洗脱缓冲液te，室温放置2分钟，12,000rpm离心1分钟将质粒溶液收集到离心管中。

(6)阳性质粒浓度测定

打开thermoscientificbiomate3s紫外分光光度计，预热15分钟；选定mode方式为dsdna，将比色杯用超纯水反复洗几次后加入60μlte缓冲液调零；将te缓冲液完全吸出，然后加入待测样品(2μl样品加入58μlte缓冲液)，选定稀释倍数为30倍进行测定，读取质粒dna浓度。

(7)质粒数目换算及梯度稀释

阳性质粒测完浓度后，分别根据其所测浓度换算成质粒数目。质粒数目换算公式为(注：x为质粒浓度ng/μl；y为目的产物碱基对数；na为阿伏伽德罗常数；2692为载体碱基对数；660为碱基平均分子量)。取已知浓度的质粒进行10倍梯度稀释到底。

三、菌落计数

(1)菌液的培养

配制lb固体培养基，用高压蒸汽灭菌锅灭菌121℃，20min。将在-80℃冰箱中保藏的菌种接种于新鲜的mh液体培养基，37℃震荡培养12小时。

(2)稀释平板计数法计数及其步骤

1)熔化培养基

2)倒平皿

3)梯度稀释法稀释原菌样品

4)涂平皿：

选取1/10⁶，1/10⁷，1/10⁸三个稀释度计数，每皿取菌液0.1ml，用玻璃刮铲涂布均匀，每个稀释度做一个重复。

5)37℃倒置培养2天

6)计数：

每ml原菌样品中微生物的活细胞数(菌落形成数，cfu＝(同一稀释度平板上菌落平均数×稀释倍数)/原菌样品体积(ml)

四、建立pcr鉴定体系

(1)pcr条件优化

对退火温度进行优化。退火温度为6个梯度，50、52、54、56、58、60℃。具体反应体系为：2×tsingkemastermix12.5μl，10μm的上游引物和下游引物各1.0μl，模板dna1.0μl，加去核酸酶水补足25μl。

(2)在pcr仪中按以下程序扩增：

预变性95℃5min；95℃30s,54℃30s,72℃20s,30个循环；后扩增72℃1min。

(3)特异性检测

收集大肠杆菌分离株241株(大肠杆菌来源于水、食品、饮料以及化妆品)，铜绿假单胞菌、金黄色葡萄菌、表皮葡萄球菌、粪肠球菌、志贺氏菌和肺炎克雷伯菌各一株，使用试剂盒提取该247株菌的基因组，利用最优的反应条件进行特异性检测。

如图1所示的鉴定体系的特异性检测结果，铜绿假单胞菌、金黄色葡萄菌、表皮葡萄球菌、粪肠球菌、志贺氏菌和肺炎克雷伯菌扩增均为阴性，大肠杆菌扩增均为阳性；结果表明本发明特异性良好。

(4)灵敏度检测

利用计数后的菌液进行10倍梯度稀释后并与小鼠血液按1:1体积混合，使用直接裂解液获得基因组作为模板进行pcr扩增，其反应体系为：2×tsingkemastermix12.5μl，10μm的上游引物和下游引物各1.0μl，模板dna1.0μl，加去核酸酶水补足25μl。反应程序为：95℃5min；95℃30s,54℃30s,72℃30s,30个循环；72℃7min。

如图2所示的pcr鉴定体系的灵敏度检测结果显示，当模板浓度为10⁰个也就是1个拷贝即可扩增得到阳性条带，阴性对照无条带，表明本检测体系灵敏度极高。

五、建立lamp鉴定体系

(1)lamp反应

反应体系为8ubst2.0，内游引物fip和bip各1.6μm，外游引物b3和f3各0.2μm，模板dna1.0μl，1.0mmdntp，7.6mmmgso4，2.5μl10×biolabsbuffer，加去核酸酶水补足25μl。反应条件：65℃扩增35min，80℃变性2min。

(2)特异性检测

利用大肠杆菌分离株241株(大肠杆菌来源于水、食品、饮料以及化妆品)，铜绿假单胞菌、金黄色葡萄菌、表皮葡萄球菌、粪肠球菌、志贺氏菌和肺炎克雷伯菌各一株，使用试剂盒提取该247株菌的基因组进行特异性检测。

如图3所示的lamp鉴定体系的特异性检测结果，大肠杆菌的基因组呈阳性，泳道7到泳道12的铜绿假单胞菌、金黄色葡萄菌、表皮葡萄球菌、粪肠球菌、志贺氏菌和肺炎克雷伯菌均呈阴性，结果表明本发明特异性良好。

(3)灵敏度检测

利用计数后的菌液进行10倍梯度稀释后并与小鼠血液按1:1体积混合，使用直接裂解液获得基因组作为模板进行lamp扩增反应。

如图4所示的lamp鉴定体系的灵敏度检测结果显示，不管使用阳性质粒还是稀释后的细菌作为模板，模板浓度为10⁰个也就是1个拷贝均可扩增得到阳性条带，阴性对照无条带，表明本检测体系灵敏度极高。

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何不经过创造性劳动想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求书所限定的保护范围为准。

序列表

<110>昆明理工大学

<120>一种大肠杆菌特异基因的引物及检测大肠杆菌的方法

<160>5

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>18

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

acctcgcaacgttgattg18

<210>2

<211>18

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

accttcaccttccttacg18

<210>3

<211>49

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

cggaaatgcgttgtcttcaatacatttttcgactggtgttaaaacagct49

<210>4

<211>47

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>4

aagattgtagaaaatagccgtggtttttacatcagaaaagcgcagta47

<210>5

<211>441

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>5

ttgtttttccgtaatcgcaaaaatattgccatgaccataaaagaaaaattctcacaaaaa60

tatccccatgcttccttttgtacttttggcgattcagcagcgttggccgatcacctcgca120

acgttgattgcgactggtgttaaaacagcttcctgtggttcgctggcgggatgtattgaa180

gacaacgcatttccgatgattggtgagtataagattgtagaaaatagccgtggtgagcct240

gtatgtgttatcagagtgattggcctgcatttactgcgcttttctgatgtcaccgtggag300

cttgcccgtaaggaaggtgaaggtgacctcagtcttgaatattggcgtaatgaacaccgt360

cgttttttccaggcagaaggaagctattcaccagaaatggacgttatatttgaagaatat420

gcccttattgacgttgtgtag441