膀胱癌诊断系统、试剂组合和检测尿液中目的基因甲基化水平的方法与流程

本发明属于生物医学检测领域。具体地，本发明涉及膀胱癌的无创检测方法。更具体地，本发明涉及利用膀胱癌的dna甲基化生物标志物的膀胱癌无创检测方法。

背景技术：

膀胱癌是一种常见且高致死率的恶性肿瘤。据统计，全球每年大约有429800例新增病例和165100例死亡病例。传统的膀胱癌检查是膀胱镜检查和细胞学活检，但膀胱镜检查属于有创检查，费用高且会给患者带来一定痛苦，并且其结果可能会受操作者主观判断而带来一定的误差；而细胞学活检则存在灵敏度低的缺陷(34％左右)。因此，无创检测成为膀胱癌检测的重要发展方向之一。

dna甲基化是与许多基因活性和生物过程相关的重要表观遗传修饰。dna的频繁表观遗传改变可导致癌症的进展，并与许多癌症包括膀胱癌相关联。dna甲基化检测的优势之一在于其不仅可以采用肿瘤组织，也可以采用体液如血液、唾液、尿液等进行肿瘤诊断，实现无创无痛。研究发现，与膀胱癌相关的dna甲基化可用于膀胱癌的诊断，并可作为膀胱癌治疗的靶点。

高分辨溶解曲线聚合酶链反应(hrm-pcr)是一种不需要pcr产物后续操作的、简单、灵敏、快速且低成本的检测基因甲基化水平的技术。该方法在甲基化修饰位点附近设计实时定量pcr引物，对来自经重亚硫酸盐修饰的dna的相关区进行特异性pcr扩增。ms-hrm具有高敏感性，可以区分扩增产物中少至1个碱基变化的序列差异。

目前仍需对膀胱癌的dna甲基化生物标志物进行广泛评估，发展一种高效且准确的膀胱癌无创检测方法。

技术实现要素：

本发明人经过广泛的研究筛选，识别到一组甲基化敏感基因，即hoxa9、pcdh17、pou4f2和onecut2基因。在膀胱癌患者中，上述基因在特定位点发生高度甲基化。因此，通过检测hoxa9、pcdh17、pou4f2和onecut2基因组合的甲基化水平，可以进行膀胱癌的检测和/或诊断，包括膀胱癌的早期筛查、受试者发生膀胱癌的风险评估、膀胱癌的分型和/或预后预测。

本发明的目的在于提供一种膀胱癌的无创检测方法。另外，本发明的目的还在于提供一种检测尿液中目的基因甲基化水平的方法。

一方面，本发明提供一种膀胱癌的无创检测方法，包括：

1)提供尿液样品，提取尿液中dna；

2)将步骤1)中提取的dna进行亚硫酸氢盐转化处理；

3)测定目的基因甲基化水平，所述目的基因包括：hoxa9、pcdh17、pou4f2和onecut2，检测到甲基化则甲基化水平记为1，未检测到甲基化则甲基化水平记为-1；

4)将步骤3)得到的目的基因甲基化水平带入风险评分模型中，获得g值，

其中，所述风险评分模型为：g＝(6.096×hoxa9甲基化水平)+(3.517×pcdh17甲基化水平)+(4.582×pou4f2甲基化水平)+(5.268×onecut2甲基化水平)；

5)根据g值，得到膀胱癌检测结果，

其中，当g值高于设定值时，判断为高危型膀胱癌；当g值等于或低于设定值时，判断为低危型膀胱癌。

根据一个具体实施方案，步骤5)中，设定值为-1.893。

根据一个具体实施方案，尿液样品为尿沉淀样品，如尿沉渣。

根据一个具体实施方案，步骤1)中，尿液样品的收集管里预存edta溶液，在收集尿液后混匀。这有助于尿液样品的保存，减少长期尿液保存过程中的dna降解，进而提高尿液dna的提取产量。

根据一个具体实施方案，步骤3)中，目的基因甲基化水平是通过高分辨溶解曲线聚合酶链反应(hrm-pcr)、甲基化特异性pcr(ms-pcr)、m-mlpa、焦磷酸测序、maldi-tof测定的。

根据一个优选实施方案，目的基因甲基化水平是通过hrm-pcr测定的。利用hrm-pcr进行甲基化检测具有操作方便、低成本、低假阳性率、低干扰率的优点，可广泛适用于科研实验以及临床检测。

本发明为膀胱癌提供了一个简单无创的检测方法，非常适合于膀胱癌的诊断。

另一方面，本发明提供一种膀胱癌诊断系统，包括信息获取模块、计算模块和诊断模块，

其中，信息获取模块用于执行获取受试者检测信息的操作，所述检测信息包括受试者样品中目的基因的甲基化水平，所述目的基因包括：hoxa9、pcdh17、pou4f2和onecut2，其中，检测到甲基化则甲基化水平记为1，未检测到甲基化则甲基化水平记为-1；

计算模块用于执行将目的基因的甲基化水平代入风险评分模型，计算g值的操作，风险评分模型为：g＝(6.096×hoxa9甲基化水平)+(3.517×pcdh17甲基化水平)+(4.582×pou4f2甲基化水平)+(5.268×onecut2甲基化水平)；

诊断模块用于执行根据g值判断受试者健康状况的操作，其中，当g值高于设定值时，则判断为高危型膀胱癌；当g值等于或低于设定值时，则判断为低危型膀胱癌。

根据一个具体实施方案，诊断模块中，设定值为-1.893。

根据一个优选实施方案，膀胱癌诊断系统还包括结果输出模块，所述结果输出模块用于输出诊断模块得出的判断。

另一方面，本发明提供一种试剂组合，包括核苷酸序列如seqidno：1和seqidno：2所示的引物对1、核苷酸序列如seqidno：3和seqidno：4所示的引物对2、核苷酸序列如seqidno：5和seqidno：6所示的引物对3，以及核苷酸序列如seqidno：7和seqidno：8所示的引物对4，所述试剂组合用于检测尿液中目的基因的甲基化水平，所述目的基因包括：hoxa9、pcdh17、pou4f2和onecut2。

根据一个具体实施方案，试剂组合还包括选自lcgreen^plus、lcgreen、evagreen或syto9的饱和荧光染料。

优选地，试剂组合包括lcgreen^plus饱和荧光染料。实验证明，lcgreen^plus饱和荧光染料的敏感性较高，可以提高检测灵敏度。

根据一个具体实施方案，试剂组合是用于膀胱癌的早期筛查、受试者发生膀胱癌的风险评估、膀胱癌的分型和/或预后预测的试剂盒。

根据一个具体实施方案，上述试剂盒包括用于容纳各试剂的容器，以及使用说明书，其中标明检测实验步骤以及结果判定标准等。

另一方面，本发明提供一种检测尿液中目的基因甲基化水平的方法，所述目的基因选自：hoxa9、pcdh17、pou4f2和onecut2，所述方法包括以下步骤：

1)离心处理尿液样品，提取dna；

2)将步骤1)中提取的dna进行亚硫酸氢盐转化处理；

3)利用上述试剂组合，测定目的基因的甲基化水平。

根据一个具体实施方案，尿液样本的体积为20ml以上，优选中段尿。

根据一个具体实施方案，尿液样品为尿沉淀样品，如尿沉渣。

根据一个具体实施方案，步骤1)中，尿液样品的收集管里预存edta溶液，在收集尿液后混匀。这有助于尿液样品的保存，减少长期尿液保存过程中的dna降解，进而提高尿液dna的提取产量。

根据一个具体实施方案，步骤3)中，目的基因的甲基化水平是通过高分辨溶解曲线聚合酶链反应(hrm-pcr)、甲基化特异性pcr(ms-pcr)、m-mlpa、焦磷酸测序、maldi-tof测定的。

根据一个优选实施方案，目的基因的甲基化水平是通过hrm-pcr测定的。利用hrm-pcr进行甲基化检测具有操作方便、低成本、低假阳性率、低干扰率的优点，可广泛适用于科研实验以及临床检测。

本发明的膀胱癌的无创检测方法可以实现膀胱癌的早期筛查、受试者发生膀胱癌的风险评估、膀胱癌的分型和/或预后预测，提高了诊断的灵敏度、特异性和准确性，实现了无创、便捷、高效、快速诊断膀胱癌的效果。

通过准确的风险评估预测(阳性预测值为100％，阴性预测值为98％)，本发明的膀胱癌的无创检测方法在无症状或症状不明显人群中的接受度高，可用于常规体检，减少了低危型(即低风险)患者的不必要的侵入性检查。

本发明的检测尿液中目的基因甲基化水平的方法操作简便、节省了检测时间、结果清晰可靠。

本发明的试剂组合/试剂盒具有如下优点：操作简便、节省诊断/检测时间、结果清晰可靠。利用本发明的试剂组合/试剂盒，可以实现无创、便捷、高效、快速诊断膀胱癌的效果。

本发明的试剂组合适用性强，可广泛适用于科研实验以及临床检测。并且，由于本发明的试剂组合/试剂盒适用于无创检测，无症状或症状不明显人群的接受度高，可用于常规体检。

此外，本发明人所设计的引物特异性强，提高了扩增效果以及检测效率，获得的检测结果具有高可信度。

附图说明

图1为检测尿液样品中目的基因甲基化水平的实验流程示意图。

图2为利用本发明的风险评分模型对81例样本队列(44例膀胱癌和37例正常对照)进行膀胱癌预测的受试者工作特征(roc)曲线，其中，横坐标为特异性，纵坐标为灵敏度。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。

本说明书中所述“标志物”是指具有特异性生物学特性、生物化学特征或者方面的分子指示物，其可用于确定存在或不存在特定疾病或状况和/或特定疾病或状况的严重程度。

本说明书中所述“高(度)甲基化”是指在一个基因序列中cpg存在高度甲基化、羟甲基化、醛甲基化或羧甲基化修饰。

本领域技术人员知晓，dna在进行亚硫酸氢盐转化处理后，其中未发生甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶，而发生甲基化的胞嘧啶保持不变。

本说明书中所述“样本”或“样品”包括从任何个体(如有泌尿系统疾病相关症状的受试者)中获得的、适合于dna甲基化状态检测的物质。膀胱癌病人的尿液中混有少量脱落的肿瘤细胞。因此，样品优选为尿液样品或经过加工的尿液样品(特别是尿沉淀)。

实施例1

样品处理(尿液样品)

1)在预存有600uledta溶液的尿液收集管里，收集30ml尿液，混匀后在3000g下离心10分钟；

2)采用qiagen试剂盒提取尿液dna；

3)采用ezgold甲基化试剂盒，对尿液dna进行亚硫酸氢盐转化。

尿液保存条件：保存时间小于48小时时，保存在4℃；保存时间超过48小时，则保存于-80℃。

实施例2

hrm-pcr检测基因甲基化水平

高溶解曲线聚合酶链反应(hrm-pcr)实验如下进行：

1)准备hrm-pcr所需试剂(1个反应)：

a.5ul的2xzymopremix；

b.0.5ul的引物，引物序列如seqidno：1～8所示；

c.0.5ul的lcgreen^plus饱和荧光染料；

d.3ul的水；

e.1ul的样品，该样品已依照实施例1的方法处理；

2)进行hrm-pcr测定，获得基因甲基化水平，反应步骤和条件如下：

a.在95.0℃下预活化10分钟；

b.在95.0℃下变性15秒，在60.0℃下退火30秒，在72.0℃下延伸15秒，以此进行50个循环；

c.按照如下反应条件，获得hrm曲线：以1.6℃/秒的速率将温度从72.0℃升至95.0℃，并保持15秒；再以0.025℃/秒的速率冷却至60.0℃；然后以0.025℃/秒的速率从60.0℃升至95.0℃，保持15秒，并以1.6℃/秒的速率冷却至60.0℃。

实施例3

膀胱癌风险评分模型的构建

1.样本收集

收集81例人类尿样，包括44例膀胱癌患者和37例正常人对照。

2.模型构建

对4个选定基因(hoxa9、pcdh17、pou4f2和onecut2)的甲基化水平进行单变量和多变量逻辑回归分析，构建包含4个基因的检测模型。利用实施例2的方法，分别获得各个样品中4个基因的甲基化水平，检测实验的操作流程如图1所示。首先，进行单变量逻辑回归分析。该4个选定的基因都与膀胱癌显着相关。然后进行多变量逻辑回归分析，获得4种基因的回归系数。

所有统计分析均使用spss19.0(statisticalproductandservicesolutions，ibmcorporation,armonk，纽约，美国)和r3.4.2版(rfoundationforstatisticalcomputing，维也纳，奥地利)进行。

基于这4个基因的甲基化水平，创建可用于膀胱癌检测/诊断的风险评分模型：g＝(6.096×hoxa9甲基化水平)+(3.517×pcdh17甲基化水平)+(4.582×pou4f2甲基化水平)+(5.268×onecut2甲基化水平)。其中，利用hrm-pcr方法检测到基因甲基化则该基因的甲基化水平记为1，未检测到基因甲基化则该基因的甲基化水平记为-1。

3.结果

当g值高于-1.893时，判断为高危型膀胱癌(高风险)；当g值等于或低于-1.893时，判断为低危型膀胱癌(低风险)。如图2所示，上述风险评分模型进行膀胱癌诊断的特异性达73.2％，灵敏度达90.5％，auc值为0.871，表明对膀胱癌检测/诊断具有良好的指示作用。

实施例4

试剂盒的制备

制备试剂盒，包含：如表1所示的引物序列，2×zymotaqqpcrpremix(购自zymoresearch公司)，lcgreen^plus(购自biofirediagnostics,inc.，盐湖城，犹他州，美国)，rnase-free和dnase-free的纯水。

表1.

利用上述制备好的试剂盒，采用hrm-pcr方法，检测目的基因的甲基化水平，获得了高灵敏度、特异性和准确性的检测结果。

上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本申请权利要求的保护范围内。

序列表

<110>宽盈医疗科技（上海）有限公司

<120>膀胱癌诊断系统、试剂组合和检测尿液中目的基因甲基化水平的方法

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