本发明涉及数字pcr技术领域，具体涉及一种从肿瘤组织检测ros1基因融合变异的方法及其试剂盒。
背景技术：
ros1属于酪氨酸激酶胰岛素受体家族成员之一，属于原癌基因。其编码的蛋白，激活与细胞分化、增殖、生长及存活相关的信号通路。最常见的致变性突变为基因重排，可在多种肿瘤细胞系中进行表达，导致ros1融合蛋白成为处于持续激活状态的酪氨酸激酶，造成细胞过度生长和增殖。在nsclc患者中的突变率约为2％左右。ros1重排位点相对保守，主要在外显子32-36区域，有多个融合伴侣，常见的有slc34a2和cd74。目前ros1基因融合常见的方法主要有荧光原位杂交(fish)、免疫组化(ich)、逆转录荧光pcr(rt-pcr)和二代测序(ngs)等方法，这些方法都有不同程度的漏检，有些方法检测流程复杂。ros1包含ros17个外显子(exon36-42)激酶域的3’端与多种融合伴侣融合，使自身3’端与5’端产生了明显的表达差异，基于这一表达特点，本发明设计了通过以参照基因mrna表达量进行归一化，检测ros1基因mrna的3’端表达量与5’端表达量的定量差异来检测融合突变。
技术实现要素：
为了解决上述关键问题，本发明提供一种从肿瘤组织检测ros1基因融合变异的方法，所述方法包括以下步骤：步骤1：从肿瘤组织获得rna样本；步骤2：分别在ros1基因mrna断裂位置3’端之后和5’端之前的至少二个相邻外显子区域以及参照基因mrna中分别筛选待测靶标区域；步骤3：对步骤2中筛选的靶标区域分别设计相应的引物对和探针，其中ros1基因3’端和5’端上游引物和下游引物分别位于待扩增测靶标区域的两端，所述上游引物、下游引物和/或探针的部分序列跨所述二个相邻外显子拼接区域，使上下游引物之间的待扩增测靶标区域至少包括一个所述二个相邻外显子拼接区域；所述ros1基因的探针(包括3’端和5’端)和所述参照基因的探针分别用不同的荧光基团进行标记；步骤4：对步骤2中所述筛选的待测靶标区域进行微滴式数字pcr扩增；和步骤5：根据所述ros1基因3’端和5’端分别与所述参照基因的不同荧光染料标记的阳性pcr产物拷贝数的比例以及ros1基因3’端占参照基因拷贝数的比例和ros1基因5’端占参照基因拷贝数的比例的差异来判断肿瘤组织是否存在ros1基因融合变异。
在一种实施方式中，所述步骤2中的待测靶标区域不含有snp位点、无重复序列和gc含量为40-60％。
在一种实施方式中，所述引物对和探针的长度范围为10-31bp，优选地为13-25bp，使引物tm为40-70℃，探针tm达到60-75℃。这样可以进行有效pcr扩增。
在一种实施方式中，步骤3中设计ros1基因3’端mrna的引物对和探针时，其中ros1基因3’端上游引物位于ros1基因外显子39，下游引物位于ros1基因外显子40，所述探针位于ros1基因外显子39-40拼接区域。
在一种实施方式中，所述ros1基因3’端上游引物为seqidno：1：gtctacttggaacggatgcattt；所述ros1基因3’端下游引物为seqidno：2：cacggaaacaaggcaatttctag；和所述ros1基因3’端探针为seqidno：3：ttcacagggatctggca。
在一种实施方式中，步骤3中设计ros1基因5’端mrna的引物对和探针时，其中ros1基因5’端上游引物位于ros1基因外显子20，下游引物位于ros1基因外显子20-21拼接区域，所述探针位于ros1基因外显子20。
在一种实施方式中，所述ros1基因5’端上游引物为seqidno：4：aagggccccaaaacatctct；所述ros1基因5’端下游引物为seqidno：5：tctctggtgctgatggaactgt；和所述ros1基因5’端探针为seqidno：6：tcacttcgagcacctga。
在一种实施方式中，步骤3中设计参照基因mrna的引物对和探针时，其中参照基因上游引物和下游引物分别位于待扩增测靶标区域的两端，所述上游引物、下游引物和/或探针的部分序列跨所述二个相邻外显子拼接区域，使上下游引物之间的待扩增测靶标区域至少包括一个所述二个相邻外显子拼接区域。
在一种实施方式中，所述参照基因是人管家基因，优选地为gapdh、β-action或abl1基因。
在一种实施方式中，所述参照基因是abl1基因，扩增其的待测靶标区域上游引物包括其外显子2和3的拼接区域，下游引物位于其外显子3区域，和探针位于外显子3区域。
在一种实施方式中，所述上游引物是seqidno：7：tggagataacactctaagcataactaaaggt；所述下游引物是seqidno：8：gcttcacaccattccccattgt；和所述探针是seqidno：9：aagctccgggtcttag。
在一种实施方式中，本发明提供一种从肿瘤组织检测ros1基因融合变异的试剂盒，所述试剂盒包括上述方法中所使用的引物对和探针。
在本发明中，ros1基因3’端和5’端的上游引物和下游引物分别位于待扩增靶标区域的两端，所述ros1基因3’端待扩增靶标区域为ros1基因断裂位置(通常在32-36外显子处)的3’端后面的rna区域，所述ros1基因5’端待扩增靶标区域为ros1基因断裂位置(通常在32-36外显子处)的5’端前面的rna区域。在正常情况下，ros1基因的3’端rna在肺组织中含量比5’端低，但当其3’端(即酪氨酸激酶区)发生断裂(通常在32-36外显子处)后，可与多种伴侣发生融合，这些伴侣基因的强启动子使ros1基因的3’端实现了过表达。靶向药物ros1抑制剂对ros1融合基因有良好疗效，通过检测ros1基因断裂位点前后的外显子的表达量，将其与内对照基因的表达量做比较实现归一化，进一步判断ros1基因3’端和5’端的表达差异情况则可以判断ros1基因是否发生融合。即：当ros1基因发生融合时，则断裂点3’端之后的外显子(包括酪氨酸激酶区)发生过表达；而ros1基因未发生融合时，则断裂点3’端之后的外显子(包括酪氨酸激酶区)表达量低于断裂点5’端之前的外显子表达量。以对照基因的表达量作为归一化的标准，并进一步判断3’端和5’端表达差异，可以判断ros1基因是否发生融合。所述上游引物、下游引物和/或探针的部分序列跨所述二个相邻外显子拼接区域，使上下游引物之间的待扩增测靶标区域至少包括一个所述二个相邻外显子拼接区域；这样将更特异性检测rna分子，因为在dna分子中，上述上下游引物之间的待扩增测靶标区域至少包括一个所述二个相邻外显子拼接区域的设计方案，将使扩增产物至少包括一个内含子区域(即两个相邻外显子之间就是内含子区域，在rna转录时该内含子被剪切掉)，这样由于内含子一般都较长(大于1kb)，因此，其扩增产物很难被扩增出来，这样就可以排除dna对检测干扰，提高检测的特异性。
本发明的方法可以简便快速检测ros1基因酪氨酸激酶区的过表达，无论是由哪种伴侣融合造成的ros1融合，均可以进行准确检测，为靶向药物ros1抑制剂的临床治疗应用提供指导。
具体实施方式
为了使本领域技术领域人员更好地理解本申请中的技术方案，下面将结合下面结合实施例对本发明作进一步说明，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都应当属于本申请保护的范围。下面结合实施例对本发明作进一步描述。
实施例1肿瘤组织rna提取
将肿瘤组织石蜡样本切成5-10μm厚的切片，取2-8张迅速置于1.5mlrnase-free的离心管中，加入1ml二甲苯，振荡，离心，弃上清，然后加入1ml无水乙醇，同样离心后去上清，沉淀用组织rna提取试剂盒(天根)按说明书操作进行rna提取，最终得到的rna洗脱液保存于-80℃，备用。
实施例2引物探针的设计、合成
引物探针序列如下表。其中待检测基因(ros1基因)的扩增区域(扩增子)在ros1基因mrna断裂位点(32-36外显子区)之后的3’端区域和断裂位点(32-36外显子区)之前的5’端区域，这两个扩增区域至少包括二个外显子区域。内对照基因(本例中为abl1基因)的扩增区域至少包括二个外显子拼接区域。如表1中所示，ros13’端上下游引物均位于其断裂位点(32-36外显子区)之后，其中上游引物在外显子39上，下游引物在外显子40上，探针位于外显子39-40拼接区域上，扩增子包括外显子39-40的拼接区域；ros15’端上下游引物均位于其断裂位点(32-36外显子区)之前，其中上游引物位于ros1基因外显子20，下游引物位于ros1基因外显子20-21拼接区域，所述探针位于ros1基因外显子20，扩增子包括外显子20-21拼接区域。对照基因abl1的上游引物在外显子2-3上，下游引物在外显子3上，探针在外显子3上，扩增子包括外显子2-3两个外显子拼接区域。
表1引物探针序列
实施例3数字pcr检测ros1融合基因型
1.数字pcr检测ros1融合基因型过程
用于检测的微液滴数字pcr反应条件如下：分别配制ros13’端5’端反转录ddpcr(rt-ddpcr)扩增体系，所用引物探针序列见表1。
ros13’端rt-ddpcr扩增反应混合物包括：1×逆转录酶mix(新羿制造)、1×mastermix预混液(新羿制造)、1×稳定剂(新羿制造)、引物为200-1000nm(ros1-3’端-f，ros1-3’端-r，abl1-f，abl1-r、检测探针各100-800nm(ros1-3’端-pb，abl1-pb)、模板rna1-100ng，补水到30ul。
ros15’端rt-ddpcr扩增反应混合物包括：1×逆转录酶mix(新羿制造)、1×mastermix预混液(新羿制造)、1×稳定剂(新羿制造)、引物为200-1000nm(ros1-5’端-f，ros1-5’端-r，abl1-f，abl1-r、检测探针各100-800nm(ros1-5’端-pb，abl1-pb)、模板rna1-100ng，补水到30ul。
将试剂混匀。用样本制备仪(新羿制造科技(北京)有限公司)根据说明书进行微液滴制备。然后将含有微液滴的8联排管放到pcr仪上进行扩增，扩增条件设定如下表2。
表2扩增步骤
pcr扩增后，用芯片阅读仪(新羿制造科技(北京)有限公司)参照仪器使用说明书进行液滴检测和数据分析。通过ros13’端和5’端fam通道和内参基因vic通道拷贝数比值分别进行归一化，进一步比较ros13’端和5’端之间的比值r3/r5来检测ros1融合基因型。
2.结果分析
表3是确定为ros1阴性的临床样本的检测结果，通过这些样本计算3’端r3(ros13’端拷贝数/abl1拷贝数)与5’端r5(ros15’端拷贝数/abl1拷贝数)之间的比值r3/r5的平均值和标准方差，用于计算统计值z值的标准量。本例中3’端r3(ros13’拷贝数/abl1拷贝数)与5’端r5(ros15’拷贝数/abl1拷贝数)之间的比值r3/r5平均值μ是0.59，标准差s为0.246。在实际检测应用中，可以通过不断扩大临床样本的检测量，可进一步修正比值r3/r5的标准量，从而达到更加精确检测未知样本的目的。在对未知样本进行检测时，通过测定3’端fam/vic和5’端fam/vic之间的比值r3/r5是否偏离标准量，即可以推断出待测样本是否为ros1基因融合阳性。设定3倍的
表4为ros1基因融合阳性细胞系3’端fam/vic和5’端fam/vic之间比值大于0.89。
表3ros1阴性的临床样本
表4ros1阳性细胞系hcc78
应该理解到披露的本发明不仅仅限于描述的特定的方法、方案和物质，因为这些均可变化。还应理解这里所用的术语仅仅是为了描述特定的实施方式方案的目的，而不是意欲限制本发明的范围，本发明的范围仅受限于所附的权利要求。
本领域的技术人员还将认识到，或者能够确认使用不超过常规实验，在本文中所述的本发明的具体的实施方案的许多等价物。这些等价物也包含在所附的权利要求中。
序列表
<110>新羿制造科技（北京）有限公司
<120>从肿瘤组织检测ros1基因融合变异的方法及其试剂盒
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