无血清的脐带间充质干细胞培养基的制作方法

本发明涉及干细胞的研究领域，特别是涉及一种新型、高效的适用于脐带间充质干细胞大规模培养的无血清培养基。

背景技术：

脐带间充质干细胞是指存在于新生儿脐带组织中的一种多能干细胞，细胞表面强表达特异性标记cd90，cd73，cd105，不表达造血系或内皮系细胞的标记cd45、cd14、cd11、cd34、cd19，低表达或不表达主要组织相容性抗原hla-dr。研究显示，脐带间充质干细胞具有较高的分化潜能，可向多个方向进行分化如骨、软骨、肌肉、肌腱、韧带、神经、肝内皮和心肌等。与骨髓间充质干细胞相比，脐带间充质干细胞含量和增殖能力均优于后者，且免疫原性低、取材方便、无伦理学争议等优点，因此在间充质干细胞中具有更高的临床应用价值。

在实际临床应用中，无外源性污染和细胞数量是保证脐带间充质干细胞治疗的必要因素。目前，脐带间充质干细胞的培养体系大都含有动物血清(如胎牛血清)，一方面由于血清中不明蛋白的存在，对细胞的信号转导和细胞表面标志形成干扰，另一方面采用添加血清培养的干细胞进行体内移植，可能引起病原体的交叉感染，因此需要开发化学成分明确的无血清培养基。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种用于培养脐带间充质干细胞的培养基。解决现有培养基培养脐带间充质干细胞存在的增殖缓慢，细胞形态和生物学性状等易发生改变，无法满足干细胞的临床应用需求的问题。

本发明的一个目的在于提供一种无血清的脐带间充质干细胞培养基，包括dmem/f12、1～20ng/ml重组人成纤维细胞生长因子、1～20μg/ml重组人表皮生长因子、1～20μg/ml胰岛素、1～10mml-谷氨酰胺、50～200μm2-巯基乙醇、20～50nm亚硒酸钠、10～30μg/ml转铁蛋白、10～100mg/ml人血清白蛋白、50～200μg/ml纤粘连蛋白、50～200ug/ml黄芪多糖aps、10～50mg/lil-3、10～50mg/lil-6、45～55μg/lil-r、10～50mg/l人参提取物、10～50mg/l玫瑰提取物、10～50mg/l茉莉花提取物、5～8mm维生素c。

优选地，培养基中含有5～15ng/ml重组人成纤维细胞生长因子、5～15μg/ml重组人表皮生长因子、5～18μg/ml胰岛素、5～8mml-谷氨酰胺、80～150μm2-巯基乙醇、25～40nm亚硒酸钠、15～25μg/ml转铁蛋白、30～80mg/ml人血清白蛋白、80～150μg/ml纤粘连蛋白、80～150ug/ml黄芪多糖aps。

优选地，培养基中含有10ng/ml重组人成纤维细胞生长因子、10μg/ml重组人表皮生长因子、10μg/ml胰岛素、5mml-谷氨酰胺、100μm2-巯基乙醇、30nm亚硒酸钠、25μg/ml转铁蛋白、50mg/ml人血清白蛋白、100μg/ml纤粘连蛋白、100ug/ml黄芪多糖aps、30mg/lil-3、30mg/lil-6、50μg/lil-r、30mg/l人参提取物、30mg/l玫瑰提取物、30mg/l茉莉花提取物、5mm维生素c。

本发明另一目的是提供了一种脐带间充质细胞的传代培养及扩增的方法，具体步骤如下：

a.把保存在冻存管中的脐带间充质干细胞从液氮中取出，立即投入37℃水浴锅中，轻微摇动2min溶解，同时预热上述无血清的脐带间充质干细胞培养基；

b.把经37℃解冻后的脐带间充质干细胞吸到装有8ml上述无血清的脐带间充质干细胞培养基的15ml离心管中，再用1ml上述无血清的脐带间充质干细胞培养基漂洗1次冻存管，尽量减少细胞数量损失，漂洗液一起加到离心管中，轻轻吹匀，避免产生气泡，然后800g离心5分钟；

c.弃上清液，分别加2ml预热的上述无血清的脐带间充质干细胞培养基，轻轻吹匀，保证细胞完全悬浮起来；将重悬的细胞接种到t25的培养瓶中，再加入3-4ml上述无血清的脐带间充质干细胞培养基，再把细胞摇均匀，保证所有的细胞能够均匀的分布；

d.将复苏的细胞放入37℃、5％c02培养箱中培养；

e.细胞贴壁后换上述无血清的脐带间充质干细胞培养基，去除死细胞；培养瓶中的细胞覆盖率达到80％～90％时按8000个/平方厘米的细胞浓度传代至细胞培养板中，细胞培养板使用的生长培养基为上述无血清的脐带间充质干细胞培养基。

本发明技术方案实现的有益效果：本发明提供了一种无血清的脐带间充质干细胞培养基，用于培养脐带间充质干细胞，由无血清基本培养基和添加成分组成；添加成分为重组人成纤维细胞生长因子hfgf、重组人表皮生长因子hegf、胰岛素hi、l-谷氨酰胺、2-巯基乙醇、亚硒酸钠、转铁蛋白、人血清白蛋白、纤粘连蛋白、黄芪多糖aps、il-3、il-6、il-r、人参提取物、玫瑰提取物、茉莉花提取物、维生素c。在此无血清培养环境中，细胞生长增殖速率更高，且保持其干细胞特性，更有利于干细胞被安全地应用于临床移植。

附图说明

图1本发明培养基培养的间充质干细胞；

图2常规有血清培养基；

图3市售无血清培养基(lonza)。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步的解释说明，但具体实施例并不对本发明作任何限定。除非特别说明，实施例中所涉及的试剂、方法均为本领域常用的试剂和方法。

实施例1.培养基的制备

无血清基本培养基为dmem/f12培养基；

添加成分配方为1ng/ml重组人成纤维细胞生长因子、1μg/ml重组人表皮生长因子、1μg/ml胰岛素、1mml-谷氨酰胺、50μm2-巯基乙醇、20nm亚硒酸钠、10μg/ml转铁蛋白、10mg/ml人血清白蛋白、50μg/ml纤粘连蛋白、50ug/ml黄芪多糖aps、10mg/lil-3、10mg/lil-6、45μg/lil-r、10mg/l人参提取物、10mg/l玫瑰提取物、10mg/l茉莉花提取物、5mm维生素c；

培养基制备方法为：按照规定量将添加成分配成母液，0.45um滤膜过滤，加入无血清基本培养基，混合均匀调成终浓度。

实施例2.培养基的制备

无血清基本培养基为dmem/f12培养基；

添加成分配方为20ng/ml重组人成纤维细胞生长因子、20μg/ml重组人表皮生长因子、20μg/ml胰岛素、10mml-谷氨酰胺、200μm2-巯基乙醇、50nm亚硒酸钠、30μg/ml转铁蛋白、100mg/ml人血清白蛋白、200μg/ml纤粘连蛋白、200ug/ml黄芪多糖aps、50mg/lil-3、50mg/lil-6、55μg/lil-r、50mg/l人参提取物、50mg/l玫瑰提取物、50mg/l茉莉花提取物、8mm维生素c；

培养基制备方法为：按照规定量将添加成分配成母液，0.45um滤膜过滤，加入无血清基本培养基，混合均匀调成终浓度。

实施例3.培养基的制备

无血清基本培养基为dmem/f12培养基；

添加成分配方为5ng/ml重组人成纤维细胞生长因子、5μg/ml重组人表皮生长因子、5μg/ml胰岛素、5mml-谷氨酰胺、80μm2-巯基乙醇、25nm亚硒酸钠、15μg/ml转铁蛋白、30mg/ml人血清白蛋白、80μg/ml纤粘连蛋白、80ug/ml黄芪多糖aps、50mg/lil-3、50mg/lil-6、55μg/lil-r、50mg/l人参提取物、50mg/l玫瑰提取物、50mg/l茉莉花提取物、8mm维生素c；

培养基制备方法为：按照规定量将添加成分配成母液，0.45um滤膜过滤，加入无血清基本培养基，混合均匀调成终浓度。

实施例4.培养基的制备

无血清基本培养基为dmem/f12培养基；

添加成分配方为15ng/ml重组人成纤维细胞生长因子、15μg/ml重组人表皮生长因子、18μg/ml胰岛素、8mml-谷氨酰胺、150μm2-巯基乙醇、40nm亚硒酸钠、25μg/ml转铁蛋白、80mg/ml人血清白蛋白、150μg/ml纤粘连蛋白、150ug/ml黄芪多糖aps、50mg/lil-3、50mg/lil-6、55μg/lil-r、50mg/l人参提取物、50mg/l玫瑰提取物、50mg/l茉莉花提取物、8mm维生素c；

培养基制备方法为：按照规定量将添加成分配成母液，0.45um滤膜过滤，加入无血清基本培养基，混合均匀调成终浓度。

实施例5.培养基的制备

无血清基本培养基为dmem/f12培养基；

添加成分配方为10ng/ml重组人成纤维细胞生长因子、10μg/ml重组人表皮生长因子、10μg/ml胰岛素、5mml-谷氨酰胺、100μm2-巯基乙醇、30nm亚硒酸钠、25μg/ml转铁蛋白、50mg/ml人血清白蛋白、100μg/ml纤粘连蛋白、100ug/ml黄芪多糖aps、30mg/lil-3、30mg/lil-6、50μg/lil-r、30mg/l人参提取物、30mg/l玫瑰提取物、30mg/l茉莉花提取物、5mm维生素c；

培养基制备方法为：按照规定量将添加成分配成母液，0.45um滤膜过滤，加入无血清基本培养基，混合均匀调成终浓度。

根据需要，本发明所提供的用于培养脐带间充质干细胞的培养基可以由以液体形式存在的所述无血清基本培养基和以固体形式存在的所述添加成分构成，也可以是向以液体形式存在的所述无血清基本培养基中添加了所述添加成分后形成的液体培养基。

实施例6.传代培养及扩增的方法，具体步骤如下：

a.把保存在冻存管中的脐带间充质干细胞从液氮中取出，立即投入37℃水浴锅中，轻微摇动2min溶解，同时预热上述无血清的脐带间充质干细胞培养基；

b.把经37℃解冻后的脐带间充质干细胞吸到装有8ml上述无血清的脐带间充质干细胞培养基的15ml离心管中，再用1ml上述无血清的脐带间充质干细胞培养基漂洗1次冻存管，尽量减少细胞数量损失，漂洗液一起加到离心管中，轻轻吹匀，避免产生气泡，然后800g离心5分钟；

c.弃上清液，分别加2ml预热的上述无血清的脐带间充质干细胞培养基，轻轻吹匀，保证细胞完全悬浮起来；将重悬的细胞接种到t25的培养瓶中，再加入3-4ml上述无血清的脐带间充质干细胞培养基，再把细胞摇均匀，保证所有的细胞能够均匀的分布；

d.将复苏的细胞放入37℃、5％co2培养箱中培养；

e.细胞贴壁后换上述无血清的脐带间充质干细胞培养基，去除死细胞；培养瓶中的细胞覆盖率达到80％～90％时按8000个/平方厘米的细胞浓度传代至细胞培养板中，细胞培养板使用的生长培养基为上述无血清的脐带间充质干细胞培养基。

实施例7.细胞增殖能力测试

实验方法：用ce11countingkit(cck-8)试剂盒比较本发明上述培养基与市售无血清及常规有血清培养基培养后的细胞增殖能力；

1)在96孔板中接种细胞悬液(100ul/孔)，向培养板中加入不同配方培养基，放在培养箱中预培养24h(37℃，5％c02)；

2)每孔加入10ulcck-8溶液；

3)将培养板放在培养箱内孵育3小时；

用酶标仪测定代450nm处的吸光度。

实验结果：

(一)吸光度分析结论：吸光度值高于对照组，吸光度值越高，细胞浓度越大，说明使用本发明中的无血清完全培养基培养细胞，能够使细胞具备较强的增殖能力。(见表1)

表1吸光值结果

(二)相差显微镜结果分析：如图1-3对比可见，本发明培养基培养的细胞形态较好，细胞贴壁性能较好，贴壁抑制现象不明显，对细胞培养瓶适应性好。

本领域技术人员应该理解的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，但本领域的技术人员可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明权利要求书的范围。