1.一种mirna,具有如下序列,cgtaaagacctctgatgagagtg。
2.一种mirna,具有如下序列,gaggcattgagggagaagt。
3.如权利要求1和2所述两种mirna在制备用于治疗血管重塑性疾病的药物组合中的用途。
4.如权利要求1和2所述两种mirna在制备用于治疗血管平滑肌细胞增殖性疾病的药物组合中的用途。
5.一种制备如权利要求1所述mirna的方法,含有如下步骤:
①植物总rna的提取
1)将丹参的干燥根和根茎组织进行液氮研磨,保证无块状组织,取100mg粉末置于2ml无菌离心管中,添加500μlbufferrcl/β-巯基乙醇,(样品解冻之前加入β-巯基乙醇),快速混匀;
2)55℃水浴1-3min,室温,14,000g离心5min;
3)吸取上清液(大概可获得450μl),加入至含有2ml收集管的gdnafiltercolum中,室温14,000g离心2min;
4)加入等倍体积的bufferrcb于收集管中,并上下颠倒混匀5-10次;
5)将从(4)中得到的全部混合液包括沉淀置于hibindrnaminicolum,加入一个新的2ml收集管,室温10,000离心1min,除去流动相,并把柱子放回收集管中;
6)加入400μlrwcwashbuffer置于柱子中,室温10,000g离心1min除去流动相,柱子放回收集管中;此时,可选择用dnaaseⅰ处理;
7)把柱子放在一个新的2ml收集管中,加入500μlrnawashbufferⅱ,室温10,000g离心1min,除去流动相,并把柱子放回收集管中;
8)重复(7),把柱子放回收集管中,10,000g离心2min,离心干燥;
9)将离心柱置于新的1.5ml离心管中,在离心柱中加入30-50μldepc水,室温静置2min后,全速(≥13,000g)离心1min,将流出液收集,-80℃保存;
②丹参rna建库测序流程
②.1totalrna样品检测
对rna样品的检测主要包括4种方法:
(1)琼脂糖凝胶电泳分析rna降解程度以及是否有污染;
(2)nanodrop检测rna的纯度(od260/280比值);
(3)qubit对rna浓度进行精确定量;
(4)agilent2100精确检测rna的完整性;
②.2文库构建
样品检测合格后,使用smallrnasampleprekit构建文库,利用smallrna的3’及5’端特殊结构(5’端有完整的磷酸基团,3’端有羟基),以totalrna为起始样品,直接将smallrna两端加上接头,然后反转录合成cdna;随后经过pcr扩增,page胶电泳分离目标dna片段,切胶回收得到的即为cdna文库;
②.3库检
文库构建完成后,先使用qubit2.0进行初步定量,稀释文库至1ng/μl,随后使用agilent2100对文库的insertsize进行检测,insertsize符合预期后,使用q-pcr方法对文库的有效浓度进行准确定量(文库有效浓度>2nm),以保证文库质量;
②.4上机测序
库检合格后,把不同文库按照有效浓度及目标下机数据量的需求pooling后进行hiseq/miseq测序获取丹参中存在的植物源性的mirna;
③植物mirna的提取
1)将丹参的干燥根和根茎组织进行液氮研磨,保证无块状组织,取50-100mg粉末置于2ml无菌离心管中,添加700μllysismixture,最高速度涡旋30s,充分混匀样品;
2)55℃水浴3min,室温,12,000g离心5min;
3)吸取上清液,加入至含有2ml收集管的gdnaremovelcolum中,室温12,000g离心2min;
4)将收集管液体转移至新的2ml离心管中,加入1.1倍体积的无水乙醇涡旋20s,充分混匀;12,000g离心1min,弃掉流动相;
5)将从(4)中得到的700μl混合液置于microeluternaminicolum,加入一个新的2ml收集管,室温12,000离心1min,除去流动相,并把柱子放回收集管中;
6)重复(5)直至所有液体均被转移;
7)加入500μl无水乙醇至microeluternaminicolum,室温12,000g离心1min,除去流动相;
8)加入500μlxdbindingbuffer到microeluternaminicolum,室温12,000g离心1min,除去流动相;
9)加入750μlrnawashbufferⅱ,室温10,000g离心1min,除去流动相,并把柱子放回收集管中;重复一次;
10)最大转速离心(≥12,000g)2min,离心干燥
11)将离心柱置于新的1.5ml离心管中,在离心柱中加入30-50μldepc水,室温静置5min后,全速(≥12,000g)离心1min,将流出液收集,-80℃保存;
④高碘酸钠消化处理rna
(1)将提取的rna取5μl加入95μl10mmnaio3在0℃避光孵育40min;
(2)加入1ml无水乙醇及1μl糖原在冰上静置20min;
(3)12,000g,15min,4℃离心后弃上清;
(4)加入1ml无水乙醇12,000g,15min,4℃离心弃上清;
(5)加入1ml75%乙醇12,000g,15min,4℃离心弃上清;
(6)室温静置5min,用ddh2o溶解后进行定量;
⑤mirna的逆转录
⑤.1连接反应体系:
将上述反应体系在pcr仪中按照如下条件进行反转录反应:
⑤.2反转录反应体系:
4μl连接产物加入反转录体系中(加入前在室温平衡2min)
⑥mirna的半定量检测
pcr反应体系:
20μl的cdna加入200μlrnase-freeh2o
⑦mirna的测序
将扩增的pcr产物进行测序确定为sal-mir-1和sal-mir-3的序列一致;
sal-mir-1序列信息:
precursor:
cucucaucuggggucuuuguuuagauaaguugguugaaguuaaaaaauuuauuuaaaaaugagguugcuuuagaaauuguguggcuuaaugaaucaugauauuuuauucuuguuauuaucuuugaauguuuucauuuaaugaaauaauauuuugaaugauucauuaggcucacacaguuucccaagcaacaauauuugaaacgauuuuugcuucaacaaacuuauaaauuuauauaaagaccucugaugagagug
mature:uaaagaccucugaugagagug
sal-mir-3序列信息:
precursor:uucucccucaagggcuucuggcccuuugcaugcuuaguuucuucgagaaaugguaucuaaaagaaugguagugaugaaacauggcuaggaggcauugagggagaagu
mature:ggaggcauugagggagaagu。
6.一种药物组合物,其特征在于含有如权利要求1和2所述的mirna和药学上可接受的辅料。
7.如权利要求6所述的组合物,其特征在于所述组合物选自片剂、胶囊剂、颗粒剂、散剂或注射剂。