Sal-miR-1和Sal-miR-3及其在制备药物中的用途的制作方法

文档序号:19287495发布日期:2019-11-30 00:23阅读:来源:国知局

技术特征:

1.一种mirna,具有如下序列,cgtaaagacctctgatgagagtg。

2.一种mirna,具有如下序列,gaggcattgagggagaagt。

3.如权利要求1和2所述两种mirna在制备用于治疗血管重塑性疾病的药物组合中的用途。

4.如权利要求1和2所述两种mirna在制备用于治疗血管平滑肌细胞增殖性疾病的药物组合中的用途。

5.一种制备如权利要求1所述mirna的方法,含有如下步骤:

①植物总rna的提取

1)将丹参的干燥根和根茎组织进行液氮研磨,保证无块状组织,取100mg粉末置于2ml无菌离心管中,添加500μlbufferrcl/β-巯基乙醇,(样品解冻之前加入β-巯基乙醇),快速混匀;

2)55℃水浴1-3min,室温,14,000g离心5min;

3)吸取上清液(大概可获得450μl),加入至含有2ml收集管的gdnafiltercolum中,室温14,000g离心2min;

4)加入等倍体积的bufferrcb于收集管中,并上下颠倒混匀5-10次;

5)将从(4)中得到的全部混合液包括沉淀置于hibindrnaminicolum,加入一个新的2ml收集管,室温10,000离心1min,除去流动相,并把柱子放回收集管中;

6)加入400μlrwcwashbuffer置于柱子中,室温10,000g离心1min除去流动相,柱子放回收集管中;此时,可选择用dnaaseⅰ处理;

7)把柱子放在一个新的2ml收集管中,加入500μlrnawashbufferⅱ,室温10,000g离心1min,除去流动相,并把柱子放回收集管中;

8)重复(7),把柱子放回收集管中,10,000g离心2min,离心干燥;

9)将离心柱置于新的1.5ml离心管中,在离心柱中加入30-50μldepc水,室温静置2min后,全速(≥13,000g)离心1min,将流出液收集,-80℃保存;

②丹参rna建库测序流程

②.1totalrna样品检测

对rna样品的检测主要包括4种方法:

(1)琼脂糖凝胶电泳分析rna降解程度以及是否有污染;

(2)nanodrop检测rna的纯度(od260/280比值);

(3)qubit对rna浓度进行精确定量;

(4)agilent2100精确检测rna的完整性;

②.2文库构建

样品检测合格后,使用smallrnasampleprekit构建文库,利用smallrna的3’及5’端特殊结构(5’端有完整的磷酸基团,3’端有羟基),以totalrna为起始样品,直接将smallrna两端加上接头,然后反转录合成cdna;随后经过pcr扩增,page胶电泳分离目标dna片段,切胶回收得到的即为cdna文库;

②.3库检

文库构建完成后,先使用qubit2.0进行初步定量,稀释文库至1ng/μl,随后使用agilent2100对文库的insertsize进行检测,insertsize符合预期后,使用q-pcr方法对文库的有效浓度进行准确定量(文库有效浓度>2nm),以保证文库质量;

②.4上机测序

库检合格后,把不同文库按照有效浓度及目标下机数据量的需求pooling后进行hiseq/miseq测序获取丹参中存在的植物源性的mirna;

③植物mirna的提取

1)将丹参的干燥根和根茎组织进行液氮研磨,保证无块状组织,取50-100mg粉末置于2ml无菌离心管中,添加700μllysismixture,最高速度涡旋30s,充分混匀样品;

2)55℃水浴3min,室温,12,000g离心5min;

3)吸取上清液,加入至含有2ml收集管的gdnaremovelcolum中,室温12,000g离心2min;

4)将收集管液体转移至新的2ml离心管中,加入1.1倍体积的无水乙醇涡旋20s,充分混匀;12,000g离心1min,弃掉流动相;

5)将从(4)中得到的700μl混合液置于microeluternaminicolum,加入一个新的2ml收集管,室温12,000离心1min,除去流动相,并把柱子放回收集管中;

6)重复(5)直至所有液体均被转移;

7)加入500μl无水乙醇至microeluternaminicolum,室温12,000g离心1min,除去流动相;

8)加入500μlxdbindingbuffer到microeluternaminicolum,室温12,000g离心1min,除去流动相;

9)加入750μlrnawashbufferⅱ,室温10,000g离心1min,除去流动相,并把柱子放回收集管中;重复一次;

10)最大转速离心(≥12,000g)2min,离心干燥

11)将离心柱置于新的1.5ml离心管中,在离心柱中加入30-50μldepc水,室温静置5min后,全速(≥12,000g)离心1min,将流出液收集,-80℃保存;

④高碘酸钠消化处理rna

(1)将提取的rna取5μl加入95μl10mmnaio3在0℃避光孵育40min;

(2)加入1ml无水乙醇及1μl糖原在冰上静置20min;

(3)12,000g,15min,4℃离心后弃上清;

(4)加入1ml无水乙醇12,000g,15min,4℃离心弃上清;

(5)加入1ml75%乙醇12,000g,15min,4℃离心弃上清;

(6)室温静置5min,用ddh2o溶解后进行定量;

⑤mirna的逆转录

⑤.1连接反应体系:

将上述反应体系在pcr仪中按照如下条件进行反转录反应:

⑤.2反转录反应体系:

4μl连接产物加入反转录体系中(加入前在室温平衡2min)

⑥mirna的半定量检测

pcr反应体系:

20μl的cdna加入200μlrnase-freeh2o

⑦mirna的测序

将扩增的pcr产物进行测序确定为sal-mir-1和sal-mir-3的序列一致;

sal-mir-1序列信息:

precursor:

cucucaucuggggucuuuguuuagauaaguugguugaaguuaaaaaauuuauuuaaaaaugagguugcuuuagaaauuguguggcuuaaugaaucaugauauuuuauucuuguuauuaucuuugaauguuuucauuuaaugaaauaauauuuugaaugauucauuaggcucacacaguuucccaagcaacaauauuugaaacgauuuuugcuucaacaaacuuauaaauuuauauaaagaccucugaugagagug

mature:uaaagaccucugaugagagug

sal-mir-3序列信息:

precursor:uucucccucaagggcuucuggcccuuugcaugcuuaguuucuucgagaaaugguaucuaaaagaaugguagugaugaaacauggcuaggaggcauugagggagaagu

mature:ggaggcauugagggagaagu。

6.一种药物组合物,其特征在于含有如权利要求1和2所述的mirna和药学上可接受的辅料。

7.如权利要求6所述的组合物,其特征在于所述组合物选自片剂、胶囊剂、颗粒剂、散剂或注射剂。


技术总结
本发明属于医药技术领域,具体涉及两种小分子活性成分及其在制备药物组合中的应用,更具体的涉及丹参来源的两种miRNA:Sal‑miR‑1和Sal‑miR‑3,其在制备用于治疗血管重塑性疾病药物中的应用,本发明还提供所述miRNA的制备方法,以及含有上述miRNA的组合物,所述组合物选自片剂、胶囊剂或注射剂。为验证Sal‑miR‑1和Sal‑miR‑3的作用,本发明在小鼠体内颈动脉结扎模型中应用制备的Sal‑miR‑1和Sal‑miR‑3进行联合治疗,还在体外培养的血管平滑肌细胞中给予Sal‑miR‑1和Sal‑miR‑3联合治疗进行分子机制研究。为临床治疗血管重塑提供一种高效、低毒的新型药物奠定基础,为研发治疗血管重塑提供体内药效学及作用机制及理论实验依据,为科技成果转化创造条件。

技术研发人员:杨高山;温进坤;郑斌;张新华;秦岩
受保护的技术使用者:河北医科大学
技术研发日:2019.06.11
技术公布日:2019.11.29
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