一种珠子参糖基转移酶UGTPjm1基因及在制备人参皂苷Ro上的应用的制作方法

本发明属于生物
技术领域：
，具体涉及一种珠子参糖基转移酶ugtpjm1基因及在制备人参皂苷ro上的应用。
背景技术：
：珠子参(panaxjaponicusvar.major)为五加科(araliaceae)人参属(panax)药用植物，以根状茎入药。目前已从珠子参的根状茎中分离鉴定出多种三萜皂苷，其含量以齐墩果酸型皂苷为主。齐墩果酸型皂苷，是植物界中广泛存在的一种五环三萜皂苷，具有多种显著的药理活性，如在抗肿瘤、降血糖、保肝活性等方面比游离的苷元齐墩果酸更为明显。人参皂苷ro属齐墩果酸型皂苷，在珠子参根状茎中含量较高。人参皂苷ro具有抗炎、调节免疫、保护心血管系统、抗病毒、保肝、护胃、抗肥胖、美容等多种药理作用，例如，人参皂苷ro是藤珠胃康颗粒制剂、糖智宁胶囊等中药的重要活性成分。人参皂苷ro主要分布于珠子参、珠节参、姜状三七等人参属植物中，而这些植物对栽培环境要求较为苛刻，生长周期长，且产量低；此外，还具有提取工艺流程较为复杂、分离得率低等不足，使得人参皂苷ro的产量低，导致市场价格高。如何有效获得大量高纯度的人参皂苷ro，满足科学试验及市场应用需求，一直都是大家关注的焦点。技术实现要素：为了解决上述问题，本发明提供了一种珠子参糖基转移酶ugtpjm1基因，可作为人参皂苷ro的生物合成调控基因。本发明的技术方案为：一种珠子参糖基转移酶ugtpjm1基因，所述珠子参糖基转移酶ugtpjm1基因的核苷酸序列为seqidno：1所示。本发明还提供了一种上述的珠子参糖基转移酶ugtpjm1基因的编码蛋白。作为优选，所述编码蛋白的氨基酸序列为seqidno：2所示。本发明还提供了一种含有上述的珠子参糖基转移酶ugtpjm1基因的重组质粒。作为优选，所述重组质粒通过将上述的珠子参糖基转移酶ugtpjm1基因与pet28a载体同源重组获得，命名为pet28a-ugtpjm1。本发明还提供了一种转基因工程菌，含有上所述的重组质粒，或，所述基因工程菌的基因组中整合有外源的上述的珠子参糖基转移酶ugtpjm1基因。作为优选，所述转基因工程菌为大肠杆菌bl21(de3)菌株。本发明还提供了一种上述的珠子参糖基转移酶ugtpjm1基因在制备人参皂苷ro上的应用。本发明还提供了一种人参皂苷ro的制备方法，包括：以竹节参皂苷iva和糖基供体udp-葡萄糖为原料，在由上述的珠子参糖基转移酶ugtpjm1基因编码得到的珠子参糖基转移酶的催化下，在竹节参皂苷iva的c3位上的葡萄糖醛酸基团上再一次糖基化，生成人参皂苷ro。本发明通过异源表达与体外催化的方式来获得目标产物，采用体外生物合成，进行定向生产，具有得率高、副产物少等诸多优点。测序技术的快速发展，极大地推进了三萜皂苷生物合成路径关键酶基因的挖掘，开辟了一种生产稀有人参皂苷的新方法。本发明还提供了一种克隆上述的珠子参糖基转移酶ugtpjm1基因的引物，所述引物的序列为：f：seqidno：3；r：seqidno：4。与现有技术相比，本发明的有益效果体现在：(1)本发明首次克隆并验证了形成人参皂苷ro的珠子参糖基转移酶ugtpjm1基因的功能，人参皂苷ro的生物合成调控基因ugtpjm1，是首次鉴定并成功验证。(2)通过体外合成人参皂苷ro，管理更加方便，可控性强。(3)本发明可以减少对原料种植的需求，节约农业用地。(4)本发明生产产物单一，便于后期人参皂苷ro的分离和纯化。(5)本发明中珠子参糖基转移酶ugtpjm1基因作为人参皂苷ro生物合成的关键基因，可用于珠子参等植物育种研究。(6)本发明还提供了含有该ugtpjm1基因的重组质粒、基因工程菌和重组蛋白，为通过生物工程方法大量合成人参皂苷ro，进一步开展齐墩果酸型皂苷生物合成调控研究奠定基础。附图说明图1为人参皂苷ro生物合成路径示意图(其中虚线圆圈处是指葡萄糖苷所连接位置)。图2为质粒pet28a-ugtpjm1的图谱(用于表达糖基转移酶ugtpjm1)。图3为珠子参糖基转移酶ugtpjm1基因酶促反应的hplc图谱(a为ugtpjm1+竹节参皂苷iva+udp-葡萄糖；b为对照+竹节参皂苷iva+udp-葡萄糖；c为标准品)。图4为酶活性验证反应产物的质谱分析(lc/ms)(其中，a为总离子流图；b为底物竹节参皂苷iva的保留时间；c为反应产物的保留时间)。图5为标准品人参皂苷ro的质谱分析(lc/ms)(其中，a为总离子流图；b为标准品ro的保留时间)。图6为反应产物的碎离子图(lc/ms)。图7为标准品人参皂苷ro的碎离子图(lc/ms)。具体实施方式实施例1ugt候选基因ugtpjm1的挖掘及体外验证以珠子参的膨大根状茎、细长茎为材料，分别取样后送广州基迪奥生物科技有限公司进行转录组测序。首先，根据转录组数据的注释结果，筛选出全部候选的糖基转移酶136个。其次，结合已知功能的糖基转移酶基因，包括马铃薯stsgt、喀西茄sagt4a、大豆ugt73p2、甘草guugat等的特点。然后再结合人参皂苷ro在珠子参根状茎中的含量分布特点，以及基因表达量进行综合分析，初步筛选出12个可能的候选基因。对候选基因经过克隆、同源重组、原核表达、体外酶促反应、高效液相检测及lc/mc鉴定等一系列工作后，最终鉴定出可以与竹节参皂苷iva的c3位上的葡萄糖醛酸基团进行催化反应(图1)，生成稀有人参皂苷ro的目标候选基因ugtpjm1，序列为seqidno：1。通过ugtpjm1催化竹节参皂苷iva的c3位上的葡萄糖醛酸基团生成稀有人参皂苷ro，此过程中所有试剂或仪器未详细标注生产厂家的，均为正常市场购买所能获得。各阶段的具体操作如下：(1)cdna模板的制备以珠子参根状茎为材料，取鲜样，液氮速冻后，进行rna提取。rna提取采用magen(美基生物)的hipureplantrnaminikit试剂盒，按试剂盒的操作步骤提取获得rna，经检测合格后，使用takara反转录试剂盒，根据其说明书，将rna反转录成cdna，-80℃保存备用。(2)目标基因的克隆基于珠子参根状茎的转录组数据，获得候选基因ugtpjm1的核酸序列，同时结合基因ugtpjm1在大肠杆菌pet28a中的插入位置，使用cedesign软件设计带同源壁的引物。所用带同源壁的引物信息如下：f：seqidno：3r：seqidno：4采用高保真kod酶进行ugtpjm1基因克隆，克隆后的基因采用easypurequickgelextractionkit试剂盒进行回收。(3)同源重组采用kod酶对大肠杆菌pet28a进行线性化，基因回收使用easypurequickgelextractionkit试剂盒。同源重组时，采用gibsonassembly(neb)进行组装，将重组表达质粒转化到宿主菌株e.colibl21(de3)感受态细胞。组装完毕后，进行涂板，所用平板为添加了含卡那霉素的lb固体培养基，37℃培养箱内暗培养12-15小时。之后挑选平板上的单菌落，进行菌水pcr扩增、跑胶等，检测为阳性克隆后，送测序公司检测，作进一步最终确认。组装成功后进行保种，得到珠子参糖基转移酶的重组表达菌株(图2)。(4)蛋白表达及纯化取重组表达菌株进行大摇，待od值在0.6-0.8之间时，加入0.1mm的iptg，混匀后在16℃摇床中进行培养，转速为220转/分，诱导12小时；之后在4℃，5000转的条件下，进行离心收菌。采用tris-hcl缓冲液对离心后菌体进行充分重悬，重悬结束后采用细胞破碎仪进行破碎；对破碎菌液在4℃条件下进行高速离心，留上清；采用镍柱(nintabeads)对上清进行纯化，纯化结束后采用millipore超滤管进行浓缩。(5)酶活性验证体外验证的酶促反应体系(表1)，进行糖基转移酶实验表1组分用量(微升)备注phosphatebuffer50ph8.0吐温-202/竹节参皂苷iva810mmudp-glc4100mm纯化蛋白36/总体系100/在35℃温度条件下培养反应12小时，之后用100微升正丁醇终止反应。(6)产物检测对反应后的产物采用正丁醇进行萃取，真空干燥后，再用甲醇溶解，对产物分别进行hplc、lc/ms检测。hplc检测方法如下：液相色谱柱为agilentzorbaxsb-c18柱子(250mm×4.6mm，5.0μm)。流动相为：0.2％磷酸溶液(a)和乙腈(b).梯度洗脱程序如下：0～22min，95％a～35％a；22～24min，35％a～30％a；24～28min30％a。流速1.0ml/min。柱温30℃。进样量10μl。高效液相检测结果见(图3)，在对照组中没有产物的出现，而在添加了糖基转移酶ugtpjm1蛋白的反应产物中，在15.351分钟出现了产物，并与标准品人参皂苷ro的出峰时间基本对应。lc/ms检测方法如下：为了进一步确认所得到的产物为人参皂苷ro，采用agilentq-tof6540液相色谱质谱联用仪(lc/ms)进行检测，检测方法如下：质谱条件：离子源采用的是负离子模式，电压3500v；碎裂电压:175v；锥孔电压:65v；射频电压:750v，扫描范围：50-1700m/z。色谱条件：使用的柱子是agilentzorbaxsb-c18柱子(250mm×4.6mm，5.0μm)，流速1ml/min。流动相是0.1％甲酸(a)和乙腈(b)，梯度是0分钟a：b＝95：5，22分钟是a：b＝35：65，24分钟是a：b＝30：70，28分钟是a：b＝30：70。由检测结果图4～图7，可以看出，产物的出峰时间、及特征碎离子均与标准品人参皂苷ro相吻合，确认反应产物为人参皂苷ro。最终得出糖基转移酶ugtpjm1具有催化竹节参皂苷iva的c3位上的葡萄糖醛酸基团上再一次糖基化的能力，生成稀有人参皂苷ro。序列表<110>云南农业大学<120>一种珠子参糖基转移酶ugtpjm1基因及在制备人参皂苷ro上的应用<160>4<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>1482<212>dna<213>珠子参(rhizomapanacismajoris)<400>1atggcaactgaagatcctaaactccacgttctcatcctaccctacctcaccccaagccac60atgatgccattggtagaaattggtaggctaatcgccgcccgtggcgttaacatcactata120atagccaccccacacaacgctaacctctttcgatcctccgtcgatcaagacatcaattcc180ggccaccagatctccatccacgagctcaagttcccttccgcagaagttggcttgccggaa240ggaattgagaacttgagcgccatcacatcaaccgacatgtccgccaaggtctttgaggga300ataatgcgcctccgaaaacccatggaagatttgatccgcaatctctctccggactgcatc360ttttccgacatgttttatccttggacagttgagcttgccgaggaacttaagattccgagg420ctcatgttttatccatcgagctttttctattactgcctatcgcatagtttgaaactttat480gcgcctcatgatcagaaggtgcagtccaatacagagagtttcttgatccctcatctccca540gacactatagagatgaaaaggagtcaattacaagatcacgttaaggggaaatcaaggctt600ggagtgttcatggatgcaatcaaagattcggagcttaaaacctatggtatagttcatatg660actttctacgaacttgagcctgcttatgcagatcattacataaaaataaagccagcgaaa720ttctggggcattctccctttgtttcagttcttcaagggattaaaagctccgaggtcaaat780gattcgcagcacaactgtctgagttggctggatactcaaaagcccaactctgttgttctt840ttaagttttggaagtctagtgagatttcctgatgctcaactcactgagattgctttagct900ctagaagcttctacccattcattcatttgggtggtgaggaagagtgaggcaagtcgagaa960aaccaagaggaaagttggctgccagccggttttgaagaaagaatgatggaaggtaacaag1020ggtatgatggtcagaggttgggctcctcaggtgaagatcttagctcacccggcaactgga1080gcgtttatgactcactgcggctggaactcagtgctagaagcggttgcagccggtgtgccc1140ctcatcacatggccattatttgcggagcagttctacaatgagaaggctattaatgaggtc1200ctaaagattggagtaggagttggggcggaggtgtggaatccaacgtttgagatcacttgt1260ccgccggtggggagagataagatagagaaggcattatccaaattgatgggtggttcggag1320gaatctcagaagatcagacagaaagcaaaggaaatggcagccatggctgaaggggctgtt1380gcggtaggtgggtcgtcttataataatattacggctctgatcgaagagttgaaagcttgt1440gcttttgagaaatcaaaaaatggatatataatttgtaaataa1482<210>2<211>493<212>prt<213>珠子参(rhizomapanacismajoris)<400>2metalathrgluaspprolysleuhisvalleuileleuprotyrleu151015thrproserhismetmetproleuvalgluileglyargleuileala202530alaargglyvalasnilethrileilealathrprohisasnalaasn354045leupheargserservalaspglnaspileasnserglyhisglnile505560serilehisgluleulyspheproseralagluvalglyleuproglu65707580glyilegluasnleuseralailethrserthraspmetseralalys859095valphegluglyilemetargleuarglysprometgluaspleuile100105110argasnleuserproaspcysilepheseraspmetphetyrprotrp115120125thrvalgluleualaglugluleulysileproargleumetphetyr130135140proserserphephetyrtyrcysleuserhisserleulysleutyr145150155160alaprohisaspglnlysvalglnserasnthrgluserpheleuile165170175prohisleuproaspthrileglumetlysargserglnleuglnasp180185190hisvallysglylysserargleuglyvalphemetaspalailelys195200205aspsergluleulysthrtyrglyilevalhismetthrphetyrglu210215220leugluproalatyralaasphistyrilelysilelysproalalys225230235240phetrpglyileleuproleupheglnphephelysglyleulysala245250255proargserasnaspserglnhisasncysleusertrpleuaspthr260265270glnlysproasnservalvalleuleuserpheglyserleuvalarg275280285pheproaspalaglnleuthrgluilealaleualaleuglualaser290295300thrhisserpheiletrpvalvalarglysserglualaserargglu305310315320asnglngluglusertrpleuproalaglypheglugluargmetmet325330335gluglyasnlysglymetmetvalargglytrpalaproglnvallys340345350ileleualahisproalathrglyalaphemetthrhiscysglytrp355360365asnservalleuglualavalalaalaglyvalproleuilethrtrp370375380proleuphealagluglnphetyrasnglulysalaileasngluval385390395400leulysileglyvalglyvalglyalagluvaltrpasnprothrphe405410415gluilethrcysproprovalglyargasplysileglulysalaleu420425430serlysleumetglyglyserglugluserglnlysileargglnlys435440445alalysglumetalaalametalagluglyalavalalavalglygly450455460sersertyrasnasnilethralaleuileglugluleulysalacys465470475480alapheglulysserlysasnglytyrileilecyslys485490<210>3<211>45<212>dna<213>人工合成序列(unknow)<400>3tggtgccgcgcggcagccatatggcaactgaagatcctaaactcc45<210>4<211>52<212>dna<213>人工合成序列(unknow)<400>4tggtggtggtggtgctcgattatttacaaattatatatccattttttgattt52当前第1页12