靶向LAG-3的抗体和双特异性抗体及其用途的制作方法

本发明涉及生物医药领域，具体涉及一种靶向lag-3的抗体和双特异性抗体及其用途。
背景技术：
：lymphocyte-activationgene3(lag-3，淋巴细胞活化基因-3)属于免疫球蛋白超家族，由胞外区、跨膜区和胞质区3个部分组成。lag-3的基因定位于12号染色体(12p13)，与cd4分子在染色体上的定位和结构相似。lag-3在活化的t细胞、耗竭的t细胞、肿瘤浸润性t细胞和调节性t细胞(treg)上表达。在与主要组织相容性复合物2(mhcii类)结合后，lag-3/mhcii类相互作用导致t细胞增殖、活化以及体内平衡的负调节。抑制lag-3能够解除lag3对mhcii-多肽-t细胞受体抗原递呈的抑制，并让t细胞重新获得细胞毒性，从而增强对肿瘤的杀伤效果。同时抑制lag-3还能够降低调节t细胞抑制免疫反应的功能。因此，lag-3被认为是一个比其它免疫检查点蛋白更吸引人的靶点。lag-3是目前免疫检查点二代靶点中，临床数据较多、成药性相对确定的靶点，针对该靶点的抗体药物将来有可能成为重要的抗肿瘤药物。然而，目前以lag-3为靶点全球尚无药物上市。至2018年年末，临床在研的药物共计30个，处于临床研究阶段的lag-3抗体包括葛兰素史克的gsk2831781、诺华的lag525、再生元的regn3767和tesaro的tsr-033。lag-3抗体药物大多致力于开发与pd-1的联合疗法。其中研发进展最快的是bms和小野公司开发处于ii/iii临床阶段的relatlimab；处于ii期临床imp321和i/ii期临床的lag525；处于i期临床试验阶段有8个药物，处于临床前试验阶段有9个药物，以lag-3为靶点的药物主要治疗领域包括癌症和自身免疫性疾病。百时美施贵宝的relatlimab(研发代码为bms-986016，最初由medarex开发)。macrogenics的mgd013是pd-1/lag-3双特异性抗体，在血清中的半衰期很长，通过同时阻断这两个免疫检查点分子的免疫抑制，它具有治疗多种不同癌症的潜力。然而，目前临床上仍缺乏热稳定性更好、t细胞活性更好并且有效阻断lag-3与mhcii结合，动物药效更好、pk更好的靶向lag-3的抗体，以及结构简单，分子稳定，工艺高效针对lag-3的双特异性抗体。技术实现要素：为了克服本领域缺乏更稳定、活性更好的靶向lag-3的抗体和缺乏结构简单、分子稳定和工艺高效的靶向lag-3的双特异性抗体的缺陷，提供了一种靶向lag-3的抗体和双特异性抗体及用途。本发明的双特异性抗体为序列特异的igg结构类似的双特异性抗体(sequence-basedigglikebispecificantibody,sbody)。本专利将称这种设计为sbody。本发明通过优化设计和筛选，提供一种靶向lag-3的抗体，该抗体具有新的轻链可变区cdr1、cdr2和cdr3及重链可变区cdr1、cdr2和cdr3，其热稳定好、t细胞活性更好，能更有效阻断lag-3与mhcii结合，更好的体内药效和pk。还提供一种靶向lag-3的双特异性抗体，其能同时靶向lag-3和另外一个靶点；新的设计能实现一个分子同时针对两个特异靶点作用，达到一个分子代替两个分子联合，甚至有协同治疗肿瘤的效果。一个分子的工艺，生产成本，临床试验等要比两个单独的分子联合具有更便捷，成本更低等优势。为解决上述技术问题，本发明的技术方案之一为：一种lag-3结合蛋白，其包括轻链可变区和/或重链可变区；所述轻链可变区包含：如seqidno:5所示的氨基酸序列的cdr1，如seqidno:6所示的氨基酸序列的cdr2，和/或，如seqidno:7所示的氨基酸序列的cdr3；所述重链可变区包含：如seqidno:8所示的氨基酸序列的cdr1，如seqidno:9所示的氨基酸序列的cdr2，和/或，如seqidno:10所示的氨基酸序列的cdr3。如上所述的lag-3结合蛋白，所述轻链可变区的j基因区选自以下组的一种：hjk1、hjk2.1、hjk2.2、hjk2.3、hjk2.4、hjk3、hjk4.1、hjk4.2、hjk5；优选hjk4.1；和/或，所述重链可变区的以下j基因区选自以下组的一种：hjh1、hjh2、hjh3.1、hjh3.2、hjh4.1、hjh4.2、hjh4.3、hjh5.2、hjh6.1、hjh6.2、hjh6.3；优选hjh4.1。在一些优选的具体实施例中，如上所述的lag-3结合蛋白，所述轻链可变区包含如seqidno:3、seqidno:23-29或其突变所示的氨基酸序列；和/或，所述重链可变区包含如seqidno:4、seqidno:30-37或其突变所示的氨基酸序列；所述突变在原氨基酸序列上有一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加，优选与原氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％的序列同一性，并且所述突变保持或改善了所述抗体对lag-3的结合。优选地，所述轻链可变区包含如seqidno:3所示的氨基酸序列，所述重链可变区包含如seqidno:4所示的氨基酸序列；所述轻链可变区包含如seqidno:23所示的氨基酸序列，所述重链可变区包含如seqidno:30所示的氨基酸序列；所述轻链可变区包含如seqidno:23所示的氨基酸序列，所述重链可变区包含如seqidno:31所示的氨基酸序列；所述轻链可变区包含如seqidno:24所示的氨基酸序列，所述重链可变区包含如seqidno:31所示的氨基酸序列；所述轻链可变区包含如seqidno:25所示的氨基酸序列，所述重链可变区包含如seqidno:31所示的氨基酸序列；所述轻链可变区包含如seqidno:26所示的氨基酸序列，所述重链可变区包含如seqidno:31所示的氨基酸序列；所述轻链可变区包含如seqidno:27所示的氨基酸序列，所述重链可变区包含如seqidno:31所示的氨基酸序列；所述轻链可变区包含如seqidno:28所示的氨基酸序列，所述重链可变区包含如seqidno:31所示的氨基酸序列；所述轻链可变区包含如seqidno:29所示的氨基酸序列，所述重链可变区包含如seqidno:31所示的氨基酸序列；所述轻链可变区包含如seqidno:25所示的氨基酸序列，所述重链可变区包含如seqidno:32所示的氨基酸序列；所述轻链可变区包含如seqidno:26所示的氨基酸序列，所述重链可变区包含如seqidno:32所示的氨基酸序列；所述轻链可变区包含如seqidno:28所示的氨基酸序列，所述重链可变区包含如seqidno:30所示的氨基酸序列；所述轻链可变区包含如seqidno:28所示的氨基酸序列，所述重链可变区包含如seqidno:33所示的氨基酸序列；所述轻链可变区包含如seqidno:28所示的氨基酸序列，所述重链可变区包含如seqidno:34所示的氨基酸序列；所述轻链可变区包含如seqidno:28所示的氨基酸序列，所述重链可变区包含如seqidno:35所示的氨基酸序列；所述轻链可变区包含如seqidno:28所示的氨基酸序列，所述重链可变区包含如seqidno:36所示的氨基酸序列；所述轻链可变区包含如seqidno:28所示的氨基酸序列，所述重链可变区包含如seqidno:37所示的氨基酸序列。在一些优选的具体实施例中，如上所述的lag-3结合蛋白，其是抗体、fab、fab’、f(ab’)2、fv、scfv、双特异性抗体、多特异性抗体、单域抗体或单区抗体，或由上述抗体制得的单克隆抗体或多克隆抗体。在一些优选的具体实施例中，如上所述的lag-3结合蛋白，其为包括人源抗体轻链恒定区和人源抗体重链恒定区的免疫球蛋白。优选地，所述人源抗体轻链恒定区为κ链或者λ链，或，所述人源抗体重链恒定区为higg1、higg2、higg4或其突变；所述突变在原氨基酸序列上有一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加，优选与原氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％的序列同一性，并且所述突变保持或改善了所述抗体对lag-3的结合。在一些优选的具体实施例中，如上所述的lag-3结合蛋白，其轻链包含如seqidno:38或seqidno:39所示的氨基酸序列或其突变；和/或，其重链包含如seqidno:40或seqidno:41所示的氨基酸序列或其突变；所述突变在原氨基酸序列上有一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加，优选与原氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％的序列同一性，并且所述突变保持或改善了所述抗体对lag-3的结合。优选地，所述轻链的氨基酸序列如seqidno:38所示；所述重链的氨基酸序列如seqidno:40所示；或，所述轻链的氨基酸序列如seqidno:38所示；所述重链的氨基酸序列如seqidno:41所示；或，所述轻链的氨基酸序列如seqidno:39所示；所述重链的氨基酸序列如seqidno:40所示；或，所述轻链的氨基酸序列如seqidno:39所示；所述重链的氨基酸序列如seqidno:41所示。为解决上述技术问题，本发明的技术方案之二为：一种靶向lag-3的双特异性抗体，其包括第一蛋白功能区和第二蛋白功能区，其特征在于，所述第一蛋白功能区为技术方案之一所述的lag-3结合蛋白；所述第二蛋白功能区为非lag-3结合蛋白；优选地，所述第一蛋白功能区和第二蛋白功能区分别选自免疫球蛋白、scfv(singlechainfv，也称为单链可变片段)、fab、fab’或f(ab’)2，且所述第一蛋白功能区和第二蛋白功能区中只有一个蛋白功能区为免疫球蛋白。为了设计生产工艺简单且保留有效活性的双特异性抗体，本发明的双特异性抗体的形式为类似正常igg的结构，具体地，在其结构上设计能够靶向两个靶点的轻链和/或者重链可变区的蛋白功能区，两个蛋白功能区共享相同的重链fc区域。较佳地，将一个靶点的抗体分子以一个或者多个scfv的形式，连到另一靶点完整抗体的轻链或重链的一端。这样既避免表达不同重链fc和/或不同轻链带来表达产物的不均一，例如knob形式的fc和hole形式的fc共表达，其表达过程中会有不均一的fc-fc配对形式，给纯化工艺带来很多不便利；也可以避免轻、重链部分区域交换(cross)设计可能对结构活性的影响，以及工艺过程中出现的fc错配现象。通过一个或者多个scfv设计，还可以调节针对特定靶点的活性。因此，在一些优选的具体实施例中，如上所述的靶向lag-3的双特异性抗体，其中，所述第一蛋白功能区为免疫球蛋白，所述第二蛋白功能区为一个或多个scfv；或，所述第一蛋白功能区为一个或多个scfv，所述第二蛋白功能区为免疫球蛋白，所述免疫球蛋白的恒定区包括人源抗体轻链恒定区和人源抗体重链恒定区。优选地，所述人抗体轻链恒定区为κ链或者λ链，所述人抗体重链恒定区为higg1、higg2、higg4或其突变；所述突变在原氨基酸序列上有一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加，优选与原氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％的序列同一性，并且所述突变保持或改善了所述抗体对抗原例如lag-3、pd-1等的结合。在一些优选的具体实施例中，如上所述的靶向lag-3的双特异性抗体，其中，所述scfv包括重链可变区与轻链可变区，所述重链可变区与轻链可变区通过连接子连接，所述scfv通过连接子与所述免疫球蛋白连接，所述连接子优选为(gly-gly-gly-gly-ser)w[以下简写为(g4s)w]；所述的w优选为0～10之间的整数，更优选为1、2、3或者4。所述双特异设计概括(通式1)请参见实施例12之表10。此外，所述连接子还可以选自本领域常规的用作连接子的肽段。在一些优选的具体实施例中，如上所述的靶向lag-3的双特异性抗体，其中，所述scfv为轻链可变区-连接子-重链可变区结构，其轻链可变区n末端或重链可变区c末端通过连接子相应地连接在所述的免疫球蛋白轻链和/或重链的c末端或n末端；或所述scfv为重链可变区-连接子-轻链可变区结构，其重链可变区n末端或者轻链可变区c末端通过连接子相应地连接在所述的免疫球蛋白轻链和/或重链的c末端或n末端。在一些优选的具体实施例中，如上所述的靶向lag-3的双特异性抗体，其中，所述连接子为(g4s)3，和/或，所述scfv的数量为两个，对称地连接在所述的免疫球蛋白轻链和/或重链。优选地，所述scfv为轻链可变区-连接子-重链可变区结构，两个scfv的重链可变区的c末端分别通过(g4s)3对称地连接在所述免疫球蛋白的两条重链可变区的n末端，或两个scfv的轻链可变区的n末端分别通过(g4s)3对称地连接在所述免疫球蛋白的两条重链的c末端；或，所述scfv为重链可变区-连接子-轻链可变区结构，两个scfv的轻链可变区的c末端分别通过(g4s)3对称地连接在所述免疫球蛋白的两条轻链可变区的n末端，或两个scfv的重链可变区的n末端分别通过(g4s)3对称地连接在所述免疫球蛋白的两条轻链可变区的c末端。在一些优选的具体实施例中，如上所述的靶向lag-3的双特异性抗体，其中，所述第二蛋白功能区靶向pd-1。优选地，所述第二蛋白功能区为抗pd-1抗体。更优选地，所述抗pd-1抗体为nivolumab、pembrolizumab或者ba08。在一些优选的具体实施例中，如上所述的靶向lag-3的双特异性抗体，其选自以下组：(1)所述第一蛋白功能区为免疫球蛋白，其包含以下轻链和重链或其突变：其中，所述轻链的氨基酸序列如seqidno:38所示，所述重链的氨基酸序列如seqidno:40所示；所述轻链的氨基酸序列如seqidno:38所示，所述重链的氨基酸序列如seqidno:41所示；所述轻链的氨基酸序列如seqidno:39所示，所述重链的氨基酸序列如seqidno:40所示；或，所述轻链的氨基酸序列如seqidno:39所示，所述重链的氨基酸序列如seqidno:41所示；和/或，所述第二蛋白功能区为scfv或其突变，其中，所述scfv的轻链可变区的氨基酸序列如seqidno:42的第1-107位氨基酸序列所示，所述scfv的重链可变区的氨基酸序列如seqidno:43的第1-113位氨基酸序列所示；或，所述scfv的轻链可变区的氨基酸序列如seqidno:44的第1-111位氨基酸序列所示，所述scfv的重链可变区的氨基酸序列如seqidno:45的第1-120位氨基酸序列所示；所述突变在原氨基酸序列上有一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加，优选与原氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％的序列同一性，并且所述突变保持或改善了所述抗体对抗原例如lag-3、pd-1等的结合；优选地，当所述scfv连接在所述免疫球蛋白的两条重链的c末端时，所述重链的c末端由k突变为a；(2)所述第一蛋白功能区为scfv或其突变，其中，所述scfv的轻链可变区的氨基酸序列如seqidno:23-29所示；和/或，所述scfv的重链可变区的氨基酸序列如seqidno:30-37所示；和/或，所述免疫球蛋白的轻链的氨基酸序列如seqidno:42所示，所述免疫球蛋白的重链的氨基酸序列如seqidno:43所示；或，所述免疫球蛋白的轻链的氨基酸序列如seqidno:44所示，所述免疫球蛋白的重链的氨基酸序列如seqidno:45所示；所述突变在原氨基酸序列上有一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加，优选与原氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％的序列同一性，并且所述突变保持或改善了所述抗体对抗原例如lag-3、pd-1等的结合；优选地，当所述scfv连接在所述免疫球蛋白的两条重链的c末端时，所述重链的c末端由k突变为a。在一些优选的具体实施例中，如上所述的靶向lag-3的双特异性抗体，其中，(i)所述第一蛋白功能区为scfv，其轻链可变区的氨基酸序列如seqidno:28所示，其重链可变区的氨基酸序列如seqidno:31所示，所述连接子为(g4s)3；所述第二蛋白功能区为免疫球蛋白；其轻链的氨基酸序列如seqidno:42所示，其重链的氨基酸序列如seqidno:43所示；其中，所述scfv为轻链可变区-连接子-重链可变区结构，两个scfv的重链可变区的c末端分别通过(g4s)3对称地连接在所述免疫球蛋白的两条重链的n末端；或，所述scfv为重链可变区-连接子-轻链可变区结构，两个scfv的重链可变区的n末端分别通过(g4s)3对称地连接在所述免疫球蛋白的两条重链的c末端，且所述重链的c末端由k突变为a；或，所述scfv为轻链可变区-连接子-重链可变区结构，两个scfv的重链可变区的c末端分别通过(g4s)3对称地连接在所述免疫球蛋白的两条轻链的n末端；或，所述scfv为重链可变区-连接子-轻链可变区结构，两个scfv的重链可变区的n末端分别通过(g4s)3对称地连接在所述免疫球蛋白的两条轻链的c末端；或，(ii)所述第一蛋白功能区为scfv，其轻链可变区的氨基酸序列如seqidno:28所示，其重链可变区的氨基酸序列如seqidno:31所示，所述连接子为(g4s)3；所述第二蛋白功能区为免疫球蛋白，其轻链的氨基酸序列如seqidno:44所示，其重链的氨基酸序列如seqidno:45所示；其中，所述scfv为轻链可变区-连接子-重链可变区结构，两个scfv的重链可变区的c末端分别通过连接子(g4s)3对称地连接在所述免疫球蛋白的两条重链的n末端；或，所述scfv为重链可变区-连接子-轻链可变区结构，两个scfv的重链可变区的n末端分别通过连接子(g4s)3对称地连接在所述免疫球蛋白的两条重链的c末端，且所述重链的c末端由k突变为a；或，所述scfv为轻链可变区-连接子-重链可变区结构，两个scfv的重链可变区的c末端分别通过连接子(g4s)3对称地连接在所述免疫球蛋白的两条轻链的n末端；或，所述scfv为重链可变区-连接子-轻链可变区结构，两个scfv的重链可变区的n末端分别通过连接子(g4s)3对称地连接在所述免疫球蛋白的两条轻链的c末端；或，(iii)所述第一蛋白功能区为scfv，所述scfv数量为一对，其轻链可变区的氨基酸序列如seqidno:28所示，其重链可变区的氨基酸序列如seqidno:36所示，所述连接子为(g4s)3；所述第二蛋白功能区为免疫球蛋白，其轻链的氨基酸序列如seqidno:44所示，其重链的氨基酸序列如seqidno:45所示；其中，所述scfv为轻链可变区-连接子-重链可变区结构，两个scfv的重链可变区的c末端分别通过连接子(g4s)3对称地连接在所述免疫球蛋白的两条重链的n末端；或，所述scfv为重链可变区-连接子-轻链可变区结构，两个scfv的重链可变区的n末端分别通过连接子(g4s)3对称地连接在所述免疫球蛋白的两条重链的c末端，且所述重链的c末端由k突变为a。在一些优选的具体实施例中，如上所述的靶向lag-3的双特异性抗体，其包括以下氨基酸序列：如seqidno:44所示的轻链氨基酸序列，如seqidno:46所示的含重链的氨基酸序列；或，如seqidno:42所示的轻链氨基酸序列，如seqidno:47所示的含重链的氨基酸序列；或，如seqidno:42所示的轻链氨基酸序列，如seqidno:48所示的含重链的氨基酸序列；或，如seqidno:49所示的含轻链的氨基酸序列，如seqidno:43所示的重链氨基酸序列；或，如seqidno:50所示的含轻链的氨基酸序列，如seqidno:43所示的重链氨基酸序列。或者，本发明所述的双特异性抗体为dvd-ig(dual-variabledomainig)双特异性抗体，其结构是在正常抗体轻、重链的n末端分别再接入另一个抗体的vl和vh，通过两个抗体可变区结合双靶点实现双功能。所述双特异性抗体的设计概括(通式2)请参见实施例12之表12。在一优选的具体实施例中，所述的双特异性抗体由含轻链的序列和含重链的序列组成。所述的双特异性抗体选自以下组合：含轻链的序列为ab2317vl-(g4s)3-nivovl-lc(κ链)，含重链的序列为ab2317vh-(g4s)3-nivovh-hc(higg4)；或，含轻链的序列为pemvl-(g4s)3–ab2317vl-lc(κ链)，含重链的序列为pemvh-(g4s)3–ab2317vh-hc(higg4)；或，含轻链的序列为nivovl-(g4s)3–ab2325vl-lc(κ链)，含重链的序列为nivovh-(g4s)3–ab2325vh-hc(higg1)。或者，本发明所述的双特异性抗体为包括第一蛋白功能区和第二蛋白功能区，其中之一的蛋白功能区为免疫球蛋白，另一蛋白功能区为fab’或f(ab’)2。在一优选的具体实施例中，所述的第一蛋白功能区为免疫球蛋白，所述第二蛋白功能区为fab’或f(ab’)2；或者所述的第一蛋白功能区为fab’或f(ab’)2，所述第二蛋白功能区为免疫球蛋白；所述fab’或f(ab’)2与所述免疫球蛋白通过二硫键或连接子连接，所述连接子优选本领域常规的可作为连接子的肽段或(gly-gly-gly-gly-ser)w，所述w优选为0～10之间的整数，更优选为1、2、3或者4；所述免疫球蛋白的恒定区较佳地为人抗体恒定区，所述人抗体恒定区优选包括人抗体轻链恒定区和人抗体重链恒定区，所述人抗体轻链恒定区优选κ链或者λ链；所述人抗体重链恒定区优选higg1、higg2或者higg4。当所述fab’或f(ab’)2的轻链与重链之间通过连接子连接后，因为轻重链之间有连接子，其已不是严格意义上的fab’或f(ab’)2。为解决上述技术问题，本发明的技术方案之三为：一种分离的核酸，其编码如上所述的lag-3结合蛋白或如上所述的靶向lag-3的双特异性抗体。为解决上述技术问题，本发明的技术方案之四为：一种包含如上所述的分离的核酸的表达载体。为解决上述技术问题，本发明的技术方案之五为：一种宿主细胞，其包含如上所述的表达载体。优选地，所述宿主细胞是原核细胞或真核细胞。为解决上述技术问题，本发明的技术方案之六为：一种lag-3结合蛋白或靶向lag-3的双特异性抗体的制备方法，其包含培养如上所述的宿主细胞，从培养物中获得lag-3结合蛋白或靶向lag-3的双特异性抗体。为解决上述技术问题，本发明的技术方案之七为：一种抗体药物偶联物，其包含细胞毒性剂，以及如上技术方案之一所述的lag-3结合蛋白或如上技术方案之二所述的靶向lag-3的双特异性抗体。为解决上述技术问题，本发明的技术方案之八为：一种药物组合物，其包含如上所述的lag-3结合蛋白，或如上所述的靶向lag-3的双特异性抗体，或如上所述的抗体药物偶联物。为解决上述技术问题，本发明的技术方案之九为：一种药盒组合，其包含药盒a和药盒b；所述药盒a包括如上所述的lag-3结合蛋白，或如上所述的靶向lag-3的双特异性抗体，或如上所述的抗体药物偶联物，或如上所述的药物组合物；所述药盒b包含其它治疗癌症的药物。为解决上述技术问题，本发明的技术方案之十为：如上所述的lag-3结合蛋白、靶向lag-3的双特异性抗体、抗体药物偶联物、药物组合物和/或药盒组合在制备治疗和/或预防癌症的药物中的应用。优选地，所述的癌症选自由白血病、淋巴瘤、卵巢癌、乳腺癌、子宫内膜癌、结肠癌、直肠癌、膀胱癌、尿路上皮癌、非小细胞肺癌、肺腺癌、肺鳞状细胞癌、支气管癌、骨癌、前列腺癌、胰腺癌、胃癌、肝细胞癌、胆囊癌、胆管癌、食管癌、肾细胞癌、甲状腺癌、头颈鳞状细胞癌、睾丸癌、内分泌腺癌、肾上腺癌、脑垂体癌、皮肤癌、软组织癌、血管癌、脑癌、神经癌、眼癌、脑膜癌、口咽癌、下咽癌、宫颈癌、子宫癌、成胶质细胞瘤、髓母细胞瘤、星形细胞瘤、神经胶质瘤、脑膜瘤、胃泌素瘤、成神经细胞瘤，黑素瘤、骨髓增生异常综合征和肉瘤组成的群组。由此，本发明还提供了一种癌症的治疗方法，所述方法为使用如上所述的lag-3结合蛋白、靶向lag-3的双特异性抗体、抗体药物偶联物、药物组合物和/或药盒组合来治疗患有上述癌症的患者。应了解，本发明“第一”、“第二”均无实际意义，仅为区分相同的术语。在提及scfv或细胞因子或细胞因子受体或fab’或f(ab’)2的数量时，“一对”和“两个”、“两对”和“四个”具有相同的含义。在提及轻链或重链或轻链可变区或重链可变区的数量时，“一个”和“一条”、“两个”和“两条”具有相同的含义。在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的细胞培养、分子遗传学、核酸化学、免疫学实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的常规步骤。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。如本文中所使用的，术语ec50是指半最大效应浓度(concentrationfor50％ofmaximaleffect)，是指能引起50％最大效应的浓度。如本文中所使用的，术语“抗体”，通常是指由两对多肽链[每对具有一条轻(l)链和一条重(h)链]组成的免疫球蛋白。从一般意义上，重链可以理解为抗体中分子量较大的多肽链，轻链是指抗体中分子量较小的多肽链。轻链可分类为κ和λ轻链。重链通常可分类为μ、δ、γ、α或ε，并且分别将抗体的同种型定义为igm、igd、igg、iga和ige。在轻链和重链内，可变区和恒定区通过大约12或更多个氨基酸的“j”区连接，重链还包含大约3个或更多个氨基酸的“d”区。各重链由重链可变区(vh)和重链恒定区(ch)组成。重链恒定区由3个结构域(ch1、ch2和ch3)组成。各轻链由轻链可变区(vl)和轻链恒定区(cl)组成。轻链恒定区由一个结构域cl组成。抗体的恒定区可介导免疫球蛋白与宿主组织或因子，包括免疫系统的各种细胞(例如，效应细胞)和经典补体系统的第一组分(c1q)的结合。vh和vl区还可被细分为具有高变性的区域[称为互补决定区(cdr)]，其间散布有较保守的称为构架区(fr)的区域。各vh和vl由按下列顺序：fr1、cdr1、fr2、cdr2、fr3、cdr3、fr4从氨基末端至羧基末排列的3个cdr和4个fr组成。各重链/轻链对应的可变区(vh和vl)分别形成抗体结合部位。氨基酸至各区域或结构域的分配遵循kabatea.etal.,sequencesofproteinsofimmunologicalinterest[nationalinstitutesofhealth,bethesda,md.(1987and1991)]，或chothia&lesk1987)].mol.biol.196:901-917；chothia等人(1989)nature342:877-883的定义。特别地，重链还可以包含3个以上cdr，例如6、9或12个。例如在本发明的双特异性抗体中，重链可以是igg抗体的重链的n端连接另一个抗体的scfv，这种情况下重链含有9个cdr。在本文中，除非上下文明确指出，否则当提及术语“抗体”时，其不仅包括完整抗体，而且包括抗体的抗原结合片段。“抗原结合片段”是指包含全长抗体的片段的多肽，其保持特异性结合全长抗体所结合的相同抗原的能力，和/或与全长抗体竞争对抗原的特异性结合，其也被称为“抗原结合部分”。通常参见fundamentalimmunology,ch.7，paul,w.，ed.，第2版，ravenpress，n.y.(1989)，其以其全文通过引用合并入本文，用于所有目的。可通过重组dna技术或通过完整抗体的酶促或化学断裂产生抗体的抗原结合片段。在一些情况下，抗原结合片段包括fab、fab’、f(ab’)2、fd、fv、dab和互补决定区(cdr)片段、单链结合片段(例如，scfv)、嵌合抗体、双抗体(diabody)和这样的多肽，其包含足以赋予多肽特异性抗原结合能力的抗体的至少一部分。术语“fv”意指向抗体的单臂的vl和vh结构域组成的抗体片段；术语“fab”意指由vl、vh、cl和ch1(或者ch)结构域组成的抗体片段；术语“f(ab’)2”意指包含通过铰链区上的二硫桥连接的两个fab片段的抗体片段。在一些情况下，抗体的抗原结合片段是单链结合片段(例如，scfv)，其中vl和vh结构域通过使其能够产生为单个多肽链的连接体配对形成单价分子[参见例如bird等人，science242:423-426(1988)和huston等人，proc.natl.acad.sci.usa85:5879-5883(1988)]。此类scfv分子可具有一般结构：nh2-vl-接头-vh-cooh或nh2-vh-接头-vl-cooh。合适的现有技术接头由重复的g4s氨基酸序列或其变体组成。例如，可使用具有氨基酸序列(g4s)4或(g4s)3接头，但也可使用其变体。可使用本领域技术人员已知的常规技术(例如重组dna技术或酶促或化学断裂法)从给定的抗体获得抗体的抗原结合片段(例如上述抗体片段)，并且以与用于完整抗体的方式相同的方式就特异性筛选抗体的抗原结合片段。如本文中所使用的，术语“分离的”指的是，从天然状态下经人工手段获得的。如果自然界中出现某一种“分离”的物质或成分，那么可能是其所处的天然环境发生了改变，或从天然环境下分离出该物质，或二者情况均有发生。例如，某一活体动物体内天然存在某种未被分离的多聚核苷酸或多肽，而从这种天然状态下分离出来的高纯度的相同的多聚核苷酸或多肽即称之为分离的。术语“分离的”不排除混有人工或合成的物质，也不排除存在不影响物质活性的其它不纯物质。如本文中所使用的，术语“宿主细胞”是指，可用于导入载体的细胞，其包括但不限于，如大肠杆菌等原核细胞，如酵母细胞等的真菌细胞，如s2果蝇细胞或sf9等的昆虫细胞，或者如纤维原细胞，cho细胞，cos细胞，nso细胞，hela细胞，bhk细胞，hek293细胞或人细胞等的动物细胞。如本文中所使用的，术语“kd”是指特定抗体一抗原相互作用的解离平衡常数(kd)，其用于描述抗体与抗原之间的结合亲和力。平衡解离常数越小，抗体一抗原结合越紧密，抗体与抗原之间的亲和力越高。通常，抗体以小于大约10-5m，例如小于大约10-6m、10-7m、10-8m、10-9m或10-10m或更小的解离平衡常数结合抗原，例如，如使用表面等离子体共振术(spr)在biacore仪中测定的。例如用kinexa方法在kinexa400仪器上检测到的抗体和细胞结合的亲和力。在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。本发明所用试剂和原料均市售可得。本发明的积极进步效果在于：(1)lag-3结合蛋白更加有效阻断lag-3与mhcii的结合，从而解除负调控apc/t细胞之间的信号转导与抗原递呈；(2)所得人源化lag-3抗体显示很好的细胞功能活性，例如很好地激活人t细胞、人dc细胞功能与活性，动物药效，更好的pk特征，高表达产量，和热稳定性；(3)序列特异的双特异性抗体(sbody)针对双靶活性好，稳定，表达量高，结构类似正常igg抗体，纯化工艺简单。附图说明图1为本发明抗人lag-3抗体mab23c的功能与活性：a.mab23c和人lag-3的结合活性(elisa)；b.mab23c阻止lag-3和daudi细胞结合(blocking)活性。图2为凝胶电泳(page)图，用于评价本发明抗人lag-3人源化抗体ab2317热稳定性。图3为本发明抗人lag-3人源化抗体ab2317的功能与活性：a.ab2317激活人t细胞活性；b.ab2317激活人dc细胞刺激人t细胞活性(mlrassay)。图4为本发明抗人lag-3人源化抗体ab2317动物体内药效评估。图5a为本发明双特异性抗体(sbody)lb2373结构及相关检测数据图，包括结构示意图(c)，和人lag-3的结合活性检测结果(a)，和人pd-1的结合活性检测结果(b)。图5b为本发明双特异性抗体(sbody)lb2374结构及相关检测数据图，包括结构示意图(c)，和人lag-3的结合活性检测结果(a)，和人pd-1的结合活性检测结果(b)。图5c为本发明双特异性抗体(sbody)lb2371结构及相关检测数据图，包括结构示意图(c)，和人lag-3的结合活性检测结果(a)，和人pd-1的结合活性检测结果(b)。图5d为本发明双特异性抗体(sbody)lb2372结构及相关检测数据图，包括结构示意图(c)，和人lag-3的结合活性检测结果(a)，和人pd-1的结合活性检测结果(b)。具体实施方式以下结合实施例进一步描述本发明，但这些实施例并非限制着本发明的范围。本发明实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，如冷泉港的抗体技术实验手册，分子克隆手册；或按照原料或商品制造厂商所建议的条件。未注明具体来源的试剂，为市场购买的常规试剂。实施例1：抗原、抗体的克隆、表达和纯化本发明所用的抗原或购自如下不同公司：北京百普赛斯生物科技有限公司lag-3-his(货号：la3-h5222)，cyno-lag-3-mfc(货号la3-c52a0)或北京义翘神州科技有限公司lag-3-his(货号：16498-h08h)，lag-3-hfc(货号：16498-h05h)，cyno-lag-3-his(货号90841-c08h)，或由本发明表达纯化得到。表达的人lag-3蛋白序列为ncbireferencesequence:np_002277.4，全长1-525氨基酸，其中1-22位为信号肽；胞外(ecd)区域为23-422位氨基酸；胞外(ecd)区域23-239位氨基酸的第一，第二区域(domain#1and#2，d12)d12-his,d12-hfc。鼠lag-3histagged(mlag-3-his)的序列来自ncbigi|148667361|gb|edk99777.1的胞外区(ecd)23-406位氨基酸。macacalag-3histagged(cynolag-3-his)的序列ncbi号np_001271679.1，其胞外区(ecd)23-434位氨基酸。本发明所用抗体，包括阳性对照抗体ref(即bms-986016，序列来自wo2014008218a1，lag3.5，#12轻链，#14重链)，和pd-1抗体nivolumab(序列来自wo2013019906)，pembrolizumab(序列从www.drugbank.ca得到，accessionnumber：db09037)均由本发明表达纯化。表达所用ptt5载体(biovector，cat#:102762)。将所表达的重组蛋白，抗体轻、重链序列克隆到ptt5载体上，经瞬时转染hek293e细胞(lifetechnologiescat.no.11625019)表达，后纯化得到。具体地，293细胞在gibcofreestyle293expressionmedium(gibco，cat#12338018)培养基扩培。瞬转开始之前，调节细胞浓度至6～8×105cell/ml，1％fbs(ausgenexfbsexcellent供应商：ausgenex，china，cat#fbssa500-s)，37℃8％co2摇床培养24h，再次镜检存活率>95％，细胞浓度在1.2×106cell/ml。准备300ml培养体系细胞，15mlopti-mem(gibco，cat#31985070)溶入重链、轻链质粒各150μg(如果是重组蛋白，单个质粒用量为300μg)，0.22μm过滤除菌。再取15mlopti-mem溶入1mg/mlpei(polysciences,inc,cat#23966-2)600μl后静置5min。把pei缓慢加入质粒中，室温孵育10min，边摇晃培养瓶边缓慢滴入质粒pei混合溶液，37℃8％co2摇床培养5天收样，3300g10min取上清进行纯化。抗体或-fc融合蛋白纯化：将样品高速离心去除杂质，用pbsph7.4平衡含有proteina(mabselect，gehealthcarelifescience，cat#71-5020-91ae)的重力柱(生工生物，cat#f506606-0001)，2-5倍柱体积冲洗。将样品过柱。用5-10倍柱体积的pbs(生工生物，cat#b548117-0500)冲洗柱子。再用ph3.50.1m乙酸洗脱目的蛋白，后用ph8.0的tris-hcl调节至中性，酶标仪测定浓度，分装、储存备用。histagged蛋白纯化：将样品高速离心去除杂质。平衡镍柱(nismartbeads6ff常州天地人和生物科技有限公司cat#sa036010)：用含有10mm咪唑0.5mnacl的pbsph7.4溶液平衡镍柱，2-5倍柱体积冲洗。将样品上清过柱。漂洗杂蛋白：使用含有10mm咪唑0.5mnacl的pbsph7.4溶液冲洗层析柱，除去非特异结合的杂蛋白，并收集流出液。用含有250mm咪唑0.5mnacl的pbsph7.4洗脱目的蛋白。buffer置换：将洗脱的目的蛋白过超滤管12000g10min离心(超滤管merckmilliporecat#ufc500308)，再补加1mlpbs，测定浓度，分装、储存备用。实施例2：人lag-3高表达细胞株(hlag-3+细胞)构建及结合活性(elisa)检测本发明所用的人lag-3高表达细胞株通过公司稳定细胞株构建平台完成。具体步骤如下：实验开始第1天，将293t细胞(中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库cat#gnhu17)接种于两个6cm培养皿，每个培养皿里的细胞数达到7.5×105。第2天将包裹质粒(pgag-pol,pvsv-g等biovector质粒载体菌种细胞基因保藏中心)和克隆有人lag-3基因的质粒pbabe-hlag-3各4μg加入opti-mem(thermofisherscientificcat#31985070)，使最终体积为200μl，另准备200μlopti-mem加入36μl转染试剂fectin(上海源培生物科技股份有限公司cat#f210)，二者混匀，室温放置5min，然后将混合物(每皿各200μl)滴加入培养好的293t细胞。第3天将293t细胞培养液换为4mldmem高糖培养基(上海源培生物科技股份有限公司/源培生物：cat#l130kj)。第4天将cho-k1细胞(中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库cat#scsp-507)接种于10cm培养皿，使细胞数达到5×105。第5天收集293t细胞上清(病毒)，用0.45μm滤膜过滤至培养好的cho-k1细胞，同时加入10μg/mlpolybrene(上海翊圣生物科技有限公司cat#40804es76)，混匀后放置培养箱，3～4h后换成dmem/f1210％fbs培养基(源培生物，cat#l310kj)。第7天将cho-k1细胞传代，第8天传代的细胞开始加入10μg/mlpuromycin进行筛选(源培生物，cat#s250j0)。2-3天细胞大量死亡，更换培养基继续培养，直到细胞不再死亡时，细胞大量扩增，筛选单克隆细胞株，扩培，冻存保种。本实施例所用的人lag-3(pbabe-hlag-3)的氨基酸序列np_002277.4之全序列1-525氨基酸，其中1-22位为信号肽序列，即第23-525位为本发明构建cho-k1hlag-3+细胞系所表达的蛋白序列。hlag-3+细胞结合活性(elisa)检测：将上述实施例得到的细胞人lag-3高表达的单克隆细胞株扩培后，按1×105/孔铺96孔板，37℃培养箱过夜孵育后去除上清，用免疫染色固定液(上海碧云天生物技术有限公司cat#p0098)100μl/孔，室温固定半小时。pbs(源培生物，cat#b320)洗一遍后230μl5％牛奶37℃封闭2小时，pbst洗3遍。每孔加入50μl，10μg/ml，5倍梯度稀释的待测样品。37℃孵育1小时，后pbst洗5遍。加anti-humanhrp(jacksonimmunoresearch，cat#109-035-003)1:250050μl/孔37℃孵育1小时，后pbst洗5遍，每孔加入50μltmb(surmodiccat#ttmb-1000-01)显色，加入50μl/孔1mh2so4终止反应。酶标仪(multiskangothermo型号51119200)读数，graphpadprism5进行数据分析。实施例3：抗lag-3抗体和lag-3抗原结合实验(elisa)用ph7.4的pbs缓冲液将lag-3-his，lag-3-d12-his，猴lag-3-his(cynolag-3-his)或者mlag-3-his等重组蛋白稀释至1μg/ml，2μg/ml(hlag-3d12-his),或者5μg/ml(cynolag-3-his)浓度，以50μl/孔的体积加入96孔酶标板(corning，cls3590-100ea)中，于37℃孵育箱中放置2小时。弃去液体后，加入用pbs稀释的5％脱脂牛奶(光明脱脂奶粉)封闭液230μl/孔，37℃孵育箱孵育3小时或4℃放置过夜(16-18小时)进行封闭。弃去封闭液，并用pbst缓冲液(ph7.4pbs含0.05％tweeen-20)洗板5次后，加入50μl/孔上清(含检测抗体)或10μg/ml起始，5倍梯度稀释的待测抗体，37℃孵育1小时，pbst洗板5次，加入50μl/孔1:2500稀释的anti-mouse或humanhrp二抗(jacksonimmunoresearch，cat#115-035-003或109-035-003)，37℃孵育1小时。用pbst洗板5次后，加入50μl/孔tmb显色底物(kpl，52-00-03)，室温孵育10-15min，加入50μl/孔1mh2so4终止反应，用multiskango酶标仪(thermofisher,51119200)在450nm处读取吸收值，根据od值挑选结合活性高的克隆或者计算ec50值(对浓度已知的抗体)。实施例4：抗lag-3抗体阻止lag-3和daudi细胞结合活性实验将daudi细胞株(atcc,ccl-213)扩培后，按2x105/孔铺96孔板，1600rpm离心10min后，用免疫染色固定液(上海碧云天生物技术有限公司cat#p0098)100μl/孔室温固定半小时。pbs(源培生物，cat#b320)洗一遍后230μl5％牛奶37℃封闭2小时，pbst洗3遍。每孔加入25μl，100μg/ml，3倍梯度稀释的待测样品和25μl2.5μg/ml的bio-lag3-mfc(北京义翘生物科技有限公司，16498-h05h)。37℃孵育1小时，后pbst洗5遍。加入50μl/孔1:1000稀释的streptavidin-hrp二抗(genscript，m00091)，37℃孵育1小时，后pbst洗5遍，每孔加入50μltmb(surmodiccat#ttmb-1000-01)显色，加入50μl/孔1mh2so4终止反应。酶标仪(multiskangothermo型号51119200)读数，graphpadprism5进行数据分析。实施例5：抗人lag-3抗体的发现本发明用人lag-3重组蛋白(实施例1准备)作为抗原，免疫小鼠、筛选融合杂交瘤，从数百万株杂交瘤克隆中筛选、优化，意外地发现一株和hlag-3结合活性非常好的杂交瘤细胞株。对该细胞株进一步亚克隆筛选得到单克隆细胞株，从单克隆细胞株中得到的鼠源抗体序列，经计算机建模人源设计筛选后得到优化人源化抗体。人源化抗体同样保持和hlag-3很好的结合活性，并且非常意外地，所得人源化抗体还显示很好的细胞功能活性、动物药效、更好的pk特征、高表达产量和热稳定性。具体地，实验用sjl小鼠，雌性，4周龄购自北京维通利华实验动物技术有限公司，动物生产许可证号：scxk(京)2016-0011。小鼠购进后，实验室环境饲养1周，白天光/夜晚暗周期调节，温度20-25℃；湿度40-60％。小鼠分成3只/组/笼。用实施例1准备的抗原进行免疫。佐剂为quickantibody-5w(北京博奥龙免疫技术有限公，kx0210041)。抗原与佐剂比例为1:1。100μl/10μg/只首免，100μl/10μg/只二免、三免，四免，五免小腿肌肉注射。融合前3天，100μl/25μg/只加强免疫。免疫时间为第0、14、28、46、58天和60天(加强免疫)。于第23、50、58天，用上述实施例3的elisa方法检测小鼠血清抗体滴度，选择血清中抗体滴度高并且滴度处于平台期的小鼠进行脾细胞融合，将脾淋巴细胞与骨髓瘤细胞sp2/0细胞(crl-8287tm)进行融合得到杂交瘤细胞铺96孔板。用实施例3的elisa方法对所铺96孔板杂交瘤细胞株进行初次筛选，检测杂交瘤细胞株分泌上清中的抗体和人lag-3的结合活性，选择活性好的克隆，取其上清用实施例4所述方法检测所分泌的抗体阻止hlag-3和daudi细胞的结合(blocking)活性，优选结合活性和blocking活性好的克隆，进一步有限稀释优选所得单克隆抗体细胞株，部分结果见下表。表1杂交瘤融合筛选单克隆细胞活性#：终止，即blocking活性不好的克隆终止，不进行亚克隆筛选；nd:没有检测，即终止的克隆没有后续检测。##：na，不适应，即亚克隆从之前的母克隆而来。具体到本表中，母克隆指编号#15的克隆7b9。表1列出了部分筛选数据。数据显示，在融合杂交瘤初始筛选结合活性好，且blocking活性也很好的克隆，比如表中编号#15，克隆7b9(elisa数值越高，表明结合活性越好。blocking活性数值越低，则表明blocking活性越好)。对#15，克隆7b9进行多次有限稀释，每一次稀释(亚克隆)后7-10天待克隆增殖后，用elisa方法重新检测各个亚克隆所分泌抗体(上清)的结合活性和blocking活性。初始筛选中blocking活性不好的克隆均丢弃，例如上表中的编号1-14均丢弃，不再做后续亚克隆和检测。编号15的克隆7b9经过多次有限稀释后，意外发现，筛选得到的单克隆细胞株7b9g8g3g2d6(编号23)所分泌上清保持了较好的结合活性和最好的blocking活性(同等条件相检测所得数值最低,即0.8035)。从编号23的单克隆细胞株中提取抗体序列，得到本发明优选鼠源抗人lag-3的抗体mab23轻、重链序列。实施例6：本发明鼠源抗人lag-3抗体mab23抗体序列提取、分析鉴定从杂交瘤优选得到的单克隆细胞株中提取抗体序列过程为本领域技术人员常用的方法。具体地，收集上述单克隆细胞株，扩增培养后，取1x106个细胞，用trizol(invitrogen，15596-018)提取rna(按照试剂盒说明书步骤)，将提取的rna并反转录成cdna，反转录试剂盒购自生工生物技术(上海)股份有限公司，cat#b532435。以反转录得到的cdna为模板，进行pcr扩增。扩增产物测序，分别得到mab23抗体轻、重链可变区碱基/编码序列(如下)。所用引物参阅novagen发表的手册tb326rev.c0308。本发明优选的杂交瘤细胞株中获得的鼠源单克隆抗体mab23轻链可变区碱基序列(划线部分为编码序列)：gatgaggacccctgctcagattcttgggatcttgttgctcttgtttccaggtaccagatgtgacattcagatgatccagtctccatcctccttatctgcctctctgggagaaagagtcagtctcacttgtcgggcaagtcaggacattggtagtagtttaaactggcttcagcaggaaccagatggaactatcaaacgcctgatctacgccacatccagtttagattctggtgtccccaaaaggttcagtggcagtaggtctgggtcagattattctctcaccatcagcagccttgagtctgaagattttgtagactattactgtctacaatatgttacttctccgctcacgttcggtgctgggaccaagctggagctgaaacgggctgatgctgcaccaactgtatccatcttcccaccatccagtgagcagttaacatctggaggtgcctcagtcgtgtgcttctgaacaactctaccccagagacatcaattccctg(seqidno:1)本发明优选的杂交瘤细胞株中获得的鼠源单克隆抗体mab23重链可变区碱基序列(划线部分为编码序列)：gatgaaatggcagctgggtttttctcttcctcctgtcagtaattgcaggtgtccaatcccaggttcaactgcagcagtctggggctgagctggtgaggcctggggcttcagtgacgctgtcctgcaaggcttcgggctacacatttactgactatgaaatgcactgggtgaaacagacacctgtgcatggcctggaatggattggaggtattgatcctgaaactgaaggcattgcctataatcagaagttcaggggcaaggccatactgactgcagacaaatcctccatcacagcctacatggagctccgcagcctgacatctgaggactctgccgtctattactgtacaaactccaattactacggtggaagggaggcctggtttgcttactggggccaagggactctggtcactgtctctggagccaaaacgacacccccatctgtctatccactggcccctggatctgctgcccaaactaactccatggtgaccctgggatgcctggtcaagggctatacatagccattactcaaa(seqidno:2)本发明所得到的上述鼠源单克隆抗体mab23轻、重链可变区的碱基序列所编码的氨基酸序列为如下seqidno:3和seqidno:4。本发明优选的杂交瘤单克隆细胞株中获得的鼠源单克隆抗体mab23轻链可变区氨基酸序列：diqmiqspsslsaslgervsltcrasqdigsslnwlqqepdgtikrliyatssldsgvpkrfsgsrsgsdysltisslesedfvdyyclqyvtspltfgagtklelk(seqidno:3)本发明优选的杂交瘤细胞单克隆株中获得的鼠源单克隆抗体mab23重链可变区氨基酸序列:qvqlqqsgaelvrpgasvtlsckasgytftdyemhwvkqtpvhglewiggidpetegiaynqkfrgkailtadkssitaymelrsltsedsavyyctnsnyyggreawfaywgqgtlvtvsg(seqidno:4)将上述抗体轻、重链可变区序列和igg不同型的恒定区，例如人higg1、higg2、higg3、higg4，人轻链κ、λ型；鼠migg1、migg2、migg3，鼠轻链κ、λ型等重组表达纯化得到完整的人鼠嵌合抗体，鼠抗体。以人重链恒定区为higg4、人轻链κ型为例，按实施例1表达纯化方法得到嵌合抗体mab23c，用实施例3、4之方法检测了mab23c和hlag-3的结合活性、阻止lag-3和daudi细胞结合活(blocking活性)，并和对照抗体(ref)平行比较(参见图1的a与b)。结果表明，本发明mab23c和对照抗体(ref)不同，elisa检测到mab23c的ec50和emax分别为0.41nm和1.7，比对照抗体(ref)的0.64nm和1.4要好。特别意外的是，本发明mab23c阻止lag3和daudi细胞结合活性(blocking活性)ic50为2.3nm，这比同条件下ref检测到的ic50(10.5nm)好近4倍(图1b)。blocking活性好直接和该分子作为治疗抗体的药效效果正相关。因此mab23c突出的blocking活性使本发明抗体作为药物开发的候选分子具有更好更高的价值。实施例7:本发明鼠源抗体mab23c人源化本发明意外发现的抗体mab23c(嵌合抗体)具有和特异抗原hlag-3强结合活性，特别是意想不到非常好的blocking活性。显示所述抗体可用于针对lag-3靶点的肿瘤治疗单克隆抗体药物开发具有更好价值，比如可能更好的药效。为了避免用于药物开发过程中的免疫原性等方面的风险，本发明对鼠源mab23抗体进行了人源化设计和筛选，以及序列优化。具体过程描述如下。抗体的cdr定义本领域还有多种不同的方法，这些标记cdr方法可总结如下表。表2本领域抗体cdr定义不同方法汇总*loopccg定义kabat定义abm定义chothia定义contact定义轻链cdr1l24-l34l24-l34l24-l34l24-l34l30-l36轻链cdr2l50-l56l50-l56l50-l56l50-l56l45-l55轻链cdr3l89-l97l89-l97l89-l97l89-l97l89-l96重链cdr1h26-h35h31-h35h26-h35h26-h32h30-h35重链cdr2h50-h65h50-h65h50-h58h52-h56h47-h58重链cdr3h95-h102h95-h102h95-h102h95-h102h93-h101*更多信息可以参阅网站：http://www.bioinf.org.uk/abs/#cdrdef本发明鼠源抗人hlag-3抗体mab23可变区按上述照表所列各种定义方法，对其cdr序列标记/注释如下。表3本发明抗hlag-3(anti-hlag-3)抗体mab23按ccg定义的cdr序列抗体mab23cdrs轻链cdr1rasqdigssln(seqidno:5)轻链cdr2atsslds(seqidno:6)轻链cdr3lqyvtsplt(seqidno:7)重链cdr1gytftdyemh(seqidno:8)重链cdr2gidpetegiaynqkfrg(seqidno:9)重链cdr3snyyggreawfay(seqidno:10)表4本发明抗hlag-3(anti-hlag-3)抗体mab23按kabat定义的cdr序列表5本发明抗hlag-3(anti-hlag-3)抗体mab23按abm定义cdr序列抗体mab23cdrs轻链cdr1rasqdigssln(seqidno:5)轻链cdr2atsslds(seqidno:6)轻链cdr3lqyvtsplt(seqidno:7)重链cdr1gytftdyemh(seqidno:8)重链cdr2gidpetegia(seqidno:12)重链cdr3snyyggreawfay(seqidno:10)表6本发明抗hlag-3(anti-hlag-3)抗体mab23按chothia定义cdr序列抗体mab23cdrs轻链cdr1rasqdigssln(seqidno:5)轻链cdr2atsslds(seqidno:6)轻链cdr3lqyvtsplt(seqidno:7)重链cdr1gytftdy(seqidno:13)重链cdr2dpeteg(seqidno:14)重链cdr3snyyggreawfay(seqidno:10)表7本发明抗hlag-3(anti-hlag-3)抗体mab23按contact定义cdr序列对本发明鼠源抗体mab23的cdr序列做上述分析、标记、定义后，如本领域许多文献公示的方法进行人源化。将鼠源抗体序列和人抗体种系数据库(v-base)比较，找出同源性高的人抗体轻、重链种系，在此基础上，计算机建模，模拟抗体结构中可能影响和抗原结合的位点，回复突变关键位点和组合，筛选出活性优选的人源化抗体分子。具体地，通过序列同源性比较分析，发现和mab23轻链同源性比较好的人抗体种系包含有igkv1-16*01、igkv1-17*01、igkv1-39*01、igkv1-nl1*01、igkv1/or-2*01，igkv1/or-3*01、igkv1/or-4*01、igkv1/or10-1*01、igkv1/or2-1*01、igkv1/or2-2*01等。进一步比较、分析，优选人抗体种系轻链igkv1-39*01。序列比对发现mab23轻链的j基因区和人抗体种系hjk1、hjk2.1、hjk2.2、hjk2.3、hjk2.4、hjk3、hjk4.1、hjk4.2、hjk5同源性高，进一步比较、分析，优选hjk4.1用于mab23轻链人源化人抗体种系j区，进行人源化设计、筛选和序列优化。通过序列同源性比较分析，发现和mab23重链同源性比较好的人抗体种系包含有ighv1-69*02、ighv1-69*04、ighv1-69*06、ighv1-69*08、ighv1-69*09、ighv1-69*10、ighv1-69*14、ighv1-69*17、ighv1-18*01、ighv1-18*03等。进一步比较、分析，优选人种系重链ighv1-18*01序列用于本发明抗体人源化。序列比对发现和mab23的重链j基因区和人抗体种系重链j基因hjh1、hjh2、hjh3.1、hjh3.2、hjh4.1、hjh4.2、hjh4.3、hjh5.2、hjh6.1、hjh6.2、hjh6.3等同源性高，进一步比较、分析，优选hjh4.1用于本发明鼠源抗体mab23重链人源化人抗体种系j区，进行人源化设计、筛选和序列优化。将本发明抗体以mab23的cdr区(见上述cdr之定义)移植到所选择的人源化轻、重链人抗体种系模板上，再与igg轻、重链恒定区重组。然后，以鼠源抗体的三维结构为基础，对包埋残基、与cdr区有直接相互作用的残基，以及对vl和vh的构象有重要影响的残基进行回复突变，筛选这些突变以及突变组合，看对抗体活性的影响，并对cdr区化学不稳定氨基酸残基优化，得到结构、活性等优化的抗体分子序列，即完成本发明鼠源抗体的人源化。以下结合mab23的具体序列，以higg4重链，κ型轻链(序列如下)为例进行说明。人抗体轻链恒定区κ链：seqidno:21；人igg4的重链恒定区：seqidno:22本发明抗人lag-3抗体mab23人源化轻链可变区优选序列：lg2312：seqidno:23；lg2313：seqidno:24；lg2314：seqidno:25；lg2315：seqidno:26，即diqmtqspsslsasvgdrvtitcrasqdigsslnwlqqkpgkaikrliyatssldsgvpsrfsgsgsgtdytltisslqpedfatyyclqyvtspltfgggtkveiklg2316：seqidno:27lg2317：seqidno:28，即diqmtqspsslsasvgdrvtitcrasqdigsslnwyqqkpgkapkrliyatssldsgvpsrfsgsrsgsdftltisslqpedfatyyclqyvtspltfgggtkveiklg2318：seqidno:29。本发明抗人lag-3抗体mab23人源化重链可变区优选序列：lg2342：seqidno:30，即qvqlvqsgaevkkpgasvkvsckasgytftdyemhwvrqapgqglewmggidpetegiaynqkfrgrvtmttdtststaymelrslrsddtavyycarsnyyggreawfaywgqgtlvtvsslg2343：seqidno:31，即qvqlvqsgaevkkpgasvkvsckasgytftdyemhwvkqapgqglewiggidpetegiaynqkfrgratltadkststaymelrslrsddtavyyctnsnyyggreawfaywgqgtlvtvsslg2344：seqidno:32；lg2345：seqidno:33；lg2346：seqidno:34；lg2347：seqidno:35；lg2348：seqidno:36；lg2349：seqidno:37。本发明鼠源抗体mab23轻链的人源化序列中含有不同的回复突变，回复突变位点数目可以是10个或更多，优选0-10个，如上述所列序列。这些任意序列与人抗体轻链恒定区κ链或λ链的恒定区序列组合得到本发明人源化抗体的轻链序列,比如本发明轻链用κ型轻链恒定区，如上所列序列。同样，人源化所用重链可变区也有不同数目的回复突变，回复突变位点数目可以是10个或更多，优选0-10个，如上述所列重链可变区序列。这些含不同数量回复突变的重链可变区序列，同任选人igg1、2、3、4链恒定区序列重组得到本发明人源化抗体重链序列，比如本发明重链用higg4作为恒定区序列为例子加以说明。本发明mab23抗体部分优化人源化抗体轻重链序列，表达量(用本发明实施例1的方法表达纯化并检测抗体产量)和活性评估(本发明实施例3之elisa检测方法，实施例5之blocking活性检测方法)结果如下表。表8本发明mab23抗体人源化抗体部分序列(以人κ型轻链,higg4重链恒定区为例子)*：nb,没有结合。结合曲线显示在100nm才能看到微弱的结合。#：没有检测。因结合活性很弱，未检测到blocking活性。上述结果表明，由本发明鼠源抗体mab23序列得到的上述人源化抗体分子保留了和hlag-3的结合活性，更佳地，很多分子恢复到和鼠源抗体mab23c同样的结合活性，其中ab2315、ab2317、ab2322、ab2325等抗体的结合活性，和ab23c没有差别。即本发明人源化优选抗体保留了之前鼠源抗体的结合活性。此外，除了结合活性很弱(nb)的抗体之外，大部分人源化抗体blocking活性较好，和ab23c接近，比如ab2314、ab2316、ab2317、ab2318、ab2320、ab2325等。表8部分优选人源化抗体的轻、重链氨基酸(包括恒定区)序列如下。人源化ab2315抗体氨基酸序列：轻链：diqmtqspsslsasvgdrvtitcrasqdigsslnwlqqkpgkaikrliyatssldsgvpsrfsgsgsgtdytltisslqpedfatyyclqyvtspltfgggtkveikrtvaapsvfifppsdeqlksgtasvvcllnnfypreakvqwkvdnalqsgnsqesvteqdskdstyslsstltlskadyekhkvyacevthqglsspvtksfnrgec(seqidno:38)重链：同ab2317重链(seqidno:40)人源化ab2317抗体氨基酸序列：轻链：diqmtqspsslsasvgdrvtitcrasqdigsslnwyqqkpgkapkrliyatssldsgvpsrfsgsrsgsdftltisslqpedfatyyclqyvtspltfgggtkveikrtvaapsvfifppsdeqlksgtasvvcllnnfypreakvqwkvdnalqsgnsqesvteqdskdstyslsstltlskadyekhkvyacevthqglsspvtksfnrgec(seqidno:39)重链：qvqlvqsgaevkkpgasvkvsckasgytftdyemhwvkqapgqglewiggidpetegiaynqkfrgratltadkststaymelrslrsddtavyyctnsnyyggreawfaywgqgtlvtvssastkgpsvfplapcsrstsestaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtktytcnvdhkpsntkvdkrveskygppcppcpapeflggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvsqedpevqfnwyvdgvevhnaktkpreeqfnstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkglpssiektiskakgqprepqvytlppsqeemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflysrltvdksrwqegnvfscsvmhealhnhytqkslslslgk(seqidno:40)人源化ab2325抗体氨基酸序列：轻链：同ab2317轻链(seqidno:39)重链：qvqlvqsgaevkkpgasvkvsckasgytftdyemhwvkqapgqglewmggidpetegiaynqkfrgratmttdtststaymelrslrsddtavyycansnyyggreawfaywgqgtlvtvssastkgpsvfplapcsrstsestaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtktytcnvdhkpsntkvdkrveskygppcppcpapeflggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvsqedpevqfnwyvdgvevhnaktkpreeqfnstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkglpssiektiskakgqprepqvytlppsqeemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflysrltvdksrwqegnvfscsvmhealhnhytqkslslslgk(seqidno:41)实施例8：本发明人源化抗人lag-3抗体，优选抗体结合活性综合评价为了进一步评估本发明人源化抗体和lag-3结合活性，以上述优选人源化优选抗体ab2317为例，评价其和不同形式，不同种属lag3结合活性，以及baicore方法评估其亲和力，结果见表9。biacore方法如下：用biacoret200，gehealthcare仪器测定本发明抗体和人lag-3的亲和力。用ph7.4的运行缓冲液hbs-ep+(10mmhepes,150mmnacl,3mmedta和0.05％的p20)，先将proteina(thermopierce,cat#21181)偶联到生物传感芯片cm5(cat.#br-1005-30，ge)上,将芯片用新配制的50mmnhs(n-hydroxysuccinimide)和200mmedc(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimidehydrochloride)激活,然后注入ph4.010mmnaac配制的10μg/ml的proteina。待测抗浓度为5μg/ml，抗原lag-3-his浓度梯度0nm、1.875nm、3.75nm、7.5nm、15nm和30nm，流速30μl/分钟，结合时间180秒，解离时间300秒。实验后，用10mmglycine-hcl，ph1.5，30μl/min,30s清洗芯片。实验数据用biacoret200evaluationversion3.0(ge)软件以1:1langmuir模型进行拟合，得出亲和力数值kd。表9本发明抗体和lag-3结合活性(ec50，nm)、亲和力(biacore)综合评价上述结果表明本发明鼠源抗体人源化优选抗体(ab2317、ab2325等)和人lag-3-his(单体)、人lag3-hfc(二聚体)、人lag-3细胞外loop1和loop2(hlag-3-d12)的his形式(单体)，即hlag-3-d12-his(单体)以及hlag-3-d12-hfc(二聚体)形式、hlag3+细胞都有很好的结合。bicore检测结果表明，ab2317和ab2325的亲和力均在0.2nm以下，和对照分子亲和力接近。ab2317、ab2325和对照阳性抗体(ref)相比，突出的优点是其blocking活性好(平行assay比较结果，ab2317的blocking活性至少比ref好2倍以上，2.7nmvs8.2nm)，这和mab23c优于ref的blocking活性结果(图1，b)一致。不仅如此，上述数据表明，本发明抗体结合hlag3的第1、2区域(hlag-3-d12)，说明本发明抗体的blocking活性是阻止hlag3的d12区域和mhcii(daudi细胞)的结合。筛选出具有这样特异blocking活性的抗体是很难获取的事情，特别是blocking活性很好，比目前本领域临床上的分子(ref)blocking活性还好2倍以上就更加困难，是不可预料的事情。这一特异blocking活性和该抗体用于临床治疗肿瘤患者药效相关，blocking活性好，预期药效会更好。此外本发明抗体，例如ab2317的另一意想不到的优点是其表达产量很高，在本发明条件下达到量在100mg/l以上，而平行、同等条件下，对照抗体ref的表达量仅达60mg/l。多次比对的平均表达产量，ab2317比对照抗体ref高60％以上。这说明本发明抗体表达量优于对照分子(这种表达量的不同是和序列相关的)，这为本发明抗体用于后期工艺开发提高抗体产量带来了优势。将本发明抗体ab2317配制成1mg/l浓度，pbs溶液，45℃保存0天、7天、14天后，用凝胶电泳对样品进行稳定性评价。结果见图2，左起，m为分子量标记。泳道1、2；3、4；5、6分别为ab2317在45℃保存0天、7天、14天后的样品非变性和变性电泳。泳道7、8；9、10；11、12分别为平行条件下ref在45℃保存0天、7天、14天后的样品非变性和变性电泳。电泳结果表明，本发明抗体ab2317在45℃保存7天、14天后不管是非变性还是变性的样品，浓度都没有改变，说明没有任何降价。而对照样品ref则显示样品减少(凝胶上变少)，比如14天(泳道11、12)样品比0天明显变少了，说明有显著降解。该结果很好说明本发明抗体ab2317优良的稳定性特点。这一特点为其作为药物开发，特别是制剂处方开发带来非常好的便利和优势。本发明人源化抗体例如ab2317、ab2325和对照抗体(ref)一样，均能与食蟹猴lag-3(cynomolgus，cyno-lag3-hfc，购自北京百普赛斯生物科技有限公司，目录号la3-c5252)结合，结合活性分别为40.2nm、44.5nm、35.3nm。这一结合活性与人lag-3的结合相比，结合活性弱200倍以上。这和biacore检测本发明抗体同cyno-lag3-hfc亲和力结果一致。ref亲和力为836nm(比同人lag-3亲和力弱了4000倍以上)；ab2317、ab2325则在biacore未检测到和cyno-lag-3-hfc的结合。此外，上述抗体也都不和鼠lag-3结合。本发明以抗体lg2317为代表，通过以下实验进行细胞功能评价。实施例9：抗lag-3抗体激活人t细胞功能活性评价实验当天，收集人pbmc(由健康志愿者捐献外周血液中分离)，用含10％fbs的rpmi1640培养基重悬细胞并计数，调整细胞密度为1×106cell/ml，加入96孔板，85μl/孔，放入培养箱。用培养基配制超抗原(seb，购自北京康博贝宁科技有限公司)，使初始浓度为2μg/ml，每孔加入5μl(使终浓度为100ng/ml)。用培养基按比例配制待测样品，包括阴性抗体，对照抗体。每孔加入10μl，使待测抗体在100μl体系中的浓度为需要的浓度梯度。细胞培养板置于37℃、5％co2培养箱孵育3天后，取出细胞培养板，3000rpm离心10min，每孔取出80μl上清进行人il-2的检测。il-2elisa检测按照试剂盒(深圳欣博盛生物科技有限公司，cat:ehc003.96)说明书进行操作，步骤如下:a.将取出的细胞培养上清以25倍(不同次实验稀释倍数有不同)稀释后加入酶标板中(100μl/孔)；标准品用标本通用稀释液稀释成不同浓度梯度：1000pg/ml、500pg/ml、250pg/ml、125pg/ml、62.5pg/ml、31.25pg/ml、15.625pg/ml，每孔加100μl；空白孔加标本通用稀释液。b.封板胶纸封住反应孔，37℃，孵育90分钟。c.洗板5次，每次3分钟，每孔加入100μl生物素抗体工作液，空白孔加生物素化抗体稀释液，新封板胶纸封住反应孔，37℃，孵育60分钟。d.洗板5次，每次3分钟，每孔加入100μl酶结合工作液，空白孔加酶结合稀释液，新封板胶纸封住反应孔，37℃，避光孵育30分钟。e.洗板5次，每次3分钟，每孔加入100μl显色底物tmb，37℃，避光孵育15分钟f.加入终止液，100μl/孔，混匀后，3分钟内，酶标仪读od450。g.结果分析：计算il-2值，并和空白对照相比，换算成增加百分比(％)来评估样品激活人t细胞活性。结果表明，不同供体t细胞实验均显示本发明优选抗体ab2317激活人t细胞释放il-2的活性ec50为0.34μg/ml。同条件下比对实验对照抗体ref的ec50为1.4μg/ml。即本发明抗体比对照ref在t细胞上的活性至少优3倍以上。图3的a显示代表数据之一。实施例10本发明抗lag-3抗体单独和联合pd-1抗体在混合淋巴细胞反应(mlrassay)中的活性检测用混合淋巴细胞反应(mixedlymphocytereaction,mlrassay)检测inf-γ(infg)分泌的方法来评估本发明系列抗体在激活人t细胞的活性。即由本发明分离的人血细胞pbmc(由健康志愿者捐献外周血液中分离)诱导得到树突细胞(dc)，用得到的dc刺激来自不同志愿者的t细胞。具体地，树突细胞(dc)培养：在实验第1天，用rpmi1640培养基，接种pbmc于6孔板，每孔2ml，1×106/ml，37℃、5％co2培养箱培养2小时后，轻轻吸出悬浮细胞，向贴壁细胞中加入2ml完全rpmi1640培养基(包含10％fbs，100ng/mlgm-csf，peprotech，cat#:300-03，和100ng/mlil-4，peprotech，cat#:200-04)，继续培养2天后，每孔补加1ml新鲜的完全rpmi1640培养基。第5天，每孔补加3μl100μg/ml的tnf-α，使终浓度为100ng/ml(tnf-α购自peprotech，cat#:af-300-01a)，继续培养2天，所得树突细胞(dc)用于如下实验。dc刺激t细胞(mlr)assay：用10ng/mlanti-cd3抗体(miltenylbiotec，cat#:130-093-387)，按100μl/孔包被96孔细胞培养板，37℃孵育2小时，用pbs洗一遍。收集上述培养第7天的dc细胞，离心，重悬于10％fbs的rpmi1640培养基，计数，配成5×104cell/ml，按90μl/孔加入上述anti-cd3包被好的96-孔板中。取来自不同志愿者的pbmc细胞，计数，配成5×105cell/ml，按90μl/孔加入上述anti-cd3包被并铺有dc细胞的96-孔板中。用pbs按比例配制待测样品，包括对照抗体(ref)和ab2317，pd-1抗体(本发明表达纯化得到)加入上述96孔板中。ref或者ab2317+pd-1抗体各10μl/孔。pd-1抗体在200μl体系中终浓度为0.5μg/ml。待测抗体(ref或ab2317)在200μl体系中的浓度为需要的浓度梯度。对照组＝90μlpbmc细胞+90μldc+20μlpbs。细胞培养板置于37℃，5％co2培养箱孵育4天后，取出细胞培养板，3000rpm离心10min，每孔取出150μl上清进行人inf-γ的检测。inf-γelisa检测，按照试剂盒(上海欣奥盛生物科技有限公司cat:ehc102g.96)说明书进行操作，步骤如下：h.将取出的细胞培养上清加入酶标板中(100μl/孔)；标准品用标本通用稀释液稀释成不同浓度梯度：1000pg/ml、500pg/ml、250pg/ml、125pg/ml、62.5pg/ml、31.25pg/ml、15.625pg/ml，每孔加100μl；空白孔加标本通用稀释液。i.封板胶纸封住反应孔，37℃，孵育90分钟。j.洗板5次，每次3分钟，每孔加入100μl生物素抗体工作液，空白孔加生物素化抗体稀释液，新封板胶纸封住反应孔，37℃，孵育60分钟。k.洗板5次，每次3分钟，每孔加入100μl酶结合工作液，空白孔加酶结合稀释液，新封板胶纸封住反应孔，37℃，避光孵育30分钟。l.洗板5次，每次3分钟，每孔加入100μl显色底物tmb，37℃，避光孵育15分钟m.加入终止液，100μl/孔，混匀后，3分钟内，酶标仪读od450。n.结果分析：通过标准曲线公式，计算inf-γ值(pg)，来评估本发明抗体的活性。图3b结果表明，本发明抗体ab2317激活dc刺激t细胞活性(和pd-1抗体keytruda联用)ec50为0.21nm比同样条件下ref(ec50为0.61nm)强2倍以上。实施例11:本发明lag-3抗体体内药效评价用人pd-1和lag-3双转基因小鼠(c57bl/6-hpd1/hlag3)建立动物药效模型，评价本发明lag-3抗体动物体内药效。双转基因小鼠购自江苏集萃药康生物科技有限公司，生产许可证编号：scxk(苏)2018-0008。mc38细胞(购自中科院细胞所)培养于含10％胎牛血清(上海博升生物科技有限公司，货号：bs-0002-500)，1％hepes(赛默飞世尔科技有限公司，货号：15630080)的dmem/高糖培养基中(上海源培生物科技股份有限公司，货号：l110kj)，在含5％co2的37℃的细胞培养箱中连续培养。c57bl/6-hpd1/hlag3雌性小鼠，6周龄，5只/笼饲养于spf级环境，温度20-25℃；湿度40％-60％，自由进食进水，定期更换垫料。待mc38细胞长至对数生长期(汇合率在80％-90％)时，用0.25％胰酶消化，收集细胞，并用无血清的dmem/高糖培养基洗涤细胞两次，后用无血清的dmem/高糖培养基重悬，计数，用matrigel(碧迪医疗器械(上海)有限公司，货号：354234)与dmem/高糖培养基按1:1的比例混合，调整细胞浓度为1×107细胞/ml用于接种。接种mc38细胞悬液100μl(106个)于小鼠右肋部皮下，挑选肿瘤细胞长至体积约100-150mm3大小后随机分组，每组5只。待测样品用pbs配制，无菌。blank组为pbs。pd-1抗体(据keytruda公开序列克隆表达)为单独用药对照组。pd-1抗体+ref为联合用药对照组。pd-1抗体+ab2317为联合用药待测组。给药方式为腹腔注射。pd-1抗体单独或联合给药，剂量均为10μg/100μl/只。联合给药组中，ref和ab2317药剂量为120μg/100μl/只。给药频率2次/周。各注射样品当天为第0天。每次给药前测量体重，肿瘤体积，记录数据。本次实验给药4次。肿瘤大小计算公式：肿瘤体积tv(mm3)＝0.5×(肿瘤长径×肿瘤短径2)；相对肿瘤增长率(t/c％)＝100％*(t-t0)/(c-c0)；抑瘤率(tgi)＝(1-t/c)*100％；其中t0、t分别为样品组实验开始时及实验结束时的肿瘤体积；c0、c分别为对照组实验开始时及实验结束时的肿瘤体积。结果见图4和表9b。表9b本发明lag-3抗体体内药效评价图4结果表明，本发明抗体和pd-1抗体联用在第13天开始，抑瘤率达到了100％，并且肿瘤比开始时候缩小，保持到实验结束。明显优于ref+pd-1抗体组，和pd-1单独抗体组。表9b是第0天和第23天肿瘤体积的统计结果。结果表明，第23天，和pbs组比较，pd-1抗体+本发明抗体ab2317联合组的药效(抑制率)为103％，即100％抑制了肿瘤生长并且肿瘤比开始时候缩小了。优于pd-1抗体单独药效(抑制率)为63％，也优于pd-1抗体+ref联合组的药效(抑制率为)80％。统计分析(ttest)结果表明，pd-1抗体单独药效和pbs组p值为0.06，未达到统计学显著差异水平。pd-1抗体+ref联用药效和pbs组p值为0.01，达到显著差异水平(标记为*)。意想不到的是，pd-1抗体+本发明抗体ab2317联用药效和pbs组p值为0.001，达到极显著差异水平(标记为**)。更加意想不到的是，pd-1抗体+本发明抗体ab2317联用药效和pd-1抗体+ref联用组统计分析，p值为0.04，达到显著差异水平(p<0.05，标记为*)。本实验各组实验期间，动物体重都没有明显的变化，表明本发明抗体没有显著的毒性作用。实施例12:针对lag-3靶点的双特异性抗体设计用上述发现的抗lag-3抗体，本发明进行了多种双特异性抗体的设计。所设计的双特异性抗体的通式如下。表10基于本发明抗lag-3抗体进行的双特异设计(通式1)表10及本文中，含轻链的序列指该序列除了包括轻链序列以外，还可以包括与轻链序列连接的scfv；含重链的序列指该序列除了包括重链序列以外，还可以包括与重链序列连接的scfv。其中，t1代表针对靶点1(比如lag3)的第一蛋白功能区，t2代表针对靶点2(非lag3)的第二蛋白功能区。t1(scfv)代表针对靶点1抗体的scfv序列；t2(scfv)代表针对靶点2的scfv序列。(scfv)n1、(scfv)n2、(scfv)n3、(scfv)n4中的n1、n2、n3、n4分别为自然数，可以是0、1、2、3等，在本发明的具体实施例中，n1、n2、n3，n4中其中至少1个数值为1，其余为0。vl，代表针对靶点1或者2的抗体轻链可变区序列；vh，代表针对靶点1或者2的抗体重链可变区序列。lc，代表轻链(κ或者λ)的恒定区序列，优选人轻链恒定区序列；hc代表重链，包括igg1、igg2、igg3、igg4等的恒定区序列(缩写为hc-igg1、hc-igg2、hc-igg3、hc-igg4)，优选人的重链恒定区序列(hc-higg)。重链恒定区c末端连接scfv或其它蛋白序列的时候，其c末端末位氨基酸k可以突变，优选突变为a。由此，在方案1中，t1为免疫球蛋白，t2为scfv；在方案2中，t2为免疫球蛋白，t1为scfv；scfv针对的靶点相同；在方案3、4中，两端的scfv针对两个不同的靶点。当表10中所述scfv为轻链可变区-连接子-重链可变区，其轻链可变区n末端或重链可变区c末端通过连接子相应地连接在所述的免疫球蛋白轻链和/或重链的c末端或n末端；或所述scfv为重链可变区-连接子-轻链可变区，其重链可变区n末端或者轻链可变区c末端通过连接子相应地连接在所述的免疫球蛋白轻链和/或重链的c末端或n末端。需说明的是，当上述scfv为轻链可变区-连接子-重链可变区时，其连接方式为轻链可变区的c末端与连接子连接，所述连接子再与重链可变区的n末端连接，从而将scfv轻链可变区的n末端和重链可变区的c末端暴露出来，使其可以通过连接子与免疫球蛋白的轻链和或重链连接。在本发明中，当其连接免疫球蛋白的轻链时，在一些具体的实施例中优选地使用scfv的重链可变区的c末端通过连接子与免疫球蛋白重链的n末端连接；当其连接免疫球蛋白的重链时，在一些具体的实施例中优选地使用scfv的轻链可变区的n末端与免疫球蛋白重链的c末端连接。当所述scfv为重链可变区-连接子-轻链可变区时，其连接方式为轻链可变区的n末端与连接子连接，所述连接子再与重链可变区的c末端连接，从而将scfv轻链可变区的c末端和重链可变区的n末端暴露出来，使其可以通过连接子与免疫球蛋白的轻链和/或重链连接。在此情况下，当其连接免疫球蛋白的轻链时，在一些具体的实施例中优选地使用scfv的轻链可变区的c末端与免疫球蛋白重链的n末端连接；当其连接免疫球蛋白的重链时，在一些具体的实施例中优选地使用scfv的重链可变区的n末端与免疫球蛋白重链的c末端连接。所述连接子为(gly-gly-gly-gly-ser)w[缩写为(g4s)w]所述的w优选为0～10之间的整数。优选地，所述连接子为(g4s)3，和/或，所述scfv的数量为一对，对称地连接在所述的免疫球蛋白轻链和/或重链。此外，本发明抗体也可用不同于通式1的方式，例如如下通式2。表11基于本发明抗lag3抗体进行dvd形式的双特异设计(通式2)表11中，t1、t2分别代表针对靶点1(例如lag3)和靶点2(非lag3)。含轻链的序列指该序列除了包括正常完整的轻链序列以外，还包括另一个轻链可变区序列。含重链的序列指该序列除了包括正常完整的重链序列以外，还包括另一个重链可变区序列。轻链可变区和完整的轻链之间、重链可变区和完整的重链之间通过连接子(linker)连接。上述双特异设计涉及的各个靶点抗体序列，除了本发明所述anti-lag3抗体序列外，pd1抗体序列包括已经公开的抗体序列，包括抗pd-1抗体nivolumab/opdivo(简称nivo)、pembrolizumab/keytruda(简称pem)。除了专利中公开的序列外，nivolumab(nivo)、pembrolizumab(pem)等序列也都能从www.drugbank.ca等公开资源查到。这些单独抗体表达编号和序列见下表。表12本发明克隆表达的单克隆抗体编号、轻重链序列及说明其中nivolumab和pembrolizumab的序列可以从www.drugbank.ca等公开信息得到，本发明将其编号如下所示：nivovl-lc(κ链)：seqidno:42；nivovh-hc(higg4)：seqidno:43；pemvl-lc(κ链)：seqidno:44；pemvh-hc(higg4)：seqidno:45；ab835vl为申请号201810917684.x中的seqidno:58；ab385vh为申请号201810917684.x中的seqidno:59。实施例13针对lag-3和pd-1双靶点的双特异性抗体设计和活性评价本发明针对lag-3和pd1两个靶点设计了不同序列结构的双特异性抗体，见下表。表13针对lag-3和pd1双靶点设计的双特异性抗体*:κ链表示轻链为人igg的κ型轻链恒定区。#：igg4的c末端连接连接子的时候，其最末端氨基酸k突变为a。本发明申请中，在重链c末端引入scfv的本发明所设计的sbody，均将最末端k突变为a。按本发明克隆表达纯化方法，分别克隆表达、纯化上述双特异性抗体，用前述实施例方法分别检测这些设计的双特异分子和人lag-3以及pd-1的结合活性，结果如下表。表14针对lag-3和pd-1双靶点设计的双特异性抗体的结合活性评价#：括号里面的数值为同实验条件下，同靶点对应的单克隆抗体的结合活性ec50。*：同样实验条件下，双特异性抗体和对应的单克隆抗体的结合活性ec50的比值。比值越大，说明所设计的双特抗体对单靶点的结合力减弱越多，比如比值为2，则说明所设计的双特异性抗体对靶点结合活性和对应的单克隆抗体相比减弱了1倍。比值在2以内(实验误差范围)，说明结合活性没有受到影响。上表中结果表明，lb2373vslb2371表明同样的本发明ab2317scfv和不同的pd-1抗体以同样的结构(scfv均在pd-1抗体重链的n末端)设计的双特异性抗体，lb2373对pd-1的结合活性影响大(ec50改变倍数为2.92，见图5a、5c)，对lag3的结合活性则基本没有影响。而lb2371对pd-1和lag3的活性均没有影响(图5c)。比较lb2373vslb2374、lb2371vslb2372，数据表明(见图5a、5b、5c、5d)，同样的ab2317scfv序列和同样的pd-1抗体序列设计成的双特异性抗体，ab2317scfv位置不同(n末端vsc末端)，对pd-1和lag3的结合活性也不同。lb2371和双靶点的结合活性最好。lb2383vslb2384显示ab2325scfv在nivo重链n末端(lb2383)活性优于c末端(lb2384)。比较lb2371-lb2374和lb211、lb152、lb234、lb203的活性，发现在lag-3抗体scfv的不同(ab2317scfvvsab835scfv)的前提下，同样的pd-1抗(nivoorpem)的同样结构(重链的n-末端，或c-末端)，由ab2317scfv所设计的sbody比ab835scfv设计的sbody活性要好很多。特别意想不到的是，lb2374和lb234为同样的sbody设计结构，pd-1抗体序列(nivo)也相同，只是ab2317scfvvsab835scfv的不同。结果lb2317几乎很好保留了对lag-3和pd-1的结合活性，而lb234几乎失去了和lag-3的结合活性(减弱了175倍)。根据这些数据，非常意外地发现，本发明抗体ab2317scfv设计的sbody的活性是序列特异的。比较lb2379-lb2382和lb202、lb201、lb214、lb216针对双靶点(pd-1和lag-3)的结合数据，在同样结构中，lag-3抗体序列(scfv)不同，lb2379-lb2382活性优于对应的lb202、lb201、lb214、lb216。这些基于序列特异而表现出意料之外活性差别的分子设计，其分子结构类似常规igg，本发明称之为sequence-basedigglikebispecificantibodyformat(sbody)，即序列特异的igg结构相似的双特异性抗体。以lb2374为代表，用biacore(方法同实施例子8)对本发明双特异性抗体亲和力进行分析。lb2374对lag-3亲和力数据为：ka(1/ms)＝2.21e+6；kd(1/s)＝4.13e-4；kd(m)＝1.87e-10(和表9数据ab2317的亲和力1.68e-10非常接近)。对pd-1的亲和力数据为：ka(1/ms)＝2.098e+5；kd(1/s)＝1.41e-3；kd(m)＝6.71e-9(这和nivo单独测得的亲和力8.59e-9接近)。该数据表明，本发明双特异性抗体lb2374保留了对双靶点同样的亲和力(kd)。为了评估本发明设计的双特异性抗体(sbody)对两个靶点同时结合活性，用双夹心elisa对lb2374、lb2371活性进行了评估。具体地，用ph7.4的pbs缓冲液将pd-1(本发明表达)稀释至1μg/ml浓度，以50μl/孔的体积加入96孔酶标板(corning，cls3590-100ea)中，于37℃孵育2小时。弃去液体后，加入用pbs稀释的5％脱脂牛奶(上海生工生物工程有限公司，a600669-0250)封闭液200μl/孔，4℃放置过夜(16-18小时)进行封闭。弃去封闭液，并用pbst缓冲液(ph7.4pbs含0.05％tween-20)洗板5次后，加入待测双特异性抗体(10μg/ml)起始，用1％bsa5倍连续稀释，50μl/孔，37℃孵育1小时，pbst洗板5次后，加入50μl/孔1μg/ml的bio-lag3-his(acrobiosystems，tm-h5229，biotin标记)，37℃孵育1小时，pbst洗板5次后，加入50μl/孔1:1000稀释的streptavidin-hrp二抗(南京金斯瑞生物科技有限公司，m00091)，37℃孵育1小时。用pbst洗板5次后，加入50μl/孔tmb显色底物(kpl，52-00-03)，室温孵育5-10min，加入50μl/孔1mh2so4终止反应，用multiskango酶标仪(thermofisher，51119200)在450nm处读取吸收值，根据od值计算ec50。用ph7.4的pbs缓冲液将lag3-his稀释至1μg/ml，以50μl/孔的体积加入96孔酶标板中，于37℃孵育2小时。弃去液体后，加入用pbs稀释的5％脱脂牛奶封闭液200μl/孔，4℃放置过夜(16-18小时)进行封闭。弃去封闭液，并用pbst缓冲液(ph7.4pbs含0.05％tween-20)洗板5次后，加入待测双特异性抗体样品(10μg/ml起始)，用1％bsa5倍连续稀释，50μl/孔，37℃孵育1小时，pbst洗板5次后，加入50μl/孔10μg/ml的bio-pd-1-his(本发明表达后，biotin标记)，37℃孵育1小时，pbst洗板5次后，加入50μl/孔1：1000稀释的streptavidin-hrp二抗，37℃孵育1小时。用pbst洗板5次后，加入50μl/孔tmb显色底物，室温孵育5-10min，加入50μl/孔1mh2so4终止反应，用multiskango酶标仪在450nm处读取吸收值，根据od值计算ec50。结果见下表。表14a针对lag-3和pd-1双靶点设计的双特异性抗体双夹心elisa上述结果表明，本发明双特异性抗体sbody在结合双靶点其中之一以后，能进一步结合另一靶点，即其能同时结合两个靶点。将上述保留了双靶点活性的sbody分别针对两个靶点进行功能(阻止抗原和受体结合实验)评估，结果见下表。表15针对lag3和pd-1双靶点设计的双特异性抗体功能活性评价#：括号里面的数值为同实验条件下，同靶点对应的单克隆抗体阻断抗原和配体结合活性ic50。*：ic50改变倍数，即双特异性抗体和对应的单克隆抗体(对照抗体)的ic50的比值。比值越大，说明所设计的双特抗体对单靶点的功能活性减弱越多，比如比值为2，则说明所设计的双特异性抗体对靶点功能活性和对应的单克隆抗体相比减弱了1倍。比值在2以内为实验误差范围，即活性没有受到影响。nd：该分子没有检测到阻止lag3和daudi细胞结合活性。上述功能活性结果表明，本发明设计的双特异性抗体(sbody)保留了阻止pd-1和pd-l1的结合的活性，仅lb2373阻止pd-1/pd-l1结合活性稍弱(改变倍数3.78)。lb2379、lb2380、lb2371和lb2372阻止lag-3和daudi细胞的结合活性减弱比较多(分别为8.16、3.78、7.92和5.63倍)，而lb2373、lb2374几乎没有减弱(分别为0.82、1.98倍)。这也表明，在同样结构下，pd-1抗体序列的不同(lb2373、lb2374为pem；lb2371、lb2372为nivo)对功能活性影响显著不同，即本发明设计的sbody是序列特异的。综合对两个靶点功能活性结果，lb2374最优，其对两个靶点的功能活性(阻止抗原与受体结合)影响最小。为评估本发明双特异性抗体稳定性，将本发明抗体配置成1mg/ml在pbs(ph7.4)中，37℃孵育5天(d5)、10天(d10)的样品和-80℃保存60天的样品进行活性比较，评估稳定性。结果见下表。表16针对lag3和pd-1双靶点设计的双特异性抗体(sbody)稳定性评价#：为该样品在-80℃条件下保存后取出，在相同条件下检测到的的活性值；*：相对于-80℃保存样品活性(括号内数值)改变倍数。d5、d10分别代表37℃孵育第5天、第10天的样品。上述结果表明，本发明设计双特异分子lb2371、lb2374在37℃保存5天、10天，对双靶点的结合活性和-80℃保存60天的样品的结合活性一样，即结合活性没有改变(ec50差别均在2倍以内)。说明这些分子稳定。此外，这些样品凝聚电泳(page)分析，变性和非变性条件下均没有发现降解现象。也说明这些双特异分子结构稳定。表17针对lag3和pd-1双靶点设计的双特异性抗体表达水平评价上述结果表明，本发明设计针对lag3和pd1双特抗体(sbody)表达产量差别很大。非常意外地，lb2373、lb2374、lb2379、lb2380表达量均比较高。以ab835为scfv设计的sbody的表达量比同样设计的ab2317scfv的sbody表达量低很多，低65倍以上的，比如lb2374vslb234；低140倍以上，比如lb2373vslb211。这些数据表明，本发明抗lag3抗体ab2317和pd1抗体设计的双特异性抗体sbody意想不到的效果不仅是其活性、功能、稳定性，而且表达量也是序列特异设计相关的。lb2371轻链氨基酸序列：seqidno:44；含重链的氨基酸序列：seqidno:46；lb2373轻链氨基酸序列：seqidno:42；含重链的氨基酸序列：seqidno:47；lb2374轻链氨基酸序列：seqidno:42lb2374含重链的氨基酸序列：seqidno:48qvqlvesgggvvqpgrslrldckasgitfsnsgmhwvrqapgkglewvaviwydgskryyadsvkgrftisrdnskntlflqmnslraedtavyycatnddywgqgtlvtvssastkgpsvfplapcsrstsestaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtktytcnvdhkpsntkvdkrveskygppcppcpapeflggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvsqedpevqfnwyvdgvevhnaktkpreeqfnstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkglpssiektiskakgqprepqvytlppsqeemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflysrltvdksrwqegnvfscsvmhealhnhytqkslslslgaggggsggggsggggsqvqlvqsgaevkkpgasvkvsckasgytftdyemhwvkqapgqglewiggidpetegiaynqkfrgratltadkststaymelrslrsddtavyyctnsnyyggreawfaywgqgtlvtvssggggsggggsggggsdiqmtqspsslsasvgdrvtitcrasqdigsslnwyqqkpgkapkrliyatssldsgvpsrfsgsrsgsdftltisslqpedfatyyclqyvtspltfgggtkveiklb2379含轻链的氨基酸序列：seqidno:49；重链氨基酸序列：seqidno:43；lb2380含轻链的氨基酸序列：seqidno:50；重链氨基酸序列：seqidno:43。实施例14:本发明lag-3抗体pk评价实验用c57bl/6cnc品系小鼠(购自浙江维通利华实验动物技术有限公司，生产许可证编号：scxk(浙)2018-0001)，雌性，8周龄，6只，20g左右，饲养环境：spf级。温度20-25℃；湿度40-60％。将c57bl/6cnc小鼠实验室环境饲养3天后随机分组，每组3只。将待测药物(本发明lag-3抗体ab2317和ref)背部皮下注射小鼠，注射体积200μl。给药剂量为20mg/kg/只。检测样品在注射小鼠后眼眶取血。时间点为0.5、1、2、4、7、24、31、48、56、72、96、120、144、168、192、216、240、264、288、312、336、360、384、408、432、456、480、504小时。所取血样离心，取上清，-20度保存，待测。等收集完血液样本后，用elisa检测各个时间点血液中样品的含量。用excel来分析pk数据并计算待测药物的t1/2，结果见下表。表18本发明抗体ab2317pk评价上述结果表明本发明抗体ab2317显示更好的pk特征，包括更长的t1/2(ab2317t1/2为202小时，ref为188.7小时)，更好的cmax等。实施例15:本发明针对lag3和pd-1双靶点设计的双特异性抗体(sbody)pk评价实验用c57bl/6cnc品系小鼠(购自浙江维通利华实验动物技术有限公司，生产许可证编号：scxk(浙)2018-0001)与人pd-1和人lag-3双转基因cb7bl/6小鼠(简写c57bl/6-dki，购自江苏集萃药康生物科技有限公司，生产许可证编号：scxk(苏)2018-0008)雌性，8周龄，各6只，20g左右，饲养环境：spf级。温度20-25℃，湿度40-60％。将这两品系小鼠实验室环境饲养3天后，各选状态良好的小鼠随机分组，每组3只。将待测药物ab2374背部皮下注射小鼠，注射体积200μl。给药剂量为20mg/kg/只。注射小鼠后眼眶取血。时间点为0，0.5、1、2、6、24、31、48、56、72、96、120、144、168、192、216、240、264、288、312、336、360、384、408、432小时。所取血样离心，取上清，-20℃保存，待测。等收集完血液样本后，用elisa检测各个时间点血液中样品的含量。具体地：pd-1检测方法：用pd-1蛋白铺96孔板(corning，货号3590)。牛奶封闭2小时，洗板后待用。用ab2374配制标准曲线，待测血清按比例稀释，加入处理好的96孔板。37℃反应1小时后洗板，加入稀释后酶标记抗体peroxidaseaffinipuregoatanti-humanigg(jackson，货号109-035-003)。半小时后洗板，加入tmb(surmodic，货号ttmb-1000-01)显色，并用硫酸终止，酶标仪测定od450。pd-1/lag-3(夹心elisa)检测方法：用pd-1蛋白铺96孔板(corning，货号3590)。牛奶封闭2小时，洗板后待用。用ab2374配制标准曲线，待测血清按比例稀释，加入处理好的96孔板。37℃反应1小时后洗板，加入固定浓度的生物素化lag-3蛋白，37℃反应1小时后洗板，加入稀释后的酶标记抗体streptavidin-hrp(genscript，货号m00091)。半小时后洗板，加入tmb(surmodic，货号ttmb-1000-01)显色，并用硫酸终止，酶标仪测定od450。用excel来分析pk数据并计算待测药物的t1/2，结果见下表。表19本发明双特异性抗体ab2374pk评价(pd-1检测结果)表20本发明抗体ab2374pk评价(pd-1/lag-3检测结果)夹心elisa检测的是结合pd-1后再结合lag-3分子的pk特征。表20结果表明，意外地，本发明双特异性抗体在c57bl/6小鼠体内夹心elisa检测到的pk特征(cmax、t1/2)和单独检测pd-1得到特征几乎一致。说明本发明双特异性抗体在小鼠体内稳定，没有发生scfv(lag-3)脱落的情况。而且该pk特征和单独ab2317抗体pk表征(表18)也接近。此外，本发明抗体在hpd-1/hlag-3双转基因小鼠(c57bl/6-dki)因为有特异的靶点结合，cmax、t1/2均有减少，意外地，用夹心elisa检测到的pk和单独pd-1检测到的pk特征一致，说明本发明双特异性抗体在有特异靶点结合的小鼠体内同样稳定，没有scfv脱落情况。按本发明实施例1的方法分别克隆表达、纯化上述dvd设计双特异性抗体，凝胶电泳(page)结果表明，这些抗体轻、重链均易出现linker间断裂现象。而以scfv的形式将一个靶点抗体连接在另一个靶点抗体的轻链或重链的n或c末端，通过筛选得到序列和设计优化的双特异性抗体，可以避免/减少linker间断裂(见前述实施例)，并且保留对双靶点的结合活性，体外功能活性，以及针对双靶点的体内药效。优选双特异性抗体(本发明称之为sbody)不仅稳定，而且因其类似常规igg结构，纯化工艺简单，这为后期开发过程中的工艺、纯化都提供了极大便捷。sequencelisting<110>上海健信生物医药科技有限公司<120>靶向lag-3的抗体和双特异性抗体及其用途<130>p19011013c<160>50<170>patentinversion3.5<210>1<211>500<212>dna<213>artificialsequence<220><223>鼠源mab23轻链可变区碱基<400>1gatgaggacccctgctcagattcttgggatcttgttgctcttgtttccaggtaccagatg60tgacattcagatgatccagtctccatcctccttatctgcctctctgggagaaagagtcag120tctcacttgtcgggcaagtcaggacattggtagtagtttaaactggcttcagcaggaacc180agatggaactatcaaacgcctgatctacgccacatccagtttagattctggtgtccccaa240aaggttcagtggcagtaggtctgggtcagattattctctcaccatcagcagccttgagtc300tgaagattttgtagactattactgtctacaatatgttacttctccgctcacgttcggtgc360tgggaccaagctggagctgaaacgggctgatgctgcaccaactgtatccatcttcccacc420atccagtgagcagttaacatctggaggtgcctcagtcgtgtgcttctgaacaactctacc480ccagagacatcaattccctg500<210>2<211>539<212>dna<213>artificialsequence<220><223>鼠源mab23重链可变区碱基<400>2gatgaaatggcagctgggtttttctcttcctcctgtcagtaattgcaggtgtccaatccc60aggttcaactgcagcagtctggggctgagctggtgaggcctggggcttcagtgacgctgt120cctgcaaggcttcgggctacacatttactgactatgaaatgcactgggtgaaacagacac180ctgtgcatggcctggaatggattggaggtattgatcctgaaactgaaggcattgcctata240atcagaagttcaggggcaaggccatactgactgcagacaaatcctccatcacagcctaca300tggagctccgcagcctgacatctgaggactctgccgtctattactgtacaaactccaatt360actacggtggaagggaggcctggtttgcttactggggccaagggactctggtcactgtct420ctggagccaaaacgacacccccatctgtctatccactggcccctggatctgctgcccaaa480ctaactccatggtgaccctgggatgcctggtcaagggctatacatagccattactcaaa539<210>3<211>107<212>prt<213>artificialsequence<220><223>鼠源mab23轻链可变区氨基酸<400>3aspileglnmetileglnserproserserleuseralaserleugly151015gluargvalserleuthrcysargalaserglnaspileglyserser202530leuasntrpleuglnglngluproaspglythrilelysargleuile354045tyralathrserserleuaspserglyvalprolysargphesergly505560serargserglyserasptyrserleuthrileserserleugluser65707580gluaspphevalasptyrtyrcysleuglntyrvalthrserproleu859095thrpheglyalaglythrlysleugluleulys100105<210>4<211>122<212>prt<213>artificialsequence<220><223>鼠源mab23重链可变区氨基酸<400>4glnvalglnleuglnglnserglyalagluleuvalargproglyala151015servalthrleusercyslysalaserglytyrthrphe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