具有胆固醇外流活性的抗动脉粥样硬化肽类似物及其应用的制作方法

本发明属于生物化学技术领域，具体涉及一种具有胆固醇外流活性的抗动脉粥样硬化肽类似物及其应用。

背景技术：

近年来胆固醇逆向转运（reversecholesteroltransport，rct）理论逐渐成熟，使得开发一种可以将外围胆固醇逆向转运至肝脏排出体外而达到降脂、抗动脉粥样硬化目的的药物成为研究热门，广义的rct理论是指肝外组织细胞内胆固醇，通过血液循环转运到肝内，在肝脏转化为胆汁酸排出体外的过程，包括胆固醇的流出、酯化、转运和消除。而狭义的rct通常仅指细胞内胆固醇跨细胞外向转运（或称胆固醇流出）。从肝脏合成分泌的载脂蛋白a-i（apoa-i）加载磷脂形成初级的hdl粒子（preβ-hdl），到preβ-hdl包载胆固醇酯形成成熟的hdl粒子（α-hdl），α-hdl转运胆固醇至肝脏，就形成了一次完整的rct循环，rct循环可以减轻动脉“负担”，防止过多的胆固醇在动脉内堆积而诱导一系列不良心血管事件的发生。hdl中主要行使rct功能的蛋白是载脂蛋白apoa-i，它由243个氨基酸组成，包含10段线性链接的α螺旋片段，均具有两亲性，和脂质有一定的亲和力。体内分离的apoa-i具有很好的降胆固醇作用和抗动脉粥样硬化作用，由于其体内分离或人工合成成本高，分子量较大，稳定性差，所以难以成药，然而其功能是能够被更短的载脂蛋白apoa-i模拟肽所模拟或增强的。apoa-i模拟肽与apoa-i一样可以特异性地通过abc类转运体促进外围细胞内胆固醇的流出，可以与hdl结合共同携带并转运胆固醇，也可以与α-hdl结合后对其“减负”，剥离并辅助转运胆固醇，将α-hdl“重塑”为preβ-hdl，而preβ-hdl相对于α-hdl有更强的胆固醇携带能力，这样apoa-i模拟肽的加入就增强了体内hdl携带和转运胆固醇效率。

最早的4f由fogelman等首先设计由18个氨基酸组成的apoa-i模拟肽18a改造而成，其全右旋氨基酸类似物d-4f和全反向序列reverse-4f均有较好的胆固醇外流活性。但由于d-4f只在动物体内有明显的改善增厚内膜尺寸作用，而在人体内作用不明显，且可能有肠道靶向性而没有通过临床试验。18a的二聚体系列也有很好的促胆固醇外流效果，但序列过长。目前有课题组以apoa-i的第1-10段螺旋的特点设计的一条apoa-i模拟肽apoa-iconsensus，衍生出许多apoa-i模拟肽，比如etc-642就是一条经典的由其改造的有胆固醇外流活性的apoa-i模拟肽，已上临床试验。另外，还有以apoa-i的第10条螺旋a10为母肽改造的apoa-i模拟肽，以apoa-i的196-219段序列改造的famp5都有很好的促胆固醇外流活性。elk系列用脯氨酸串联的两段apoa-i模拟肽，其活性相比单条会进一步提高，但这些尚在研究中。有趣的是，另外还有课题组以聚脯氨酸的三棱柱刚性螺旋结构为支架，两条棱在吡咯环4位接苯环构成疏水面，另一条棱接入糖基构成亲水面，得到了完全不同的apoa-i模拟肽，也有很好的胆固醇外流活性。

技术实现要素：

本发明的目的之一是提供一类新型结构的具有胆固醇外流活性的抗动脉粥样硬化肽。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

具有胆固醇外流活性的抗动脉粥样硬化肽类似物，氨基酸序列通式如下所示：

x1x2y3z4x5z6y7x8x9y10z11x12z13y14x15x16z17z18x19x20，

其中x选自疏水性氨基酸，y选自带负电荷氨基酸或不带电荷的亲水性氨基酸，z选自带正电荷的氨基酸或不带电荷的亲水性氨基酸，数字代表氨基酸从n端开始的序列位置。

所述肽的氨基酸序列通式中，x选自丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、甲硫氨酸、酪氨酸或其衍生物中的一种或几种，y选自谷氨酸、天冬氨酸、丝氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺或其衍生物中的一种或几种，z选自组氨酸、赖氨酸、精氨酸、丝氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺或其衍生物中的一种或几种。

所述肽的氨基酸序列通式中，x选自亮氨酸、缬氨酸和苯丙氨酸中的一种或几种，y为谷氨酸，z选自组氨酸、赖氨酸和苏氨酸中的一种或几种。

所述的具有胆固醇外流活性的抗动脉粥样硬化肽类似物选自下述化合物之一：

化合物1：vleklkelvehvkevvtkvl

化合物2：vleklkelvehlkelvtkvl

化合物3：vleklkellehlkelltkvl

化合物4：fleklkellehlkelltkll。

所述肽的类似物为通过化学链接子链接后构成的杂聚肽。

本发明的目的之二是提供上述具有胆固醇外流活性的抗动脉粥样硬化肽类似物在治疗高脂血症/动脉粥样硬化以及其他由高胆固醇血症引发的疾病中的应用。

本发明具有胆固醇外流活性的抗动脉粥样硬化肽类似物，是以人体载脂蛋白a-i（apoa-i）的第10段两亲性α螺旋肽段（221-240位）的亲水面进行序列替换，将亲疏水面交界处换为带正电荷氨基酸，亲水面中间位置换为带负电荷氨基酸，然后将亲水面序列固定不变，通过替换疏水面氨基酸逐渐增强其疏水性，得到一系列新的疏水性逐渐增大的apoa-i模拟肽，其序列为x1x2y3z4x5z6y7x8x9y10z11x12z13y14x15x16z17z18x19x20，其中x选自疏水性氨基酸，y选自带负电荷氨基酸或不带电荷的亲水性氨基酸，z选自带正电荷的氨基酸或不带电荷的亲水性氨基酸，数字代表氨基酸从n端开始的序列位置。

附图说明

图1母肽apoa-i221-240，p1-p17，l-4f在200μmol/l以内的胆固醇外流活性图（每个浓度作用12h）

图2母肽apoa-i221-240，p1-p17，l-4f的dmpc囊泡分散性能（90min以内）

图3为血脂,血清浊度炎症因子的测定结果。a-d是血清脂质测定结果。e是血清浊度的测定结果(od)at430nm。f-i血清炎症的测定结果。n代表正常组；m代表模型组；l-4f代表l-4f(10mg/kg)治疗组；pp代表母肽apoa-i221-240(10mg/kg)治疗组。p12-l和h代表低剂量组(10mg/kg)高剂量组(20mg/kg)治疗组。数据用均值±sem表示(n=10.nvsm:**p<0.01和***p<0.005.p12-l和hvsm:†p<0.05,††p<0.01和†††p<0.005。p12-lvsl-4f:‡p<0.05和‡‡p<0.01.p12-lvspp:§p<0.05,t-检验显著性误差)。

图4为组织病理切片结果（病理切片用he染色）。a是在apoe^-/-小鼠的动脉治疗效果(he染色，增厚部分用黄色线标出，总厚度用白色线标出)。b是apoe^-/-小鼠肝脏的治疗效果(he染色，脂滴空泡用单箭头标出)。d是动脉相对厚度和肝脏相对脂肪面积的统计结果。n代表正常组；m代表模型组；l-4f代表l-4f(10mg/kg)治疗组；pp代表母肽apoa-i221-240(10mg/kg)治疗组。p12-l和h代表低剂量组(10mg/kg)高剂量组(20mg/kg)治疗组。数据用均值±sem表示，数据用均值±sem表示(n=5nvsm:***p<0.005.p12-l和hvsm:†††p<0.005.p12-lvsl-4f:‡p<0.05.p12-lvspp:§§p<0.05,t-检验显著性误差)。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明做进一步说明。

实施例1：新型apoa-i模拟肽p1-p17的胆固醇外流活性测定

表1.p1-p17的序列及其疏水性

用raw264.7细胞，种植密度为4万/孔，种植与96孔板，加入22-nbd荧光胆固醇对细胞标记12h，加入p12诱导其流出12h，最后测定每孔细胞培养液和细胞裂解的荧光强度，计算胆固醇外流率，胆固醇外流率=培养液荧光强度/(培养液荧光强度+细胞裂解液荧光强度)。用l-4f做对照肽。

结果如附图1所示，在模拟肽0-200μmol/l范围内，p1-p5几乎没有活性，也没有剂量响应，随着疏水性增大，从p6开始模拟肽出现浓度依赖的胆固醇外流活性，疏水性进一步增大，从p13开始发生了破细胞膜毒性，在较高浓度时胆固醇突然释放。当模拟肽疏水性太低时无胆固醇外流活，疏水性太高就会产生细胞毒性。所以p6-p12就是无毒性，有胆固醇外流活性的apoa-i模拟肽。用l-4f做对照肽。

实施例2：新型apoa-i模拟肽p1-p17的脂质亲和力测定

脂质亲和力是apoa-i模拟肽与细胞膜磷脂，hdl上磷脂，胆固醇等结合能力的基础。二肉豆蔻磷脂酰胆碱(dmpc)是生物膜上常见的磷脂，将其用磷酸盐缓冲液配制成含微米级囊泡乳浊液，如果apoa-i模拟肽有脂质亲和力，它就可以将为含微米级囊泡的乳浊液分散为纳米级囊泡的透明溶液。可以通过测定乳浊液的吸光度随时间的变化来评判其脂质亲和力。

结果如附图2所示，p1-p8由于疏水性太小而无法将dmpc囊泡溶液变澄清，而p9-p11可以在10min之内将其变澄清，p12-p15可以缓慢地将其变澄清，如p12在90min内也可以将其变澄清。p12-p17使其变澄清的速度慢慢减小。说明疏水性太小模拟肽就没有脂质亲和力，疏水性增大，模拟肽就会拥有脂质亲和力；当疏水性增大到一定值后，随着疏水性的增大脂质亲和力也会越来越小。

实施例3：以新型apoa-i模拟肽p12为例研究其体内抗动脉粥样硬化效果

（一）实验材料与方法

1.小鼠的饲养分组及造模和给药情况

50只apoe^-/-小鼠和10只同系对照的c57雄鼠，雌雄各半，体重都在20±10g左右，购买于北京维通利华实验动物技术有限公司（生产证书号：scxk2016-0006）。在12h的昼夜/循环，温度为23±1℃，相对湿度为55±5%的条件下饲养。先用基础饲料适应性喂养一周，被随机分为6个组，每组10只小鼠，都是雌雄各半，分别为正常对照组（饲喂基础饲料，给与腹腔注射生理盐水），模型对照组（饲喂基础饲料，饲料配方为0.5%胆固醇，10%的脂肪，89.5%的基础饲料，给与腹腔注射生理盐水），l-4f治疗组（l-4f用生理盐水配成1mg/ml的浓度，以10mg/kg的剂量腹腔注射），apoa-i221-240治疗组（apoa-i221-240用生理盐水配成1mg/ml的浓度，以10mg/kg的剂量腹腔注射），p12治疗组（p12用生理盐水配成1mg/ml和2mg/kg的浓度，以10和20mg/kg的低，高剂量腹腔注射），造模4周后给药，共造模4个月，给药3个月，最后禁食不禁水12小时后，小鼠用乙醚麻醉，眼眶采静脉血，颈椎脱臼处死，取肝脏和带心脏的主动脉组织。

表2小鼠的饲养，分组，造模和给药情况表

2.小鼠血清和组织样品的制备

小鼠用麻醉后，眼眶采静脉血，不做抗凝处理，静置30min以上待血液凝固，于4℃，5000g离心10min，移液枪收集血清，按要测定的指标分批保存于-20℃，用时在4℃缓慢复溶后再测定各项指标。小鼠颈椎脱臼处死，取肝脏和带心脏的动脉组织，肝脏和动脉组织一部分浸泡于4%的多聚甲醛溶液中，固定过的组织用于石蜡切片和伊红苏木精（he）染色，

3.血清浊度的测定

动脉粥样硬化小鼠的血清由于血脂及脂蛋白还有各种炎症免疫蛋白的升高而在离心后呈乳浊液，而正常组为澄清透亮的无色或淡黄色液体。所以我们又用酶标仪在430nm波长立即测定血清浊度，来反应小鼠动脉粥样硬化的发展进程。

4.血脂，和血清炎症因子的测定

根据试剂盒说明测定了血清tc，tg，hdl-c，ldl-c，il-6，mcp-1和tnf-α。

5.病理切片的检查

小鼠的动脉和肝脏用he染色，观察病理结构的变化。

（二）实验结果

1.血清浊度和血脂测定结果

造模4个月完成后我们测定了所有小鼠的血清浊度和血脂，包括tc，tg，ldl-c和hdl-c。血清的浊度与血脂密切相关，也反映了动脉粥样硬化的进程，从附图3看，血清浊度与tc，tg，ldl-c有一定的关联，与正常组相比，造模后的apoe^-/-小鼠的血清浊度，tc，tg，ldl-c和hdl-c都明显升高，p12治疗后可以明显地阻止血清变浊。奇怪的是hdl-c造模后显著升高，这可能与apoe基因的敲除有关。药物治疗对hdl-c也有一个抬升趋势，高剂量的p12也可以较明显抬升hdl-c。其他指标tc，tg，ldl-c经过p12的治疗都有显著的降低，尤其对小鼠的胆固醇和三酰甘油的降低作用较强。对ldl-c也有较好的降低作用，其中对三酰甘油的降低作用最强（如表3所示）。

表3p12对tc，tg，ldl-c的降低和hdl-c升高程度

2.血清炎症因子测定结果

从附图3的结果可知，相比正常小鼠，造模后的apoe^-/-小鼠的crp，tnf-α，il-6和mcp-1等指标都显著升高（p<0.01），中途干预给予apoa-i模拟肽p12后，无论低剂量（10mg/kg）还是高剂量（20mg/kg）都可以显著控制这些指标的升高（p<0.01），其中tnf-α，il-6和mcp-1的水平趋近于正常，l-4f的抗炎效果要低于p12和母肽。从crp的测定结果来看，crp确实与动脉粥样硬化密切相关，无动脉粥样硬化的正常组crp的值趋近于0，模型组的crp均值高于150mg/l。这说明模型组小鼠已经发生了比较严重的炎症，提示动脉粥样硬化的进程发展要高于其他各组的水平，而p12可以明显地缓解crp的产生。

3.p12对动脉粥样硬化小鼠的病理学改变结果

从动脉的病理切片he染色看治疗效果如附图4的a中所示，正常组小鼠未见动脉粥样硬化特征，模型组有显著的附图4的a中所示的动脉粥样硬化病理特征，我们可以明显地看到模型的成功建立，以及l-4f，母肽apoa-i221-240和p12的治疗效果，黄线标出的部分为动脉内膜增厚的厚度，白线为总的动脉管壁厚度，l-4f，母肽治疗组中都有不同程度的动脉粥样硬化病变，病变程度小于模型组，而p12的治疗效果较好，动脉粥样硬化的病变可以大幅度被p12减小，斑块尺寸，内膜相对厚度都要明显小于模型组，l-4f和母肽apoa-i221-240组，结合附图4c对每个样本所有取材的he染色病理切片视野的相对内膜增厚度统计后发现，p12有较好的治疗作用，但是剂量依赖的效果不明显，可能是剂量梯度拉的不够大，或10mg/kg剂量已经到了最大响应剂量。

从图4的b中的结果来看，肝脏组织在造模后发生了较大面积的脂肪化，he切片可以看到明显的圆形脂肪空泡，模型组和l-4f，母肽组的肝细胞排列紊乱，细胞间空隙增多，有炎性细胞的浸润，免疫性水肿，肝细胞内容物不充实，细胞核偏大，p12治疗后肝脏的可染的红色脂肪减少，肝细胞排列紧密有序，肝细胞内容物充实，细胞大小与细胞核大小比例恰当，并趋近于正常组的形态，相比较而言p12对肝的保护作用要优于l-4f和母肽apoa-i221-240。

如附图4的c中所示，相对内膜厚度是用动脉he染色切片测定的数据，相对内膜厚度=动脉内膜异常增厚的厚度/动脉血管壁总厚度。相对脏器脂肪面积是用肝脏he染色切片所统计的数据，相对肝脏脂肪面积=每张图脂肪空洞的面积/每张图的面积，l-4f，母肽，p12低、高剂量对动脉粥样硬化小鼠内膜增厚的减少程度分别为56.79%，11.68%，85.32%和89.56%。l-4f，母肽，p12低、高剂量对小鼠肝脂肪化面积的减少程度分别为60.36%，37.59%，65.87%和68.04%，p12显示出优于l-4f和母肽的抗动脉粥样硬化和脂肪肝的作用。