本发明属于废水生物处理领域，具体涉及一种edta降解功能菌群的快速富集培养方法。
背景技术：
乙二胺四乙酸(edta)是一种极其重要的金属螯合剂，广泛用于洗涤剂制造、纺织印染、造纸、电镀、日用化工以及重金属污染土壤修复等领域。edta的金属螯合物高度稳定且难降解，进入环境中会导致有毒重金属离子在环境中的迁移与水体富营养化现象的发生。目前，edta的处理方法主要包括物理、化学和生物法。相比于其他处理方法，生物法处理污染物具有环境友好、二次污染少以及运行成本低等优点。然而，edta生物处理过程中，往往存在微生物生长时间过程长、代谢速率过慢等问题，严重制约了edta生物处理的工程应用。例如，本实验室以edta为唯一碳源，经过六个多月的驯化培养后，最终得edta降解富集培养物；再例如，thomas等以edta为唯一碳源经过两年多时间富集到edta降解功能菌群，使用该富集物处理edta金属离子螯合物，28d后不同edta金属螯合物的降解效果均低于60％。因此，如何采取措施提高edta降解微生物的生长与降解活性对于edta的有效去除十分重要。
由当前的研究进展可知，难降解有机物的生物处理过程中，共代谢作用可有效提升微生物的生长与代谢活性，进而可帮助促进难降解污染物的去除。王瑞敏和黄少斌的报道指出，当edta初始浓度约为226.8mg/l时，在共基质乙酸钠的作用下，7d后edta的去除率可达到83.2％，比对照组(只含edta)提高59.2％。杨晓奕等控制hrt为16h，srt为10d，经过30d的驯化后，活性污泥对初始浓度为100mg/l的edta去除率达45％～55％；加入10mg/l乙酸钠后，去除率可达到80％，同时污泥性能得到改善。但这一方法的起始edta浓度较低，不一定能够处理edta含量高的污染物；而且，该方法的处理效果也只能达到80％左右，并不是特别理想。
综上所述，实现edta污染物生物处理工程应用的关键在于：如何快速获得可高效降解edta且可广泛适应各种浓度的edta降解功能菌群。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种可快速富集edta降解功能菌群、进而快速降解edta的方法。
为实现上述发明目的，本发明所采用的技术方案是：一种快速富集edta降解功能菌群的培养基，所述培养基中包括edta和brij35。
优选的，所述培养基中，所述brij35浓度为10～280mg/l。
优选的，所述培养基配方包括：na2hpo4·12h2o1000mg/l，kh2po41000mg/l，(nh4)2so4300mg/l，mgso4·7h2o250mg/l，微量元素5.0ml/l，edta500mg/l，brij35150mg/l。
优选的，所述微量元素包括：edta0.5g/l，znso4·7h2o0.22g/l，cacl20.055g/l，mncl2·4h2o0.051g/l，feso4·7h2o0.049g/l，(nh4)2mo7o24·4h2o0.011g/l，cuso4·5h2o0.0157g/l，cocl2·6h2o0.016g/l。
相应的，一种快速富集edta降解功能菌群的方法，在富集培养基中同时添加edta和brij35。
优选的，所述方法包括如下步骤：
(1)配制所述富集培养基；
(2)提取含edta的待降解样品作为接种物，接种至所述富集培养基中，培养即得所需的edta降解功能菌群。
优选的，所述含edta的待降解样品经闷曝后再作为接种物。
优选的，所述培养的条件为：ph为6.93～9.95、do4.4～9.99mg/l，温度为13.3～30℃。
相应的，一种快速降解edta的方法，利用同时含有edta和brij35的培养基富集获得的edta降解功能菌群对edta进行降解。
本发明具有以下有益效果：
本发明提供了一种全新的可促进菌群快速生长的共代谢碳源：brij35。同时含有该碳源和edta的培养基，可以快速富集降解edta性能优异的功能菌群，将富集时间从现有的2个月甚至半年以上，缩短到40天以内。
通过本方法富集获得的功能菌群，可快速降解edta，降解效率显著优于现有技术。另外，通过对不同来源的活性污泥进行菌群富集和edta降解试验，均取得了优异的效果，证明本方法具有普适性，可广泛应用于含edta的废水处理中。
具体实施方式
本申请提供了一种可快速富集edta降解功能菌群的方法，该功能菌群具有优异的降解edta的效果。
本发明涉及的培养基如下：
(1)富集培养基1：na2hpo4·12h2o1000mg/l，kh2po41000mg/l，(nh4)2so4300mg/l，mgso4·7h2o250mg/l，微量元素5.0ml/l，edta500mg/l。
(2)富集培养基2：na2hpo4·12h2o1000mg/l，kh2po41000mg/l，(nh4)2so4300mg/l，mgso4·7h2o250mg/l，微量元素5.0ml/l，edta500mg/l，brij35150mg/l。所述brij35为月桂醇聚氧乙烯醚。
(3)富集培养基3：na2hpo4·12h2o1000mg/l，kh2po41000mg/l，(nh4)2so4300mg/l，mgso4·7h2o250mg/l，微量元素5.0ml/l，edta500mg/l，naac250mg/l。
(4)所述微量元素为：edta0.5g/l，znso4·7h2o0.22g/l，cacl20.055g/l，mncl2·4h2o0.051g/l，feso4·7h2o0.049g/l，(nh4)2mo7o24·4h2o0.011g/l，cuso4·5h2o0.0157g/l，cocl2·6h2o0.016g/l，ph＝6.0(用koh调节ph)。
(5)无机盐培养基：na2hpo4·12h2o1000mg/l，kh2po41000mg/l，(nh4)2so4300mg/l，mgso4·7h2o250mg/l，微量元素5.0ml/l。
本发明富集edta降解功能菌群的培养基为所述富集培养基2；具体富集方法包括如下步骤：
(1)配制所述富集培养基2。
(2)提取含edta的待降解样品作为接种物，接种至所述富集培养基2中，培养即得所需的edta降解功能菌群。
其中，所述含edta的待降解样品，具体指对待降解、待处理污染物进行取样，下述实施例中对曝气池的活性污泥进行取样，但并不应当理解为本发明的方法只能处理曝气池的活性污泥。应当理解的是，本发明的处理方法可以广泛应用于含各种浓度的edta污染物。
下述实施例中例举了使用sbr反应器进行edta污水处理的方法，在此对该方法进行概述，具体包括如下步骤：
(1)取待处理活性污泥，闷曝处理24h后备用。
(2)将所述富集培养基2加入sbr反应器中，加入体积为sbr反应器体积的65～70％。随后将闷曝处理后的活性污泥也加入sbr反应器中，加入体积为sbr反应器体积的30～35％。
(3)进行曝气培养，培养条件为：ph为6.93～9.95、do为4.4～9.99mg/l，温度为13.3～30℃。一个降解周期为：hrt＝11d，运行33d；再调节hrt＝7d，运行14d。此处的降解周期仅为系统正常启动的周期，启动后可以根据需要缩短运行周期，并延长运行时间，持续进行污水处理。
实施例一：富集体系的构建
1、分别从成都市某cass工艺曝气处理单元、德阳市某a2/o工艺曝气池处理单元以及绵阳市某a2/o工艺曝气池处理单元中取活性污泥作为edta降解功能菌群富集培养的接种物。优选的方式为：所述活性污泥经闷曝后再进行接种。所述闷曝的具体方法为：将上述获得的活性污泥样品分别置于三个序批式反应器(sbr反应器)中，均加无机盐培养基闷曝24h后再使用；所述闷曝过程中，活性污泥体积占sbr反应器体积的30～35％，无机盐培养基占sbr反应器体积的65～75％。闷曝后，进行沉淀，取位于sbr反应器底部的活性污泥作为接种物。
向9个相同规格的sbr反应器中分别加入富集培养基1、2、3，每类富集培养基处理3个sbr反应器；各富集培养基的加入量为sbr反应器体积的65～70％。随后再将闷曝后的活性污泥均分，分别接种至9个用于富集培养的序批式反应器(sbr)中，活性污泥接种量为sbr反应器容积的30～35％(以sv30计)；获得9个富集培养体系。对各富集培养体系进行曝气培养，每隔一段时间(一个hrt)后，停止曝气，沉淀各体系中的活性污泥，排除上清液，再加入新的对应的富集培养基，继续曝气培养。
所述9个富集培养体系对应名称分别为：(1)样品1；接种物为成都市某cass工艺曝气池中的活性污泥：sbr1-1，空白对照组1；sbr2-1，实验组1；sbr3-1，阳性对照组1。(2)样品2；接种物为德阳市a2/o工艺曝气池中的活性污泥：sbr1-2，空白对照组2；sbr2-2，实验组2；sbr3-2，阳性对照组2。(3)样品3；接种物为绵阳市a2/o工艺曝气池中的活性污泥：sbr1-3，空白对照组3；sbr2-3，实验组3，sbr3-3，阳性对照组3。
2、各体系的培养条件均控制为：ph为6.93～9.95、do为4.4～9.99mg/l，温度为13.3～30℃。一个降解周期为：hrt＝11d(hrt，水力停留时间，即污水与微生物的平均反应时间)，运行33d；再调节hrt＝7d，运行14d；srt为7～11d(srt，污泥停留时间)，污泥浓度为4000±500mg/l。各组中sbr1、sbr2、sbr3中的进水cod均分别为250mg/l、750mg/l、500mg/l。“hrt＝11d，运行33d”，意为：控制初始进水中edta浓度为500mg/l，按各组不同sbr体系选择初始进水cod，停留11天后，进行1次换水，换水中的edta和cod与初始进水中的相同。换水后，再停留11天；重复该过程至33天。其余hrt和运行时间的含义以此类推。
以一个降解周期内cod和edta的去除率均大于90％为标准，判断各组所处系统是否成功启动。cod和edta的去除率计算公式分别为：cod去除率(％)＝(进水cod值-出水cod值)/进水cod值×100％。edta去除率(％)＝(进水edta浓度-出水edta浓度)/进水edta浓度×100％。其中，进水值即为初始值(t＝0天)，出水值为一次hrt后的值(t＝hrt)。
样品1处理结果如表1、2所示。样品2处理结果如表3、4所示。样品3处理结果如表5、6所示。
表1不同富集体系处理样品1的edta去除率
表2不同富集体系处理样品1的cod去除率
表3不同富集体系处理样品2的edta去除率
表4不同富集体系处理样品2的cod去除率
表5不同富集体系处理样品3的edta去除率
表6不同富集体系处理样品3的cod去除率
其中，表中的“0”是指几乎无去除效果；这是因为环境条件与操作参数的变化会导致菌群的生长代谢情况的变化，处理结果会略有波动和反复。另外，表中出现了一些高于500mg/l的edta浓度，这是因为，一个hrt后，会再次换水，重新注入edta，此时前一个hrt中的edta可能并未处理完全。
3、从上表可以看出，无论是哪个组别、何种样品，实验组均最快实现启动，去除效率极为优异，说明本发明提供的方法具有普适性；通过添加共代谢物质brij35可实现edta降解功能菌群的快速富集，从而实现edta的快速降解。
实施例二：edta降解功能菌群的生物学检测
1、为进一步分析edta降解功能菌群中的大致组成，对实施例一实验组1(sbr2-1)运行101d后的污泥样品进行取样。并采用试剂盒提取细菌总dna，再采用16srdna测序技术对细菌的v3～v4区域进行扩增测序，分析edta降解功能菌群中的微生物群落结构。
(1)dna提取
使用mobio土壤提取试剂盒(mobiolaboratories，usa)提取细菌基因组dna。dna浓度和质量通过
(2)16srdna扩增与测序
对细菌16srdna的v3～v4高可变区进行pcr扩增，pcr反应体系为：5×fastpfubuffer4μl，2.5mmdntps2μl，前引物(338f：5-’actcctacgggaggcagcag-3’，5μm)0.8μl，后引物(806r：5'-ggactachvgggtwtctaat-3'，5μm)0.8μl，fastpfupolymerase0.4μl，模版dna10ng，bsa0.2μl，加ddh2o至20μl。pcr反应条件为：95℃预变性3min，随后95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸45s，共扩增27个循环，随后72℃后延伸10min。pcr扩增结束后，产物通过2％的琼脂糖凝胶电泳检测。本试验涉及仪器主要包括abi
(3)测序结果分析
miseq测序得到的原始数据首先经过拼接、质控和过滤得到有效数据，再根据特定的阈值(默认选取97％)进行操作分类单元(out)聚类。然后，基于otu的分析计算样品的丰度、组成等信息。测序数据处理与分析工具包括qiime(http://qiime.org/)、uchime和rdpclassifier等。edta降解功能菌群中的主要微生物组成如表7所示。
表7微生物群落结构
实施例三：edta降解功能菌群的降解性能展示
为进一步展示edta降解功能菌群的降解性能，提取实施例二的功能菌群，考察其在不同ph(6～10)、不同edta浓度(50～2000mg/l)、不同brij35浓度(0～300mg/l)以及不同温度(10～30℃)下对edta的降解效果，并确定该菌群的最适生长条件。本实施例中，处理的样品来自实施例一中成都市的污泥(样品1)。结果如表8～12所示。
表8不同ph下edta降解效果(mg/l)
从表可知，该功能菌群的适宜生长ph为8～9。
表9不同初始edta浓度下菌群的降解效果
从表可以看出，为使edta在一个降解周期内(24h)内实现完全降解，初始edta浓度不宜超过1200mg/l；说明通过本发明的方法筛选的功能菌群，对edta浓度耐受力高，可以处理含较高浓度edta的污水或污泥。
表10使用不同brij35浓度筛选的功能菌群对edta的降解效果
从表10可以看出，培养基中的brij35浓度为250mg/l时，获得的功能菌群处理效果最好。
表11不同温度下edta降解
从表11可以看出，温度对功能菌群的降解活性影响很大，该功能菌群的最佳生长温度为30℃。
表12edta随时间的降解规律
根据表12的数据可以得出一个降解周期内的edta降解规律：降解动力学方程为y＝-33.136t+460.41(r2＝0.99741)。底物降解半衰期t1/2/h为7.04，降解速率常数kt/t-1为33.136。
实施例四：edta降解功能菌群对不同edta金属螯合物的降解效果
提取实施例二的功能菌群，在ph值9，edta浓度为500mg/l、brij35浓度为150mg/l、温度为30℃条件下，考察edta降解功能菌群对cr、co、pb、ca、cu、ba、ni、mn、fe、zn、mg11种不同金属edta螯合物的降解特性。11种不同金属离子物质分别选用cr2(so4)3·6h2o276.6mg/l、cocl2·6h2o263.1mg/l、pb(no3)2366.2mg/l、cacl2122.7mg/l、cuso4·5h2o276.1mg/l、bacl2·2h2o270.1mg/l、nicl2·6h2o262.8mg/l、mnso4·h2o186.9mg/l、fe2(so4)3221.1mg/l、znso4·7h2o318.0mg/l、mgso4133.1mg/l，按照金属离子与edta摩尔比为1:1的比例关系进行配置；培养基其余组分均与实施例一相同。结果如表13所示。
表13edta降解功能菌群对不同edta-金属螯合物的降解性能
需要说明的是，上述的实施例二、三、四虽然是针对样品1中提取的edta降解功能菌群进行的，实际上发明人也对其余样品中提取的功能菌群进行了相同/相似的试验，只是篇幅限制，本申请只以样品1为例，展示这类功能菌群一般情况下的适宜生长条件及对各类金属螯合物的处理情况。应当理解的是，不同来源的污泥中提取的菌落组成略有不同，而且随着时间的变化，群落组成也处于动态变化中；但只要使用本发明提供的培养方法，获得的功能菌群均具有优异的edta降解效果。