包括短小芽孢杆菌菌株或其培养液的用于预防或改善老化的组合物的制作方法

本公开涉及一种包括短小芽孢杆菌(bacilluspumilus)菌株或其培养液的用于预防或改善老化的组合物。

背景技术：

在功能性化妆品领域中，对于延缓皮肤老化来帮助改善皮肤皱纹的产品、保护皮肤免受紫外线和外部环境影响的产品和帮助皮肤美白的产品有很大的兴趣。事实上，随着进入老龄化的社会，仍在努力持续开发用于延缓皮肤老化的皱纹改善化妆品。通常，在老化的皮肤上出现皱纹和皮肤弹性减少、皮肤耷拉和干燥现象等的主要原因是真皮中存在的基质蛋白质的变化。由于真皮在皮肤中的作用为支持皮肤的强度和形态，当在进行老化过程中该区域发生形态变化时，在皱纹形成和皮肤耷拉方面扮演非常关键的角色。基质金属蛋白酶(mmps)为降解这些基质蛋白质的代表性的酶，即使是一次的紫外线照射也会增加皮肤中mmps的活性，并降解皮肤中的胶原蛋白和其他基质蛋白质，作为促进老化的一个主要因素。

在皮肤老化中，光老化被认为是引致皮肤老化的最大因素，已有许多用于预防光老化的产品正在面市，但是使用天然材料的光老化预防技术在其使用上受到限制，并具有在效能验证时发生许多问题的限制。

一方面，益生菌(probiotics)是对人体有益的微生物的通称，指的是对我们身体有益(benefit)的微生物。迄今已知的大多数益生菌被称为乳酸菌。虽然益生菌据报道为通过几种有益作用对人体产生有效的效能，但是实际上有关芽孢杆菌属中的微生物与皮肤之间的相互关系的研究不完备。

因此，本公开的发明人已经确认芽孢杆菌属的微生物或其培养物可以通过缓解皮肤老化而有效地用于改善皮肤状况，并完成了本公开。

技术实现要素：

本公开的一方面提供了一种短小芽孢杆菌(bacilluspumilus)菌株。

本公开的另一方面提供了一种包括短小芽孢杆菌菌株或其培养液作为有效成分的用于预防或改善老化的化妆品组合物。

本公开的另一方面还提供了一种短小芽孢杆菌菌株或其培养液在用于制备化妆品组合物中的用途。

本公开的另一方面还提供了一种包括短小芽孢杆菌菌株或其培养液在用于制备化妆品组合物中的化妆品组合物的用途。

本公开的另一方面还提供了一种制备短小芽孢杆菌菌株或其培养液的方法。

本公开的一方面提供了一种短小芽孢杆菌菌株(保存号：kccm12274p)。

本公开的另一方面提供了一种包括短小芽孢杆菌菌株或其培养液作为有效成分的用于预防或改善皮肤老化的化妆品组合物。

本公开的另一方面还提供了一种短小芽孢杆菌菌株或其培养液在用于制备化妆品组合物中的用途。

在本公开中，术语“化妆品组合物”是指通过进行清洁和美化人体来增加魅力并将容貌改变得明亮或者维持或增强皮肤和毛发健康的用于人体的物品。

所述化妆品组合物可以用于预防或改善皮肤皱纹。所述化妆品组合物可以用于增加皮肤弹性。所述化妆品组合物可以用于预防或改善皮肤老化或色素沉着。所述化妆品组合物可以用于皮肤再生。所述化妆品组合物可以用于促进皮肤组织的形成或再生。与其他芽孢杆菌属的菌株如枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)或已知具有抗衰老作用的冬葵(malvaverticillata)提取物相比，短小芽孢杆菌菌株或其培养液具有优异的预防或改善皮肤老化或皱纹的作用，并且具有促进皮肤再生的优异效果，因此所述包含短小芽孢杆菌菌株或其培养液的组合物可有效地用于化妆品组合物中。

在本公开中，术语“短小芽孢杆菌”是指一种通常在土壤中发现的革兰氏阳性、好氧性、孢子形成菌。所述短小芽孢杆菌可以从食物、土壤、海洋等中分离。

所述菌株可以是短小芽孢杆菌cx-uv菌株(保存号：kccm12274p)。

在本公开中，术语“皮肤老化”是指随着年龄的增长皮肤上出现的有形和无形的变化的统称，例如，表皮厚度变薄、真皮细胞数量或血管数量、恢复dna损伤的能力、细胞更换周期、伤口愈合、皮肤屏障功能、表皮的水分维持、汗液分泌、皮脂分泌、维生素d产生、物理损伤防护、化学物质去除能力、免疫反应、感觉功能和体温调节的减少。所述短小芽孢杆菌菌株或其培养液可以用于改善由外源性因素或内源性因素引起的皮肤老化。所述外源性因素是指各种外在因素如紫外线(光)，所述内源性因素是指主要由时间过去而引起的因素，也被称为时间因素。即，所述皮肤老化具体地不仅包括由紫外线、公害、香烟烟雾、化学物质等外部刺激引起的过早老化症状，还包括因年龄增长而减少皮肤细胞增殖所发生的自然老化现象，这是一个包含皱纹、弹性降低、皮肤耷拉和干燥现象等一切的概念。此外，皱纹包括由内源性因素的和外源性因素的的变化引起的刺激改变组成皮肤组织的成分而引起的皱纹。

所述老化可以是光老化。术语“光老化”是指由外部环境因素引起的现象，紫外线是最典型的因素。紫外线导致蛋白酶的活化、基质蛋白质的链断裂及如异常交联等的生物组分的损害，这种机制的重复导致在外观上明显的皮肤老化。

在本公开中，术语“皱纹”是指皮肤弹性丧失而松弛的状态，例如，可以是皮肤折叠的状态。色素沉着是指体内色素的量异常或色素出现的地方有异常的状态，例如，可以是斑点和雀斑等。所述″皮肤皱纹预防或改善”可以指抑制这些皱纹相关因子的表达以预防或改善皱纹，或者增加胶原蛋白的总量的所有应用。

在本公开中，术语“改善”可以指与缓解或治疗病症相关的参数，例如，至少可以减轻症状的程度的所有行为。

在本公开中，术语“预防″可以指通过施用所述组合物来抑制或延迟皮肤光老化、色素沉着或皱纹的任何行为。

在本公开中，术语“培养液”是指通过培养菌株而获得的培养液本身、其浓缩物或冻结干燥物，或者从培养液除去菌株而获得的培养上清液、其浓缩物或冻结干燥物。所述培养液可以包括有用的活性成分，例如在培养短小芽孢杆菌菌株的过程中产生的蛋白质。

所述培养可以是但不限于在约25℃至约30℃下进行约45小时至约50小时的悬浮培养。所述培养温度和培养时间可以在所述菌株显示出改善或预防老化的效果的范围内适当选择。

所述组合物可以抑制基质金属蛋白酶-1(mmp-1)的表达，具体而言，可以抑制mmp-1基因的表达或mmp-1蛋白质的活性，从而表现出抑制皮肤老化的效果。

所述组合物可以增加胶原蛋白合成。所述组合物可以增加胶原蛋白如1型胶原蛋白基因的表达。具体而言，可以增加1型胶原蛋白基因的表达来恢复胶原蛋白的产生，从而表现出抑制皮肤老化的效果或改善皱纹的效果。

所述组合物可以包括有效量的培养液。所述有效量可以根据个体来适当选择。所述有效量可以根据包括以下项的因素以及在生理至医学领域中熟知的其他因素来决定：疾病状况的严重程度、个体的年龄、体重、健康、性别、个体对提取物的敏感度、施用时间、施用途径和排出比率、施用期间、与所述组合物配合或同时使用的其他组合物。

具体而言，基于化妆品组合物的总重量，所述培养液可以包括0.001重量百分比至80重量百分比，例如，0.01重量百分比至60重量百分比、0.01重量百分比至40重量百分比、0.01重量百分比至30重量百分比、0.01重量百分比至20重量百分比、0.01重量百分比至10重量百分比、0.01重量百分比至5重量百分比、0.05重量百分比至60重量百分比、0.05重量百分比至40重量百分比、0.05重量百分比至30重量百分比、0.05重量百分比至20重量百分比、0.05重量百分比至10重量百分比、0.05重量百分比至5重量百分比、0.1重量百分比至60重量百分比、0.1重量百分比至40重量百分比、0.1重量百分比至30重量百分比、0.1重量百分比至20重量百分比、0.1重量百分比至10重量百分比，或0.1重量百分比至5重量百分比。

除了所述组合物之外，所述化妆品组合物中包括的成分可以包括常规用于化妆品组合物中的成分作为有效成分，例如，稳定剂、溶剂、维生素、颜料和香料等的常规助剂及载体。

在所述组合物的情况下，所述菌株或其培养液可以制备为包括以下的剂型：化妆水(润肤液)、柔肤水、爽肤水、收敛剂(astringent)、乳液、牛奶润肤露(milklotion)、保湿乳液、营养液、按摩霜、营养霜、保湿霜、手霜、粉底、精华、营养精华、膜、肥皂、洁面泡沫、洁面乳、洁面霜、身体乳液、身体清洁液、悬浮液、凝胶、粉末、粘膏(paste)、面膜或片装面膜或喷雾组合物。可根据本领域常规方法制备此类剂型的组合物。所述化妆品组合物可以进一步包括保存剂、稳定剂、表面活性剂、溶剂、保湿剂、润肤剂、紫外线吸收剂、防腐剂、杀菌剂、抗氧化剂、ph调节剂、有机和无机颜料、香料、冷感剂或止汗剂。在不损害本公开的目的和效果的范围内，本领域技术人员可以容易地选择诸如上述保湿剂等的附加成分的混合量，该混合量可以是基于组合物的总重量的0.001重量百分比至5重量百分比，具体而言，0.01重量百分比至3重量百分比。

此外，所述组合物可以制剂成皮肤外用剂。

在本公开中，所述皮肤外用剂可以是乳膏、凝胶、软膏、皮肤乳化剂、皮肤悬浮液、经皮传递性贴片、含药绷带、乳液或其组合。所述皮肤外用剂可以根据需要适当混合通常用于化妆品或药物等的皮肤外用剂的成分，例如，水性成分、油性成分、粉末成分、醇类、保湿剂、增稠剂、紫外线吸收剂、美白剂、防腐剂、抗氧化剂、表面活性剂、香料、着色剂以及各种皮肤营养剂等。所述皮肤外用剂可以适当混合乙二胺四乙酸二钠、乙二胺四乙酸三钠、柠檬酸钠、多聚磷酸钠、偏磷酸钠、葡萄糖酸等的金属螯合剂、咖啡因、单宁、戊脉安、甘草提取物、光甘草定、大蓟果实的热水提取物、各种生药、生育酚乙酸酯、甘草酸、氨甲环酸及其衍生物或其盐等药剂、维生素c、抗坏血酸磷酸酯镁、抗坏血酸葡糖苷、熊果苷、曲酸、葡萄糖、果糖、海藻糖等的糖类。

本公开另一方面的提供一种改善个体皮肤的方法，其包括将所述组合物施用于个体。所述组合物为如上所述。

所述方法可以是，具体地，预防或改善个体的皮肤老化或预防或改善皮肤皱纹的方法。

术语“应用的”、“施用的”、″导入的″及“移植的”可互换使用，并可以指实现根据一个实施例的组合物的至所需的部位的至少部分局部化的方法或根据路径的至个体内的根据一个实施例的组合物的布置。根据一个实施例的组合物的培养液或培养液成分的至少一部分可通过任何传送至活体中的期望位置的合适途径来施用。

所述个体可以是哺乳动物，例如：人、牛、马、猪、狗、绵羊、山羊或猫。所述个体可以是需要改善皮肤状况如改善皮肤老化或改善皮肤皱纹的个体。

本公开的另一方面提供了一种制备所述短小芽孢杆菌菌株培养液的方法，所述方法包括：培养所述短小芽孢杆菌菌株；从培养后所获得的菌体培养液中分离并去除菌体。

所述短小芽孢杆菌菌株与上述相同。

根据一个具体实施例，所述方法可以包括：培养所述短小芽孢杆菌菌株；对培养后所获得的菌体培养液进行离心分离以去除菌体并回收上清液；以及过滤回收的上清液以除去残留菌体。

在上述方法中，所述短小芽孢杆菌菌株的保存号可以是kccm12274p。

所述培养可以是但不限于在约25℃至约30℃下进行约45小时至约50小时的培养。所述培养可以是悬浮培养。

通过所述方法制备的短小芽孢杆菌菌株的培养液可以增加mmp-1的表达来增强皮肤屏障或预防老化，并且可以示出通过增加1型胶原蛋白的表达或恢复减少的1型胶原蛋白的表达来防止皮肤老化或预防或改善皮肤皱纹的效果。与其他芽孢杆菌属的菌株相比，所述短小芽孢杆菌菌株或其培养液的皮肤屏障增强，皮肤保湿，皮肤老化预防，皮肤皱纹改善或皮肤再生的效果相当优异。因此，通过所述方法制备的短小芽孢杆菌菌株或其培养液可以用于化妆品、皮肤外用剂等的各种用途。

附图说明

图1为评估短小芽孢杆菌菌株或其培养液抑制通过紫外线处理而增加的mmp-1表达的功效的图表。其中，con：uvb未处理的对照组；uv：uvb处理组；cm：uvb处理后添加冬葵提取物的培养基处理组；nasa1：uvb处理15秒后的短小芽孢杆菌菌株的培养液处理组；nasa4：uvb处理30秒后的短小芽孢杆菌菌株的培养液处理组；rl：uvb处理后的芽孢杆菌属的菌株处理组。

图2为评估短小芽孢杆菌菌株或其培养液恢复通过紫外线处理而减少的1型胶原蛋白表达的功效的图表。其中，con：uva未处理的对照组；uva：uva处理组；cm：uva处理后添加冬葵提取物的培养基处理组；fm：uva处理后的短小芽孢杆菌菌株的培养液+死菌体提取物的处理组；fmp：uva处理后的短小芽孢杆菌菌株的培养液处理组；pna：uva处理后的芽孢杆菌属的菌株处理组。

具体实施方式

在下文中，将通过实施例更详细地描述本公开。然而，这些实施例仅用于列示性地描述一个或多个具体实施例，本公开的范围不限于这些实施例。

实施例1、短小芽孢杆菌(bacilluspulilus)菌株的分离与种属鉴定

收集已知分布大量枯草芽孢杆菌的土壤和干芦苇，将混合土壤和芦苇的样品100g以100rpm悬浮于无菌蒸馏水中1小时，将上清液10ml稀释为1/10、1/100、1/1000，并接种于r2a、tsa、na培养基中。置于25℃培养箱中培养48小时后，从形成的菌落中仅选择白色和米色的圆形菌落并进行纯分离培养。将分离培养的菌落再次进行纯分离培养，并委托macrogen公司分析形成菌落的平板以鉴定30种选定的菌种。

结果发现两种菌与短小芽孢杆菌具有98％以上的同源性，其余为不同种属或不同系统的微生物。从所确认的两种短小芽孢杆菌中，选择抗紫外线性更强的菌种。所述分离的菌株命名为短小芽孢杆菌cx-uv，并将其于2018年6月14日保存在韩国微生物保存中心，保存号为kccm12274p。

实施例2、短小芽孢杆菌菌株和短小芽孢杆菌菌株培养液的制备

为了培养短小芽孢杆菌cx-uv菌株，使用含有作为主要成分的r2培养基成分的培养基。将r2培养基5g悬浮并溶解于1升水中，并在121℃下灭菌15分钟以准备培养基。此时，培养基准备两种：一种是含有琼脂的固体培养基；另一种是不含琼脂的液体培养基。首先，将短小芽孢杆菌cx-uv菌株涂布在固体培养基上，在28℃下培养3天，将培养的短小芽孢杆菌cx-uv菌株在uv光下照射30秒。取所述一个uv处理的菌落接种到1升液体培养基中。将接种的液体培养基在28℃下悬浮培养(100rpm)48小时，当培养完成时，通过离心分离器进行离心分离(7000rpm，30分钟)后仅取出已去除菌体的上清液，通过0.2μm过滤器进行过滤除菌。

试验例1、短小芽孢杆菌菌株的培养基对mmp-1的功效评价

确认所述实施例1中准备的短小芽孢杆菌菌株的培养液对mmp-1活性和表达的影响。

为了评价mmp-1在组织水平的抑制作用，使用三维人工培养皮肤组织的epidermfttm(mattek，美国)进行实验。

首先将表皮和真皮都一起包括的epidermft^tm在培养基中稳定24小时后除去培养基，将60mj/cm2的uvb照射到除uvb未照射组之外的其余实验组，然后处理短小芽孢杆菌菌株的发酵溶解物或比较实验菌株。随后，已知具有改善皮肤老化或皮肤皱纹效果的冬葵提取物用按浓度添加的培养基替换以进一步培养12小时。随后，收集培养有人工皮肤组织的培养基，并通过离心分离除去漂浮物以用于测量培养基中含有的蛋白质量。利用mmp-1elisa试剂盒(emdmillipore，美国)根据其说明方法测量培养基中含有的mmp-1蛋白质量。测量mmp-1表达变化的结果如图1所示，实验组如下。

con：uvb未处理的对照组；uv：uvb处理组；cm：uvb处理后添加冬葵提取物的培养基处理组；nasa1：uvb处理15秒后的短小芽孢杆菌菌株的培养液处理组；nasa4：uvb处理30秒后的短小芽孢杆菌菌株的培养液处理组；rl：uvb处理后的枯草芽孢杆菌bacillussubtilis)菌株处理组。

如图1所示，在uvb照射组(uv)中mmp-1表达量增加，而在uvb处理后添加冬葵提取物的培养基中恢复培养的实验组(cm)与uv处理组相比mmp-1表达量略微减少。在uvb处理后处理短小芽孢杆菌菌株的培养液的组(nasa1，nasa4)与这些相比显示有意降低的mmp-1表达量水平，与其他处理芽孢杆菌属的菌株的组(rl)相比也显示更减少的mmp-1表达量。

因此，确认了通过短小芽孢杆菌菌株的处理减少了通过uv照射增加表达的mmp-1的表达。从以上结果可以看出，短小芽孢杆菌菌株抑制mmp-1的活性以显示出抑制皮肤老化的效果。

试验例2、短小芽孢杆菌菌株的培养基对1型胶原蛋白的功效评估

确认所述实施例1中准备的短小芽孢杆菌菌株的培养液对1型胶原蛋白表达的影响。

为了评估1型原胶原在组织水平上的增加效果，使用与实施例1相同的组织在相同条件下进行实验，其中除了处理时用uva代替uvb之外，其他实验条件相同。最后，使用procollageni型c肽(pip)eia试剂盒(takara-bioinc.，日本)根据其说明方法测量培养基中的1型原胶原的含量。测量结果如图2所示，实验组如下。

con：uva未处理的对照组；uva：uva处理组；cm：uva处理后添加冬葵提取物的培养基处理组；fm：uva处理后的短小芽孢杆菌菌株的培养液+死菌体提取物的处理组；fmp：uva处理后的短小芽孢杆菌菌株的培养液处理组；pna：uva处理后的芽孢杆菌属的菌株处理组。

如图2所示，在uva照射组的培养基中1型原胶原的含量低于非照射组(con)，因此确认了1型原胶原被uv处理抑制。此外，由于处理短小芽孢杆菌菌株的培养液的处理组显着增加其含量，因此确认了由短小芽孢杆菌菌株恢复被紫外线抑制的胶原蛋白表达。所述效果显着高于处理芽孢杆菌属的另一种菌株的枯草芽孢杆菌的组(pna)。

因此，由于确认了短小芽孢杆菌菌株的培养液抑制uv处理后在细胞中mmp-1基因的表达和mmp-1的活性，并恢复被紫外线减少的i型胶原蛋白的表达，因此可用于缓解、改善和预防包括光老化的皮肤老化。

根据本公开一方面的化妆品组合物通过包括短小芽孢杆菌菌株或其培养液而具有优异的皮肤老化预防或改善，或皮肤皱纹预防或改善，或皮肤再生的效果。

虽然已在此描述了某些示例性实施例和实施方式，但是根据该描述，其它实施例和修改将是明显的。因此，本发明构思不限于这些实施例，而是限于所附权利要求的更宽范围，并且对于本领域普通技术人员来说，各种显而易见的修改和等同布置将是明显的。