PPP1CB基因SNP位点在制备检测寻常型银屑病易感性产品中的应用的制作方法

本发明属医学和生物技术领域，涉及ppp1cb基因snp位点在制备检测寻常型银屑病易感性产品中的应用，具体涉及ppp1cb基因三个单核苷酸多态性(singlenucleotidepolymorphism，snp)位点rs10210252、rs11687800、rs3190及其单倍型在制备检测寻常型银屑病易感性产品中的应用。

背景技术：

现有技术公开了银屑病(psoriasis，pso)为常见的慢性炎症性疾病，可累及皮肤、指甲、关节、肾脏、心血管等多个脏器。所述银屑病包括寻常型、红皮型、关节型和脓疱型等，其中寻常型银屑病(psoriasisvulgaris，psv)发病率最高，约20-30％的银屑病患者可出现关节损害，继而发展为银屑病关节炎(psoriaticarthritis，psa)。该疾患发病率高、病程长、易复发、难根治，给患者带来严重的身心损害和经济负担。因此，早期识别银屑病易感人群，对临床中预测发病、鉴别诊断、分层治疗具有重要意义。

银屑病的发病机制尚不明确，但遗传因素公认在其发病中发挥了不可否认的重要作用，其中，单核苷酸多态性(singlenucleotidepolymorphism，snp)作为最常见的遗传变异类型，其与银屑病的关系一直是银屑病研究中的热点问题。snp是指由单个核苷酸突变而引起的核酸序列的改变；一个snp位点有两个等位基因，在人类基因组中，平均每100-300个核苷酸中存在一个snp。人类的snps的分布具有差异，导致了不同种族、人群的染色体基因组具有多样性。在基因组中紧密接近的snps组块经常是遗传连锁的，形成”单倍型”。在银屑病中，已有多个基因的snp位点和单倍型被确定与银屑病易感性、病程转归及药物治疗效果的差异有关。

ppp1cb(proteinphosphatase1catalyticsubunitbeta)蛋白是蛋白磷酸酶(proteinphosphatase1，pp1)催化亚基中的一个。pp1是一种丝-苏氨酸蛋白磷酸酶，能够使蛋白质脱磷酸化。已知pp1参与调节众多生理活动：如糖原代谢、核糖体生成、肌肉收缩、细胞分裂、细胞凋亡(p53信号通路的负调控因子)、基因表达、蛋白质合成等。研究显示，银屑病是一定遗传背景下由免疫细胞与角质形成细胞相互作用共同介导的慢性炎症性疾病，特征性的组织病理表现与角质形成细胞分化异常密切相关。据报道，ppp1cb具有调节角质形成细胞增殖、迁移、分化的能力，显示了ppp1cb基因与银屑病的可能联系。但对ppp1cb基因rs10210252、rs11687800、rs3190单核苷酸多态性及其单倍型与寻常型银屑病易感性之间的关系，目前尚未见相关报道。

基于现有技术的现状，本申请的发明人拟提供ppp1cb基因snp位点在制备检测寻常型银屑病易感性产品中的新的用途。

技术实现要素：

本发明的目的是提供新的有助诊断和鉴别寻常型银屑病的基因标志物，具体涉及ppp1cb基因rs10210252、rs11687800、rs3190单核苷酸多态性及其单倍型在制备检测寻常型银屑病易感性产品中的应用。

本发明提供了人ppp1cb基因的应用，尤其是在制备检测或者筛查银屑病易感性产品中的应用；所述的人ppp1cb基因是指人ppp1cb基因的单核苷酸多态性或基因型或单倍型；所述的单核苷酸多态性位点是rs10210252、rs11687800或者rs3190。

本发明的一个实施例中，所述的银屑病是寻常型银屑病。

较好的，所述产品是用于检测人基因组中ppp1cb基因rs10210252、rs11687800、rs3190单核苷酸多态性或基因型或单倍型的物质。

所述产品还包括用于检测基因型和单倍型的试剂、试剂盒或者其组合。

例如，所述产品是用于通过如下方法中的一种或多种来检测基因组snp分型的物质：单链构象多态性、变性梯度凝胶电泳、酶切扩增多态性序列、等位基因特异性pcr检测、基因直接测序、dna芯片法、变性高效液相色谱或者质谱法。

本发明的一个实施例中，所述的单核苷酸多态性位点是所述的检测或者筛查方法的靶标。

本发明中，所述的应用包括检测基因型并确定其与寻常银屑病的关联，依次按如下步骤进行：

制备样本；

基因测序；

基因型确定和分析。

另一方面，本发明还提供了一种检测或者筛查银屑病易感性产品，它的活性成分是测定人基因组中ppp1cb基因单核苷酸多态性或基因型或单倍型的产品。

较好的，上述产品是试剂、试剂盒或者其组合。

具体而言，本发明提供了下列用途：

(1)人基因组中ppp1cb基因rs10210252、rs11687800、rs3190单核苷酸多态性(即等位基因)或基因型或单倍型在制备检测寻常型银屑病易感性产品中的应用。

(2)人基因组中ppp1cb基因rs10210252、rs11687800、rs3190单核苷酸多态性(即等位基因)或基因型或单倍型在制备检测或筛查与寻常型银屑病相关的单核苷酸多态性的产品中的应用。

其次，本发明还提供了如下用途：

(1)检测人基因组中ppp1cb基因rs10210252、rs11687800、rs3190单核苷酸多态性(即等位基因)或基因型或单倍型在制备检测寻常型银屑病易感性产品中的应用。

(2)检测人基因组中ppp1cb基因rs10210252、rs11687800、rs3190单核苷酸多态性(即等位基因)或基因型或单倍型在制备检测或筛查与寻常型银屑病相关的单核苷酸多态性的产品中的应用。

本发明中，检测人基因组中ppp1cb基因rs10210252、rs11687800、rs3190单核苷酸多态性或基因型或单倍型的物质。包括现有技术中可以用于检测基因型和单倍型的试剂或者试剂盒，具体而言，这些物质为本领域常规的、可以用于检测ppp1cb基因rs10210252、rs11687800、rs3190单核苷酸多态性的检测方法所涉及的试剂和试剂盒。

目前常用的人类基因组snp分型的检测方法包括：单链构象多态性(sscp)、变性梯度凝胶电泳(dge)、酶切扩增多态性序列(caps)、等位基因特异性pcr检测、基因直接测序(sanger法)、dna芯片法、变性高效液相色谱(dhplc)及质谱法等等。不同snp分型方法所采用的试剂各有不同；而同一类检测方法，则根据研究者不同的检测目的、位点及分型效果而选用不同设计的引物、探针等，获得检测不同基因型的试剂或者试剂盒。

本发明中，检测或筛查寻常型银屑病易感性产品包括上述检测人基因组中ppp1cb基因rs10210252、rs11687800、rs3190单核苷酸多态性或基因型或单倍型的物质，可以为试剂或者试剂盒，还可以为试剂、试剂盒和仪器的组合产品。

本发明中，检测或筛查与寻常型银屑病相关的单核苷酸多态性的产品同样包括上述检测人基因组中ppp1cb基因rs10210252、rs11687800、rs3190单核苷酸多态性或基因型或单倍型的物质，可以为试剂或者试剂盒，还可以为试剂、试剂盒和仪器的组合产品。

本发明中，rs10210252、rs11687800、rs3190均为人类染色体上2p23.2上的二等位多态性snp位点。

rs10210252该变异是转换(g→a，在其互补链上则为c→t)，所述rs10210252基因型是指基因型gg、ga或aa；所述gg是rs10210252位点为g的野生基因型，所述aa是rs10210252位点为a的纯合突变基因型，所述ga是rs10210252位点为g和a的杂合突变基因型。所述检测人基因组中rs10210252的单核苷酸多态性或基因型具体是指检测rs10210252的核苷酸种类。本申请说明书实施例表明：与携带rs10210252野生g等位基因相比，携带rs10210252的a等位基因的人群寻常型银屑病易感性增高，但对银屑病关节炎易感性无影响。

rs11687800该变异是转换(a→g，在其互补链上则为t→c)，所述rs11687800基因型是指基因型aa、ga或gg；所述aa是rs11687800位点为a的野生基因型，所述gg是rs11687800位点为g的纯合突变基因型，所述ga是rs11687800位点为g和a的杂合突变基因型。所述检测人基因组中rs11687800的单核苷酸多态性或基因型具体是指检测rs11687800的核苷酸种类。本申请说明书实施例表明：与携带rs11687800野生a等位基因相比，携带rs11687800的g等位基因的人群寻常型银屑病易感性增高，但对银屑病关节炎易感性无影响。

rs3190该变异是转换(a→g，在其互补链上则为t→c)，所述rs3190基因型是指基因型aa、ga或gg；所述aa是rs3190位点为a的野生基因型，所述gg是rs3190位点为g的纯合突变基因型，所述ga是rs3190位点为g和a的杂合突变基因型。所述检测人基因组中rs3190的单核苷酸多态性或基因型具体是指检测rs3190的核苷酸种类。本申请说明书实施例表明：与携带rs3190野生a等位基因相比，携带rs3190的g等位基因的人群寻常型银屑病易感性增高，但对银屑病关节炎易感性无影响。

本发明中，单倍型是基于rs10210252、rs11687800、rs3190单核苷酸多态性的定位而进行标记的。本申请说明书实施例表明：与携带单倍型g-a-a和g-a-g相比，携带单倍型a-g-g的个体患寻常型银屑病的易感性增高，但对银屑病关节炎易感性无影响。

本发明的一个优选实施例中，从一个来自中国汉族人群的样本(64名寻常型银屑病患者，95名银屑病关节炎患者和1031名正常志愿者)中发现ppp1cb基因rs10210252、rs11687800、rs3190单核苷酸多态性及其单倍型与寻常型银屑病易感性相关，可将检测rs10210252、rs11687800、rs3190的单核苷酸多态性(即等位基因)或基因型或单倍型的物质与其他物质(如检测其它的与寻常型银屑病相关的单核苷酸多态性(即等位基因)或基因型或单倍型物质)联合在一起制备筛查寻常型银屑病易感者的产品。

本发明所述的ppp1cb基因rs10210252、rs11687800、rs3190snp具体信息，可通过下述渠道查寻：

https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/snp/rs10210252

https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/snp/rs11687800

https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/snp/rs3190

本发明提供了ppp1cb基因rs10210252、rs11687800、rs3190单核苷酸多态性及其单倍型在制备检测寻常型银屑病易感性产品中的应用。在实际应用中，可将检测rs10210252、rs11687800、rs3190的多态性(即等位基因)或基因型物质或单倍型与其他物质(如检测其他的与寻常型银屑病相关的单核苷酸多态性或基因型或单倍型物质)联合在一起制备筛查寻常型银屑病易感者的产品。

附图说明

图1是3个snp位点连锁不平衡图谱(左)和两两连锁不平衡检验结果(右)。

具体实施方式

下面结合具体实施方式，对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为阐述本发明，而不是为了限制本发明的范围。

实施例1寻常型银屑病与银屑病关节炎患者基因ppp1cbrs10210252、rs11687800、rs3190单核苷酸多态性分析

材料与方法：

1)研究对象：选定到华山医院皮肤科银屑病专病门诊就诊的159例银屑病患者(包括64名寻常型银屑病(psv)患者和95名银屑病关节炎(psa)患者)和1031名正常志愿者为观察对象。两名皮肤科医师分别对患者进行银屑病面积和严重程度指数(psoriasisareaandseverityindex，pasi)和体表面积评分(bodysurfacearea，bsa)。银屑病关节炎的诊断符合caspar诊断标准。159名患者和1031名正常志愿者填写完整流行病学调查表，签署知情同意书。159例患者的基本信息见表1。

2)基因组dna的提取：edta抗凝管抽取所有研究对象5ml外周静脉血，于-80℃冻存备用。使用flexigenedna试剂盒(qiagen，hiden，germany)按照标准方法从外周血淋巴细胞中提取所有研究对象的基因组dna，稀释至20ng/ul。所有dna样本均于-20℃下储存。

3)基因分型分析：利用sequenom’smassarray平台对所有研究对象的ppp1cb基因进行基因分型，利用massarrayassaydesign3.0软件(sequenom公司)设计了位点特异性聚合酶链反应(pcr)和检测引物。用多重聚合酶链反应(pcr)扩增dna样本，然后用pcr产物作为位点特异性单碱基延伸反应的模板。将所得产物脱盐并转移至384-元素光谱芯片阵列(sequenom公司)。等位基因检测采用maldi-tofms(sequenom公司)进行。质谱图由massarraytype软件(sequenom公司)进行分析。

4)统计分析：计量资料以均数±标准差(mean±sd)表示，两组间的计量资料比较采用独立t检验。计数资料以例和百分比表示。使用stata14.0软件中的genhwcci拓展包计算各snp位点是否符合哈代-温伯格遗传平衡定律(hardy-weinbergequilibrium，hwe)，p＞0.05即符合hwe。使用haploview4.2软件进行连锁不平衡分析和单倍型分析。以p＜0.05为差异有统计学意义。r*c表中两两比较使用bonferroni校正，两两比较以p＜0.05/3＝0.0167为差异有统计学意义。

结果：正常对照组的基因型频率分布(p＝0.09，p＝0.11，p＝0.31)符合哈代-温伯格遗传平衡定律(hardy-weinbergequilibrium，hwe)。如表2所示(字体加粗者为差异有统计学意义)，

(1)rs10210252的g和a等位基因频率在hc组分别是83.7％和16.3％；在psv组分别是71.9％和28.1％；在psa组分别是87.2％和12.8％。psv组和hc组比较，a等位基因频率明显增高(p＝0.0014，or＝2.00)。psa组和psv组比较，a等位基因频率明显下降(p＝0.0008，or＝0.37)。psa组和hc组等位基因频率无明显差异(p＝0.2526)。在遗传模型中进一步证实，携带rs10210252的a等位基因的人群psv易感性增高，但对psa易感性无影响。

(2)rs10210252的gg，ga和aa基因型频率在hc组分别是69.3％，28.8％和1.9％；在psv组分别是54.7％，34.4％和10.9％；在psa组分别是75.5％，23.4％和1.1％。psv和hc组比较(p＜0.0001)、psv组和psa组比较(p＝0.0033)差异有统计学意义。

(3)rs11687800的a和g等位基因频率在hc组分别是83.8％和16.2％；在psv组分别是71.9％和28.1％；在psa组分别是86.8％和13.2％。psv组和hc组比较，g等位基因频率明显增高(p＝0.0010，or＝2.02)。psa组和psv组比较，g等位基因频率明显下降(p＝0.0013，or＝0.39)。psa组和hc组等位基因频率无明显差异(p＝0.3011)。在遗传模型中进一步证实，携带rs11687800的g等位基因的人群psv易感性增高，但对psa易感性无影响。

(4)rs11687800的aa，ag和gg基因型频率在hc组分别是69.5％，28.5％和2.0％；在psv组分别是54.7％，34.4％和10.9％；在psa组分别是74.7％，24.2％和1.1％。psv和hc组比较(p＜0.0001)、psv组和psa组比较(p＝0.0038)差异有统计学意义。

(5)rs3190的a和g等位基因频率在hc组分别是76.7％和23.3％；在psv组分别是66.4％和33.6％；在psa组分别是79.3％和20.7％。psv组和hc组比较，g等位基因频率明显增高(p＝0.0102，or＝1.67)。psa组和psv组比较，g等位基因频率明显下降(p＝0.0129，or＝0.52)。psa组和hc组等位基因频率无明显差异(p＝0.4699)。在遗传模型中进一步证实，携带rs3190的g等位基因的人群psv易感性增高，但对psa易感性无影响。

(6)rs3190的aa，ag和gg基因型频率在hc组分别是58.3％，36.9％和4.9％；在psv组分别是43.8％，45.3％和10.9％；在psa组分别是62.8％，33.0％和4.3％。psv和hc组比较(p＝0.0222)、psv组和psa组比较(p＝0.0394)差异有统计学意义。

(7)三个snp的连锁不平衡分析如图1所示，rs10210252和rs11687800、rs10210252和rs3190、rs11687800和rs3190彼此连锁(d’＝0.996、1.0、1.0，r²＝0.975、0.645、0.639)。相应的单倍型分析如表3所示，携带单倍型a-g-g的个体患psv的易感性增高(p＝0.013，or＝2.05)

表1.159例患者的一般资料

表3.rs10210252、rs11687800、rs3190单核苷酸多态性单倍型频率表

注1：单倍体等位基因顺序：rs10210252→rs11687800→rs3190

注2：只列出了频率＞1％的单倍型。