猫传染性鼻结膜炎和猫泛白细胞减少症二联冻干卵黄抗体及制备和应用的制作方法

本发明涉及兽医生物制药技术领域，尤其涉及一种猫传染性鼻结膜炎和猫泛白细胞减少症二联冻干卵黄抗体及制备和应用。

背景技术：

猫传染性鼻结膜炎是病毒性呼吸道疾病，由猫杯状病毒(felinecalicivirus，fcv)引起，主要症状为上呼吸道症状，即咳嗽、鼻炎、结膜炎、口腔溃疡，严重表现为肺炎和胃肠炎。该病具有高度传染性，主要感染1岁以内幼猫。猫传染性鼻结膜炎单独感染不会致死，但是感染后患猫免疫力下降，极易发生其他猫科上呼吸道病毒混合感染，会导致死亡率增高。

猫泛白细胞减少症又称猫传染性肠炎和猫瘟热，是一种急性高度接触性传染病，由猫泛白细胞减少症病毒(felinepanleukopeniavirus，fpv)引起。主要症状为突发高热、顽固性呕吐、腹泻、脱水，循环障碍及白细胞减少。该病具有高度传染性，主要感染1岁以内幼猫，发病率和死亡率高。

目前临床上，猫这两种疾病混合感染较多，混合感染后症状比较严重，主要采用注射疫苗进行预防，但是疫苗成分为抗原，其免疫方式为主动免疫，需要刺激机体产生抗体才能起到保护作用，所需要时间较长。对于未免疫群居猫如果其中一只猫发病，通过注射疫苗产生抗体已来不及对猫提供保护。而且疫苗的普及率很低，一旦感染国内外尚无特异性疗法。

目前猫患病后主要应用广谱抗生素防止继发感染和对症治疗，但是抗生素会通过破坏细胞壁干扰蛋白质合成，长时间使用会引起菌群失调，且不具备高度特异性，易产生耐药性，疗效并不显著。因此，开发一种针对猫传染性鼻结膜炎和猫泛白细胞减少症的特异性治疗药物，防止继发感染，降低发病率和死亡率，具有重要的现实意义。

技术实现要素：

本发明针对上述技术问题，提供一种猫传染性鼻结膜炎和猫泛白细胞减少症二联冻干卵黄抗体及其制备方法和应用。

为了实现上述目的，本发明提供的技术方案如下：

本发明提供了一种猫传染性鼻结膜炎和猫泛白细胞减少症二联冻干卵黄抗体的制备方法，该方法步骤包括由包含猫杯状病毒抗原和猫泛白细胞减少症病毒抗原的二联疫苗免疫蛋鸡并收集鸡蛋，当鸡蛋黄中fcv抗体效价不低于1:16且fpv抗体效价应不低于1:64时，采用酸稀释法对蛋黄进行抗体粗提，然后采用硫酸铵沉淀法进行抗体纯化，最后超滤浓缩除盐后，经冷冻真空干燥制成二联冻干卵黄抗体；该二联冻干卵黄抗体中的猫传染性鼻结膜炎病毒中和抗体效价不低于1:128，猫泛白细胞减少症病毒hi抗体效价不低于1:512。

优选地，上述猫传染性鼻结膜炎和猫泛白细胞减少症二联冻干卵黄抗体的制备方法中，猫杯状病毒抗原采用猫杯状病毒病毒样颗粒，且其含量不低于4mg/ml。

优选地，上述猫传染性鼻结膜炎和猫泛白细胞减少症二联冻干卵黄抗体的制备方法中，猫泛白细胞减少症病毒抗原采用猫泛白细胞减少症病毒病毒样颗粒，且其血凝效价不低于1:2¹⁴。

优选地，上述猫传染性鼻结膜炎和猫泛白细胞减少症二联冻干卵黄抗体的制备方法中，所述蛋鸡为海兰白蛋鸡或海兰褐蛋鸡。

优选地，上述猫传染性鼻结膜炎和猫泛白细胞减少症二联冻干卵黄抗体的制备方法中，蛋鸡免疫程序为三次免疫，一免剂量为1ml/只，二免剂量为1.5ml/只，三免剂量为2ml/只，免疫间隔10日；三免后6个月进行一次加强免疫，免疫剂量为2ml/只；采用腿部肌肉分点注射，每个注射点不超过1ml。

优选地，上述猫传染性鼻结膜炎和猫泛白细胞减少症二联冻干卵黄抗体的制备方法中，所述酸稀释法具体为：三免后15日开始收集鸡蛋，经蛋清蛋黄分离，蛋黄用水或者ph4.5～5.3的乙酸-乙酸钠缓冲液稀释7～10倍，2～8℃静置沉淀12～24小时，4000～5000r/min离心15～30分钟，取上清，上清ph调至6.5～7.0。

优选地，上述猫传染性鼻结膜炎和猫泛白细胞减少症二联冻干卵黄抗体的制备方法中，硫酸铵沉淀法为：对粗提上清液4000～5000r/min离心15～30分钟，取上清，用终浓度为25～40％的固体硫酸铵进行沉淀纯化，搅拌至硫酸铵完全溶解，2～8℃静置沉淀2～24小时，取沉淀，纯化次数为3次。

具体地，上述猫传染性鼻结膜炎和猫泛白细胞减少症二联冻干卵黄抗体的制备方法，包括以下步骤：

s1、利用昆虫细胞-杆状病毒表达系统生产猫传染性鼻结膜炎和猫泛白细胞减少症病毒样颗粒，将两种病毒样颗粒进行混合，使用β-丙内酯灭活后，添加防腐剂和佐剂制备二联基因工程疫苗，且混合前，猫杯状病毒病毒样颗粒含量不低于4mg/ml，猫泛白细胞减少症病毒血凝效价不低于1:2¹⁴；

s2、二联基因工程疫苗对120日龄蛋鸡进行三次免疫；一免剂量为1ml/只，二免剂量为1.5ml/只，三免剂量为2ml/只，免疫间隔10日；三免后6个月进行一次加强免疫，免疫剂量为2ml/只；腿部肌肉分点注射，每个注射点不超过1ml；

s3、三免后15日开始收集鸡蛋，经蛋清蛋黄分离，当蛋黄中fcv抗体效价不低于1:16且fpv抗体效价应不低于1:64时，收集的高免鸡蛋可以用于生产猫传染性鼻结膜炎和猫泛白细胞减少症二联冻干卵黄抗体；

s4、蛋黄用水或者ph4.5～5.3的乙酸-乙酸钠缓冲液稀释7～10倍，2～8℃静置沉淀12～24小时，4000～5000r/min离心15～30分钟，取上清，上清ph调至6.5～7.0，得到粗提上清液；

s4、对粗提上清液4000～5000r/min离心15～30分钟，取上清，用终浓度为25～40％的固体硫酸铵进行沉淀纯化，搅拌至硫酸铵完全溶解，2～8℃静置沉淀2～24小时，取沉淀，溶解于原体积的生理盐水中，搅拌至沉淀完全溶解，再重复纯化2次，取沉淀；

s5、将沉淀溶解于生理盐水中，搅拌至沉淀完全溶解，用30kd膜包超滤除盐至膜下液与2％氯化钡不产生白色沉淀为止，浓缩至猫传染性鼻结膜炎病毒中和抗体效价不低于1:128，猫泛白细胞减少症病毒hi抗体效价不低于1:512，0.22μm除菌过滤，得卵黄抗体原液，2～8℃无菌保存；

s6、卵黄抗体原液加入冻干保护剂，混合均匀，0.22μm滤器除菌过滤，无菌定量分装，悬盖两叉丁基胶塞，迅速进行冷冻真空干燥，冻干后压盖密封，水含量应不高于4.0％，即得到猫传染性鼻结膜炎和猫泛白细胞减少症二联冻干卵黄抗体。冻干保护剂例如终浓度为4％的右旋糖酐40和/或2.5％甘露醇，或者2～7％海藻糖、2～8％蔗糖、3～6％乳糖等。

本发明还提供了一种采用上述制备方法制备得到的猫传染性鼻结膜炎和猫泛白细胞减少症二联冻干卵黄抗体。

以及上述的猫传染性鼻结膜炎和猫泛白细胞减少症二联冻干卵黄抗体在制备快速治疗或紧急预防猫传染性鼻结膜炎和猫泛白细胞减少症药物方面的应用。

与现有技术相比，本发明的技术效果：

目前临床上治疗猫传染性鼻结膜炎和猫泛白细胞减少症基本采用广谱抗生素，但是抗生素会通过破坏细胞壁干扰蛋白质合成，长时间使用会引起菌群失调，且不具备高度特异性，易产生耐药性。而卵黄抗体相较于抗生素有其独特的优势，成分为免疫球蛋白igy，其作用机理为特异性的抗原抗体相结合，不会有耐药性发生，是抗生素最佳替代品之一。

临床上主要采用注射疫苗预防猫传染性鼻结膜炎和猫泛白细胞减少症，但是疫苗成分为抗原，其免疫方式为主动免疫，需要刺激机体产生抗体才能起到保护作用，所需要时间较长。对于未免疫群居猫如果其中一只猫发病，通过注射疫苗产生抗体已来不及对猫提供保护。而卵黄抗体属于被动免疫，可直接中和抑制消灭病原体，起效快，皮下注射后2小时能在血液中检测到相应抗体，适合作为快速治疗和紧急预防。

鸡距哺乳动物至少有1亿年的时间，因此相对于兔多克隆抗体来说，本发明用鸡生产抗哺乳动物组织成分的抗体时，可以用较少的抗原产生较多的抗体，且免疫蛋鸡卵黄中的igy滴度能长时间维持较高水平。兔多克隆抗体需从血清中获得，通过耳朵出血或心脏穿刺获得。卵黄抗体是从鸡蛋中提取，只需收集免疫蛋鸡产下的蛋即可获得抗体，对蛋鸡本身无损伤，符合动物福利和现代动物保护规则。此外，兔多克隆抗体纯化复杂，成本高。而卵黄抗体制备相对简单、消耗成本低、产量较高、性质稳定易储存，耐热、耐酸、巴氏灭菌温度下不失活，安全高效且无公害。

综上，本发明提供的猫传染性鼻结膜炎和猫泛白细胞减少症二联冻干卵黄抗体，可通过二联苗免疫蛋鸡直接制备，不伤害动物，工艺方法简单，成本低，得到的二联抗体效价高、稳定性好、见效快、不会产生耐药性，可应用于快速治疗或紧急预防猫传染性鼻结膜炎和猫泛白细胞减少症，保护率高。相比于疫苗和抗生素，具有更广泛、更实用的应用前景。

附图说明

为了更清楚地说明本申请实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明中记载的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明提供的猫泛白细胞减少症pcr鉴定图片；

图2为本发明提供的二联冻干卵黄抗体猫泛白细胞减少症血凝抑制检测结果；

图3为本发明提供的二联冻干卵黄抗体猫传染性鼻结膜炎细胞中和检测病变情况；

图4为本发明提供的猫传染性鼻结膜炎pcr鉴定图片；

图5为本发明提供的猫泛白细胞减少症疗效试验试纸条检测图片；

图6为本发明提供的猫泛白细胞减少症疗效试验剖检图片。

具体实施方式

为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面将结合附图对本发明作进一步的详细介绍。

实施例1猫传染性鼻结膜炎和猫泛白细胞减少症二联疫苗的制备

利用昆虫细胞-杆状病毒表达系统生产猫传染性鼻结膜炎和猫泛白细胞减少症病毒样颗粒(采用公开号为cn108371710a的方法)，将两种病毒样颗粒进行混合，使用β-丙内酯灭活后，添加防腐剂和佐剂制备成二联基因工程疫苗，且混合前，猫杯状病毒病毒样颗粒含量不低于4mg/ml，猫泛白细胞减少症病毒血凝效价不低于1:2¹⁴。

实施例2蛋鸡筛选

选用蛋鸡分为两组，分别为海兰白蛋鸡组和海兰褐蛋鸡。使用实施例1制备的二联基因工程疫苗对两组蛋鸡分别进行3次免疫，其免疫剂量分别为1ml/只，1.5ml/只，2ml/只，免疫间隔10日，腿部肌肉分点注射，每个注射点不超过1ml。三免后15日收集两组鸡蛋，每组鸡蛋随机抽取10枚，经蛋清蛋黄分离，蛋黄用ph5.0乙酸-乙酸钠缓冲液稀释10倍，过夜，4500r/min离心15分钟，取上清，上清ph调至6.5～7.0。提取卵黄抗体，采用细胞中和试验测定猫传染性鼻结膜炎病毒中和抗体效价，采用fpv微量血凝－血凝抑制(ha-hi)试验方法测定猫泛白细胞减少症病毒hi效价。如表1的结果显示，海兰褐蛋鸡组两种抗体水平均高于海兰白蛋鸡组，因此，我们选用海兰褐蛋鸡作为生产用蛋鸡。

表1蛋鸡筛选试验结果

当fcv抗体效价不低于1:16且fpv抗体效价应不低于1:64时，收集海兰褐蛋鸡组的高免鸡蛋，用于生产猫传染性鼻结膜炎和猫泛白细胞减少症二联冻干卵黄抗体。

实施例3二联冻干卵黄抗体的制备

将收集实施例2的高免鸡蛋消毒后，用分离器将蛋清蛋黄分离，蛋黄用10倍蛋黄体积的ph5.0乙酸-乙酸钠缓冲液稀释，搅拌至蛋黄完全溶解，2～8℃静置沉淀12小时。

第一次硫酸铵沉淀：将10倍酸稀释溶液4500r/min离心15分钟，取上清。上清用终浓度为33％固体硫酸铵对其进行第一次沉淀纯化，搅拌至硫酸铵完全溶解，2～8℃静置沉淀2小时。

第二次硫酸铵沉淀：将第一次硫酸铵沉淀溶液4500r/min离心15分钟，取沉淀。沉淀溶解于第一次沉淀原体积的生理盐水中，搅拌至沉淀完全溶解，用终浓度为33％固体硫酸铵对其进行第二次沉淀纯化，搅拌至硫酸铵完全溶解，2～8℃静置沉淀2小时。

第三次硫酸铵沉淀：将第二次硫酸铵沉淀溶液4500r/min离心15分钟，取沉淀。沉淀溶解于第二次沉淀原体积的生理盐水中，搅拌至沉淀完全溶解，用终浓度为33％固体硫酸铵对其进行第三次沉淀纯化，搅拌至硫酸铵完全溶解，2～8℃静置沉淀2小时。

超滤浓缩除盐：将第三次硫酸铵沉淀溶液4500r/min离心15分钟，取沉淀。沉淀溶解于第三次沉淀原体积的生理盐水中，搅拌至沉淀完全溶解，用30kd膜包超滤除盐至膜下液与2％氯化钡不产生白色沉淀为止，浓缩至猫传染性鼻结膜炎病毒中和抗体效价不低于1:128，猫泛白细胞减少症病毒hi抗体效价不低于1:512，0.22μm除菌过滤，2～8℃无菌保存。

卵黄原液用生理盐水稀释使猫传染性鼻结膜炎病毒中和抗体效价不低于1:128，猫泛白细胞减少症病毒hi抗体效价不低于1:512，按比例加入右旋糖酐40和甘露醇，使其终浓度分别为4％和2.5％，混合均匀，0.22μm滤器除菌过滤，无菌定量分装，悬盖两叉丁基胶塞，迅速进行冷冻真空干燥，冻干后压盖密封，水含量应不高于4.0％。

如图2所示，二联冻干卵黄抗体猫泛白细胞减少症血凝抑制可达到1:512。二联冻干卵黄抗体猫传染性鼻结膜炎细胞中和病变情况如图3所示，a为正常f81细胞，无细胞病变情况，b为fcv感染的f81，出现明显的细胞病变，表现为细胞圆缩、聚集成葡萄串样。

实施例4二联冻干卵黄抗体的制备

将收集实施例2的高免鸡蛋消毒后，用分离器将蛋清蛋黄分离，蛋黄用7倍蛋黄体积的ph4.8乙酸-乙酸钠缓冲液稀释，搅拌至蛋黄完全溶解，2～8℃静置沉淀24小时。

第一次硫酸铵沉淀：将7倍酸稀释溶液4000r/min离心30分钟，取上清。上清用终浓度为25％固体硫酸铵对其进行第一次沉淀纯化，搅拌至硫酸铵完全溶解，2～8℃静置沉淀24小时。

第二次硫酸铵沉淀：将第一次硫酸铵沉淀溶液4000r/min离心30分钟，取沉淀。沉淀溶解于第一次沉淀原体积的生理盐水中，搅拌至沉淀完全溶解，用终浓度为25％固体硫酸铵对其进行第二次沉淀纯化，搅拌至硫酸铵完全溶解，2～8℃静置沉淀24小时。

第三次硫酸铵沉淀：将第二次硫酸铵沉淀溶液4000r/min离心30分钟，取沉淀。沉淀溶解于第二次沉淀原体积的生理盐水中，搅拌至沉淀完全溶解，用终浓度为25％固体硫酸铵对其进行第三次沉淀纯化，搅拌至硫酸铵完全溶解，2～8℃静置沉淀24小时。

超滤浓缩除盐：将第三次硫酸铵沉淀溶液4000r/min离心30分钟，取沉淀。沉淀溶解于第三次沉淀原体积的生理盐水中，搅拌至沉淀完全溶解，用30kd膜包超滤除盐至膜下液与2％氯化钡不产生白色沉淀为止，浓缩至猫传染性鼻结膜炎病毒中和抗体效价不低于1:128，猫泛白细胞减少症病毒hi抗体效价不低于1:512，0.22μm除菌过滤，2～8℃无菌保存。

卵黄原液用生理盐水稀释使猫传染性鼻结膜炎病毒中和抗体效价不低于1:128，猫泛白细胞减少症病毒hi抗体效价不低于1:512，按比例加入右旋糖酐40和蔗糖，使其终浓度分别为4％和2％，混合均匀，0.22μm滤器除菌过滤，无菌定量分装，悬盖两叉丁基胶塞，迅速进行冷冻真空干燥，冻干后压盖密封，水含量应不高于4.0％。本实施例制备的二联冻干卵黄抗体猫泛白细胞减少症血凝抑制情况以及猫传染性鼻结膜炎细胞中和病变情况与实施例3制备的二联冻干卵黄抗体类似。

实施例5二联冻干卵黄抗体的制备

将收集实施例2的高免鸡蛋消毒后，用分离器将蛋清蛋黄分离，蛋黄用8倍蛋黄体积的ph5.3乙酸-乙酸钠缓冲液稀释，搅拌至蛋黄完全溶解，2～8℃静置沉淀24小时。

第一次硫酸铵沉淀：将8倍酸稀释溶液5000r/min离心20分钟，取上清。上清用终浓度为40％固体硫酸铵对其进行第一次沉淀纯化，搅拌至硫酸铵完全溶解，2～8℃静置沉淀12小时。

第二次硫酸铵沉淀：将第一次硫酸铵沉淀溶液5000r/min离心20分钟，取沉淀。沉淀溶解于第一次沉淀原体积的生理盐水中，搅拌至沉淀完全溶解，用终浓度为40％固体硫酸铵对其进行第二次沉淀纯化，搅拌至硫酸铵完全溶解，2～8℃静置沉淀12小时。

第三次硫酸铵沉淀：将第二次硫酸铵沉淀溶液5000r/min离心20分钟，取沉淀。沉淀溶解于第二次沉淀原体积的生理盐水中，搅拌至沉淀完全溶解，用终浓度为40％固体硫酸铵对其进行第三次沉淀纯化，搅拌至硫酸铵完全溶解，2～8℃静置沉淀12小时。

超滤浓缩除盐：将第三次硫酸铵沉淀溶液5000r/min离心20分钟，取沉淀。沉淀溶解于第三次沉淀原体积的生理盐水中，搅拌至沉淀完全溶解，用30kd膜包超滤除盐至膜下液与2％氯化钡不产生白色沉淀为止，浓缩至猫传染性鼻结膜炎病毒中和抗体效价不低于1:128，猫泛白细胞减少症病毒hi抗体效价不低于1:512，0.22μm除菌过滤，2～8℃无菌保存。

卵黄原液用生理盐水稀释使猫传染性鼻结膜炎病毒中和抗体效价不低于1:128，猫泛白细胞减少症病毒hi抗体效价不低于1:512，按比例加入右旋糖酐40和乳糖，使其终浓度分别为4％和3％，混合均匀，0.22μm滤器除菌过滤，无菌定量分装，悬盖两叉丁基胶塞，迅速进行冷冻真空干燥，冻干后压盖密封，水含量应不高于4.0％。

本实施例制备的二联冻干卵黄抗体猫泛白细胞减少症血凝抑制情况以及猫传染性鼻结膜炎细胞中和病变情况与实施例3制备的二联冻干卵黄抗体类似。

对比例二联血清抗体的制备

选用市售新西兰白兔，使用二联基因工程疫苗进行三次免疫，免疫剂量分别为1ml/只，免疫间隔14日，肌肉注射。三免后第10天采血收集血清，采用50％硫酸铵去除血清中白蛋白，然后用2次33％硫酸铵沉淀对抗体进行纯化，即得猫传染性鼻结膜炎和猫泛白细胞减少症二联血清抗体。采用细胞中和试验测定猫传染性鼻结膜炎病毒中和抗体效价，采用fpv微量血凝－血凝抑制(ha-hi)试验方法测定猫泛白细胞减少症病毒hi效价。猫传染性鼻结膜炎病毒中和抗体效价为1:32，猫泛白细胞减少症病毒hi抗体效价为1:512。

实验例1猫传染性鼻结膜炎的紧急预防试验

1、猫传染性鼻结膜炎的紧急预防试验

1.1方案

选取2～3月龄幼猫20只(fcv中和抗体效价不高于1:4)，随机分成4组，每组5只猫。分别为1组(攻毒对照组)、2组(血清抗体组)，3组(卵黄抗体组)和4组(空白对照组)。

2组猫皮下注射对比例制备的猫传染性鼻结膜炎和猫泛白细胞减少症二联血清抗体，剂量为1.5ml/kg；3组猫皮下注射实施例3制备的猫传染性鼻结膜炎和猫泛白细胞减少症二联冻干卵黄抗体，剂量为1.5ml/kg；1组猫和4组猫均皮下注射生理盐水，剂量为1.5ml/kg。24小时后，1组、2组和3组采用滴鼻方式感染fcv病毒(ch-jl2分离株，来自吉林农业大学动物科学技术学院)，滴鼻病毒效价为100tcid50，剂量为0.25ml/鼻孔；4组采用滴鼻方式感染mem培养基，剂量为0.25ml/鼻孔。4组试验猫隔离饲养，每日观察记录猫的状态，连续观察14天。采集鼻咽拭子作pcr检测。发病猫判定标准为rt-pcr检测结果为阳性且有典型的fcv感染症状(高热、口腔溃疡、呼吸系统症状)。

1.2结果

1.2.1临床症状

1组猫于攻毒后第3天开始出现临床症状，表现为口腔溃疡，体温升高，感染后第6天出现精神沉郁，呼吸困难。2组猫部分出现口腔溃疡，出现呼吸系统症状，在第8天有2只猫出现精神沉郁。3组猫部分出现饮食减少，口腔少量溃疡，呼吸有干啰音。4组猫未见异常表现。攻毒后第8天，1组猫死亡一只，攻毒后第11天，1组猫死亡2只，感染后13天，发病猫临床症状均有所好转。

1.2.2体温变化

1组猫体温在攻毒后第3天体温开始升高，第5天到达峰值，为40.2℃，组内一只猫最高体温为40.7℃，感染后8天体温恢复正常。2组猫攻毒后第有2只猫第4天体温升高，攻毒后第5天另外3只猫体温升高，第8天恢复正常。3组猫体温波动较大，其中有1只猫在第4天体温为39.8℃，第6天恢复正常范围，其中2只猫在第5天体温升高，第8天恢复正常。4组猫体温变化波动不太大。结果见表2。

表2猫传染性鼻结膜炎疗效试验体温情况

1.2.3fcvpcr检测结果

采集的鼻咽拭子经处理后，采用rt-pcr检测排毒结果，1组猫于攻毒后第5天均为阳性，并于攻毒后第8天死亡一只，第11天死亡2只，发病率100％，死亡率60％。2组猫于攻毒后第7天1猫为阳性，第8天2只猫为阳性，第11天死亡1只，发病率60％，死亡率20％。3组猫于攻毒后第9天1只猫为阳性，第10天1只猫为阳性，无死亡病例发生，发病率为40％，死亡率为0。4组猫检测均为阴性。结果见表3。

表3猫传染性鼻结膜炎疗效试验病毒检测情况

注：“+”代表阳性，“-”代表阴性，“×”代表死亡。

1.2.4pcr琼脂糖凝胶电泳结果

如图4所示，1为fcv阴性对照；2为dl2000marker；3为检测样品；4为fcv阳性对照；琼脂糖凝胶电泳表明，样品在fcv阳性对照(产物长度681bp)出现明显条带。

1.2.5结论

猫传染性鼻结膜炎疗效试验结果如表4所示，二联血清抗体对猫传染性鼻结膜炎紧急预防保护率为40％，二联卵黄抗体对猫传染性鼻结膜炎紧急预防保护率为60％。二联卵黄抗体保护率高于二联血清抗体。

表4猫传染性鼻结膜炎疗效试验结果

实验例2猫泛白细胞减少症的紧急预防试验

2.1方案

选取2～3月龄幼猫20只(fpvhi抗体效价不高于1:4)，随机分成4组，每组5只猫。分别为1组(攻毒对照组)、2组(血清抗体组)，3组(卵黄抗体组)和4组(空白对照组)。

2组猫皮下注射对比例制备的猫传染性鼻结膜炎和猫泛白细胞减少症二联血清抗体，剂量为1.5ml/kg；3组猫皮下注射实施例4制备的猫传染性鼻结膜炎和猫泛白细胞减少症二联冻干卵黄抗体，剂量为1.5ml/kg；1组猫和4组猫均皮下注射生理盐水，剂量为1.5ml/kg。24小时后，1组、2组和3组采用口服方式感染fpv病毒(jl3株，来自吉林农业大学动物科学技术学院)，剂量为1.5ml/只；4组口服mem培养基，剂量为1.5ml/只。4组猫隔离饲养，每日观察记录猫的状态，连续观察14日，并取粪便用试纸条检测是否有猫泛白细胞减少症病毒。发病猫判定标准为试纸条检测阳性且有典型的fpv感染症状。

2.2结果

2.2.1临床症状

1组猫于攻毒后第5天开始出现精神沉郁，排稀便、食欲减退等症状，第7天开始出现呕吐症状，并开始出现血便。2组猫部分猫表现为精神沉郁，排稀便，饮食欲减退，有2只出现呕吐症状，未出现血便。3组猫部分出现精神沉郁，排稀便，饮食欲减退，有一只出现呕吐症状，但均未出现血便。4组猫未见异常临床症状。攻毒后第8天，1组猫有1只死亡，攻毒后第9天，1组猫死亡2只，2组、3组和4组均未出现死亡情况。攻毒后13天，发病猫症状均有所好转，精神状态好转，饮食欲部分恢复。

2.2.2fpv试纸条检测结果

采集的粪便使用试纸条检测排毒结果。1组猫于攻毒后第5天有1只猫阳性，第6天剩下4只猫均为阳性，并于攻毒后第8天死亡1只，第9天死亡2只，发病率100％，死亡率60％。2组猫攻毒后第8天有2只猫检测阳性，无死亡病例发生，发病率40％，死亡率为0。3组猫攻毒后第8天有1只猫检测阳性，第10天有1只猫检测阳性，无死亡病例发生，发病率40％，死亡率为0。4组猫检测均为阴性，结果见表5。试纸条检测图如图5所示，图a为检测结果阳性图片，图b为检测结果阴性图片。

表5猫泛白细胞减少症疗效试验病毒检测情况

注：“+”代表阳性，“-”代表阴性，“×”代表死亡。

2.2.3病死猫剖检结果

对病死猫进行剖检，如图6所示，剖检可见典型的猫泛白细胞减少症出血性肠炎症状，肠道充血水肿，肠壁增厚似乳胶管样。

2.2.4猫泛白细胞减少症pcr鉴定结果

猫泛白细胞减少症pcr鉴定结果如图1所示，其中1为dl2000marker；2为检测样本；3为fpv阳性对照；4为fpv阴性对照。琼脂糖凝胶电泳表明，样品在fpv阳性对照(产物长度846bp)出现明显条带。

2.2.5结论

猫泛白细胞减少症疗效试验结果如表6所示，二联血清抗体对猫泛白细胞减少症紧急预防保护率为60％，二联卵黄抗体对猫泛白细胞减少症紧急预防保护率为60％。

表6猫泛白细胞减少症疗效试验结果

实验例3猫传染性鼻结膜炎和猫泛白细胞减少症的紧急预防试验

3.1方案

选取2～3月龄幼猫20只(fcv中和抗体效价不高于1:4且fpvhi抗体效价不高于1:4)，随机分成4组，每组5只猫。分别为1组(攻毒对照组)、2组(血清抗体组)，3组(卵黄抗体组)和4组(空白对照组)。

2组猫皮下注射对比例制备的猫传染性鼻结膜炎和猫泛白细胞减少症二联血清抗体，剂量为1.5ml/kg；3组猫皮下注射实施例5制备的猫传染性鼻结膜炎和猫泛白细胞减少症二联冻干卵黄抗体，剂量为1.5ml/kg；1组猫和4组猫均皮下注射生理盐水，剂量为1.5ml/kg。24小时后，1组、2组和3组同时感染fcv病毒(ch-jl2分离株，来自吉林农业大学动物科学技术学院)和fpv病毒(jl3株，来自吉林农业大学动物科学技术学院)。首先1组、2组和3组采用滴鼻方式感染fcv病毒，滴鼻病毒效价为100tcid50，剂量为0.25ml/鼻孔；4组采用滴鼻方式感染mem培养基，剂量为0.25ml/鼻孔。然后1组、2组和3组采用口服方式感染fpv病毒，剂量为1.5ml/只；4组口服mem培养基，剂量为1.5ml/只。

4组试验猫隔离饲养，每日观察记录猫的状态，连续观察14天。取粪便用fpvag试纸条进行检测，采集鼻咽拭子作fcvpcr检测。fcv发病猫判定标准为rt-pcr检测结果为阳性且有典型的fcv感染症状(高热、口腔溃疡、呼吸系统症状)且。fpv发病猫判定标准为试纸条检测阳性且有典型的fpv感染症状。

3.2结果

3.2.1临床症状

1组猫攻毒后第2天开始出现临床症状，表现为口腔出现溃疡，食欲减退，鼻分泌物增多。体温升高；第4天出现精神沉郁，排稀便，轻微呕吐；第5天出现血便，部分猫拒食拒水，剧烈呕吐；攻毒后第6天，1只猫死亡；攻毒后第7天2只猫死亡，攻毒后第8天，1只猫死亡。2组猫表现为口腔溃疡，有呼吸系统症状，打喷嚏，饮食欲减退，排稀便，体温升高，第6天出现精神沉郁情况，呕吐，出现血便。第8天一只猫死亡。3组猫表现为口腔少量溃疡，打喷嚏，鼻有少量分泌物，体温升高，排稀便，第7天部分猫出现精神沉郁，呕吐情况，有1只猫出现血便。未出现死亡情况。4组猫未见异常表现。攻毒后14天，部分发病猫症状均有所好转，精神状态好转，饮食欲部分恢复。

3.2.2体温变化

1组猫体温在攻毒后第2天开始升高，最高达到41.2。2组猫攻毒后第3天出现体温升高。3组猫有部分猫出现体温升高情况。4组猫体温变化波动不大，未见异常。详见表7。

表7猫传染性鼻结膜炎和猫泛白细胞减少症疗效试验体温情况

3.2.3fcvpcr结果

采集的鼻咽拭子经处理后，采用rt-pcr检测排毒结果。1组猫攻毒后第4天均为阳性。2组猫攻毒后5天2只猫阳性，第6日2只猫阳性。3组猫攻毒后第7天1只猫阳性，第9天1只猫阳性。4组猫检测均为阴性。详见表8。

表8猫传染性鼻结膜炎和猫泛白细胞减少症疗效试验fcvpcr结果

注：“+”代表阳性，“-”代表阴性，“×”代表死亡。

3.2.4fpvag试纸条检测结果

采集的粪便使用试纸条检测排毒情况。1组猫于攻毒后第4天有2只猫为阳性，第5日另外3只猫均为阳性；2组猫攻毒后第6天出现2只猫阳性，第7天出现1只猫阳性。3组猫攻毒后第7天1只猫阳性，第8天1只猫阳性。4组猫检测均为阴性。详见表9。

表9猫传染性鼻结膜炎和猫泛白细胞减少症疗效试验fpvag试纸条检测结果

注：“+”代表阳性，“-”代表阴性，“×”代表死亡。

3.2.5结论

在同时感染猫传染性鼻结膜炎病毒和猫泛白细胞减少症病毒的情况下，二联血清抗体对fcv的保护率为20％，fpv保护率为40％。而二联卵黄抗体对fcv和fpv保护率均为60％，明显优于二联血清抗体。详见表10。

表10猫传染性鼻结膜炎和猫泛白细胞减少症疗效试验结果

通过以上疗效试验，二联卵黄抗体紧急预防效果明显优于二联血清抗体。猫传染性鼻结膜炎和猫泛白细胞减少症二联冻干卵黄抗体可用于猫传染性鼻结膜炎和猫泛白细胞减少症的紧急预防，剂量为1.5ml/kg，保护率可达到60％。由此可知，本发明的猫传染性鼻结膜炎和猫泛白细胞减少症二联冻干卵黄抗体可用于猫传染性鼻结膜炎和猫泛白细胞减少症的快速治疗。相比于疫苗和抗生素，具有更广泛、更实用的应用前景。

以上只通过说明的方式描述了本发明的某些示范性实施例，毋庸置疑，对于本领域的普通技术人员，在不偏离本发明的精神和范围的情况下，可以用各种不同的方式对所描述的实施例进行修正。因此，上述附图和描述在本质上是说明性的，不应理解为对本发明权利要求保护范围的限制。