一种农杆菌介导的培育簸箕柳转基因植株的方法与流程

本发明涉及一种农杆菌介导的培育簸箕柳转基因植株的方法，属于植物基因工程技术领域。

背景技术：

杨柳科(salicaceae)分为杨属(populus)、柳属(salix)和钻天柳属(chosenia)。杨柳科中最大的属是柳属，世界约有520多种，主要分布在北半球温带，而柳属绝大多数为灌木柳，种植资源丰富，我国有257种122变种33变型，主要有簸箕柳(salixsuchowensis)、蒙古柳(s.linearistipularishao)、三蕊柳(s.triandravar.triandra)、毛枝柳(s.dasycladoswimm.)、谷柳(s.taraikensis)、杞柳(s.integra)、花叶杞柳(s.integra‘hakuronishiki’)、红皮柳(s.sinopurpurea)、北沙柳(s.psammophila)、银柳(s.argyracea)、黄花柳(s.caprea)、黄柳(s.gordejevii)、筐柳(s.linearistipularis)、二色柳(s.albertirgl.)、秦岭柳(s.alfrediigoerzexrehd.etkobuski)、华西柳(s.occidentali-sinensisn.chao)、皱纹柳(s.vestita)、乌柳(s.cheilophila)、五蕊柳(s.pentandra)、蒿柳(s.viminalis)、绵毛柳(s.erioclada)、褐毛柳(s.fulvopubescens)、毛柄柳(s.lasiopes)等。其中，簸箕柳主要分布地北起辽宁省中南部，向南至长江流域，东自山东半岛，西到甘肃省东南部。簸箕柳常为灌木，枝条无毛，黄绿色偶带紫色，叶互生或近对生，披针形或倒披针形，先花后叶，雌雄异株，柔荑花序。喜光，不耐蔽阴，好湿，稍耐盐碱地，在石灰质冲击土、半沙荒地上均可生长，根系发达，固土性能好，是巩固堤岸、防风出沙的良好树种，其萌发力强，生长迅速，实生苗和扦插苗在一般情况下1年就可开花。此外，簸箕柳种植资源丰富，自然变异丰富，与杨树相比，簸箕柳属小灌木，世代周期短，易于开展大规模田间试验，随着簸箕柳全基因组测序工作的完成，结合其特有的以上这些生物学特性，这一树种可以作为研究木本植物遗传转化体系理想的模式材料。

目前，簸箕柳的组织培养取得了较大进展，但还没有构建出稳定的遗传转化体系。迄今为止，林木转基因的研究已取得一定的进展。就转基因技术而言，农杆菌介导法应用最为广泛，此外，还有基因枪法、原生质体法、花粉管通道法、peg介导法、电激法等转化方法。目前，关于灌木柳遗传转化的研究鲜有报道。1989年，vahalat.等第一个尝试用农杆菌侵染蒿柳(s.viminalis)的茎段，得到抗性愈伤组织，并检测出外源基因成功导入，导入的外源基因可以抑制生根，但最终未获得转基因植株，尽管如此，这是灌木柳遗传转化研究过程的一项进步；1990年，c.a.maynard和rochas.p.采用叶盘法，选取六个菌株(c58、a281、a281[ptrk291]、a542、a348和a6048)对青冈柳(s.lucid)进行了农杆菌侵染，c58、a281、a281[ptrk291]这3种菌株产生愈伤和诱导生根，并且该愈伤组织可在不添加激素的基本培养基上继代三次仍保持旺盛的生活力，同年，z.xing等试验了带有nptii和gus报告基因的双元表达载体，通过农杆菌菌株lba4404对青冈柳(s.lucid)的茎段进行转化，共培养时加入悬浮细胞和野生型农杆菌菌株bo502，以wpm+6-ba(0.3mg/l)+zt(0.1mg/l)+naa(0.05mg/l)为培养基，获得4个抗性芽，检测其中1个为阴性，另外3个为嵌合体。三年后，z.xing等再次以青冈柳(s.lucid)的叶片为受体材料进行农杆菌介导，southern分析表明，产生的4种愈伤组织中有一种已经转化成功。综上，灌木柳遗传转化虽然有一些探索性发现，但稳定的遗传转化体系还未见报道，而簸箕柳稳定的遗传转化体系更是未见报道。

技术实现要素：

本发明的目的在于解决现有技术的不足，提供一种农杆菌介导的培育簸箕柳转基因植株的方法。

技术方案

一种农杆菌介导的培育簸箕柳转基因植株的方法，包括如下步骤：

(1)采集花枝：采集花枝在1月中下旬进行，取长度50-100cm，直径大于1cm的无病虫害、花芽饱满的柳树枝条，枝条底部剪成45°斜口；

(2)插条与培养：雌花枝先放置于20-30℃的生长室水培，隔3d后将雄花枝置于另一个同样温度的生长室水培，每隔两天换一次水；

(3)授粉：当雌花开放，柱头打开时，此时的雄花也陆续开放，将采集的新鲜雄花花粉涂到柱头上，剩余的花粉放于干燥器中保存；

(4)农杆菌介导花序：取携带pcambia-1305.1-3xha(带有内含子的gus)表达载体的农杆菌，制备农杆菌转化液，将其喷洒到授粉后8-24h的花序上进行侵染，24-26℃下暗培养2-3d后，进行光培养，收集种子；

(5)播种：将种子播种到培养基质上，培养基质由重量比为1:1的黄土和营养土组成，播种后第一天浇透水，其后每隔2d浇一次水；

(6)gus染色确定簸箕柳转基因植株：待簸箕柳长到4-6cm高之后，取叶片用gus染色液染色，叶片边缘染成蓝色的，对应的植株即为簸箕柳转基因植株。

进一步，步骤(4)中，所述农杆菌转化液的制备方法：

1)取携带pcambia-1305.1-3xha(带有内含子的gus)表达载体的农杆菌，划线接种在含有50mg/ml卡那霉素与20mg/ml利福平的固体lb平板上，放入28℃培养箱倒置培养48h；

2)从平板上挑取单克隆，接入5-10ml含有50mg/ml卡那霉素与20mg/ml利福平的液体lb中，在28℃摇床中培养24h，然后吸取1ml菌液接入100ml含有50mg/ml卡那霉素与20mg/ml利福平的液体lb中，放入28℃摇床培养24h，然后离心去上清，将得到的菌块用重悬液涡旋，得到农杆菌转化液；所述重悬液的制备方法：将5g蔗糖溶于100ml蒸馏水中，然后加入30μlsilwetl-77，混合均匀，即得。

进一步，步骤(4)中，所述侵染次数为3次，相邻两次间间隔2-3h，能进一步保证保证农杆菌能够侵入的花序内部。

进一步，步骤(5)中，所述进口营养土为德国hawita(维特)公司生产的德国维特育苗专用泥炭土，纤维长度为0-5mm，含量为70％白泥炭+30％黑泥炭+铁元素；含营养启动剂，ph为5.5-6.0，ec＝0.5。

进一步，步骤(6)中，叶片染色前，优选将叶片边缘剪掉，留有伤口更易于染色。

本发明的有益效果：本发明提供了一种农杆菌介导的培育簸箕柳转基因植株的方法，操作容易，转化效率高，可高达4.57％，克服了簸箕柳农杆菌转化困难的问题，为簸箕柳转基因新品种的开发奠定了基础，本发明方法还适用于其他灌木柳。

附图说明

图1为质粒载体pcambia-1305.1-3xha的物理图谱。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明。

下述实施例中，所述营养土为德国hawita(维特)公司生产的德国维特育苗专用泥炭土，纤维长度为0-5mm，含量为70％白泥炭+30％黑泥炭+铁元素；含营养启动剂，ph为5.5-6.0，ec＝0.5。但不限于此。

gus染色液的配制方法：

①x-gluc母液：称取10mg的x-gluc，用n,n-二甲基酰胺(dmf)配成10mg/ml

的贮存液，分装成每管100μl，放置在-20℃保存。

②磷酸钠缓冲液

a液：称取6.24gnah2po4·2h2o溶于100ml水中；

b液：称取14.34gna2hpo4·12h2o溶于100ml水中。

③x-gluc缓冲液

a液：39ml

b液：61ml

5mmk3[fe(cn)6]0.1646g

5mmk4[fe(cn)6]·3h2o0.2112g

10mmedta0.3722g

0.1％tritonx-100100μl

④gus染色液：50μlx-gluc母液+450μl缓冲液。

实施例1

一种农杆菌介导的培育灌木柳转基因植株的方法，包括如下步骤：

(1)采集花枝：采集花枝在1月中下旬进行，取长度50-100cm，直径大于1cm的无病虫害、花芽饱满的簸箕柳枝条，枝条底部剪成45°斜口；

(2)插条与培养：雌花枝先放置于20-30℃的生长室水培，隔3d后将雄花枝置于另一个同样温度的生长室水培，每隔两天换一次水；

(3)授粉：

当雌花开放，柱头打开时，此时的雄花也陆续开放，将采集的新鲜雄花花粉涂到柱头上，剩余的花粉放于干燥器中保存；

(4)农杆菌介导花序：

取携带pcambia-1305.1-3xha(带有内含子的gus)表达载体(质粒载体图谱见图1)的农杆菌，制备农杆菌转化液，将其喷洒到授粉后8h的花序上进行侵染(侵染次数为3次，相邻两次间间隔2h)，然后在25℃下暗培养3d后，进行光培养，7d后收集种子；

所述农杆菌转化液的制备方法：

1)取携带pcambia-1305.1-3xha(带有内含子的gus)表达载体的农杆菌，划线接种在含有50mg/ml卡那霉素与20mg/ml利福平的固体lb平板上，放入28℃培养箱倒置培养48h；

2)从平板上挑取单克隆，接入5-10ml含有50mg/ml卡那霉素与20mg/ml利福平的液体lb中，在28℃摇床中培养24h，然后吸取1ml菌液接入100ml含有50mg/ml卡那霉素与20mg/ml利福平的液体lb中，放入28℃摇床培养24h，然后离心去上清，将得到的菌块用重悬液涡旋，得到农杆菌转化液；所述重悬液的制备方法：将5g蔗糖溶于100ml蒸馏水中，然后加入30μlsilwetl-77，混合均匀，即得。

(5)播种：将种子播种到培养基质上，培养基质由重量比为1:1的黄土和进口营养土组成，播种后第一天浇透水，其后每隔2d浇一次水；

(6)gus染色确定簸箕柳转基因植株：待簸箕柳长到4-6cm高之后，取叶片，将叶片边缘剪掉后，用gus染色液染色，叶片边缘染成蓝色的，对应的植株即为簸箕柳转基因植株。

本实施例中，共选取了1230个叶片进行gus染色，染出蓝色叶片的52个，转化率为4.23％。

实施例2

步骤(4)中，制备农杆菌转化液，将其喷洒到授粉后24h的花序上进行侵染(侵染次数为3次，相邻两次间间隔2h)，其余与实施例1相同。

本实施例中，共选取了1025个叶片进行gus染色，染出蓝色叶片的48个，转化率为4.57％。

实施例3

步骤(4)中，制备农杆菌转化液，将其喷洒到授粉后12h的花序上进行侵染(侵染次数为2次，两次间间隔2h)，其余与实施例1相同。

本实施例中，共选取了1230个叶片进行gus染色，染出蓝色叶片的52个，转化率为4.23％。

对比例1

步骤(4)中，制备农杆菌转化液，将其喷洒到授粉后48h的花序上进行侵染(侵染次数为3次，相邻两次间间隔2h)，其余与实施例1相同。

对比例中，共选取了1405个叶片进行gus染色，染出蓝色叶片的6个，转化率为0.57％。

对比例2

用水代替步骤(4)中的农杆菌，其余与实施例1相同。

对比例中，共选取了1005个叶片进行gus染色，染出蓝色叶片的0个，转化率为0％。