一种NF1新突变致病基因及应用和试剂盒的制作方法

本发明属于生物技术中突变基因领域，涉及一种nf1新突变致病基因及应用和试剂盒。
背景技术：
：神经纤维瘤病1型(nf1)是一种以遗传性疾病为特征的遗传性疾病，患有nf1的个体患各种肿瘤的风险增加。nf1基因是1型神经纤维瘤(neurofibromatosistype1,nf1)患者生殖系中突变的抑癌基因，最常见的肿瘤包括神经纤维瘤、丛状神经纤维瘤、周围神经鞘恶性肿瘤和视神经胶质瘤；nf1的体细胞突变在癌症中很常见，包括黑色素瘤。nf1的特征是皮肤和眼睛的色素病变，包括多个皮肤神经纤维瘤、咖啡-au-lait斑、腋窝腹股沟雀斑、脉络膜雀斑和虹膜lisch结节。lisch结节是眼睛的黑素细胞错构瘤，在虹膜上表现为界限清楚的圆顶状丘疹，透明至黄色或棕色，其组织学上表现为黑素细胞聚集，并与梭形细胞和肥大细胞混合。目前尚未明确lisch结节导致的眼部并发症。不太常见但可能更严重的表现包括青光眼、视神经和其他中枢神经系统胶质瘤，恶性外周神经鞘瘤，脊柱侧凸，胫骨发育不良和血管病变。儿童每年的眼科检查是对于该疾病的监控手段之一，由熟悉该疾病的医生每年进行体检，对儿童进行定期发展评估。nf1患者的视神经胶质瘤通常在6岁之前出现视力下降，突眼或斜视[friedrich&nuding2016]。lisch结节几乎可以在所有成人和不到一半小于5岁的nf1儿童中中看到。[ragge等1993]。在标准眼科检查中无法看到脉络膜雀斑，但可以通过红外或近红外光扫描激光检眼镜，红外反射成像或光学相干断层扫描来观察脉络膜雀斑[vagge等2016]，其病理改变是雪旺细胞增殖排列在轴突周围的同心环中，发生在大多数所有年龄的nf1患者中，并随着年龄的增长而增多。nf1的罕见眼部表现包括视网膜血管增生性肿瘤[hood等人2009，shields等人2014]和新生血管性青光眼[elgi等人2010，chiu等人2011，alfreihi等人2013]。nf1的诊断通常基于临床发现，但这种疾病的表现是非常多变的，即使在一个家庭中也可以出现多种临床表现。所以需要结合nf1的分子遗传学检测来明确诊断。nf1遗传方式为常染色体显性遗传。半数受影响的个体由于一种新的nf1致病变异而具有nf1。受影响个体的后代有50％的风险遗传变异的nf1等位基因。nf1基因位于染色体17q11.2，全长为282751bp，包含58个外显子，编码2839个氨基酸，编码神经纤维瘤蛋白，负责调控ras蛋白转导信号。已经鉴定出数千种不同的nf1致病变异，包括错义/无义、剪接、小片段的插入/缺失、大片段的插入/缺失等各种突变类型，分布在整个编码区，大多数致病性变异是特定家族特有的。所以科研人员不遗余力的鉴定出每一个nf1致病变异的基因，以应用生物技术检测手段检查出nf1病变的可能性，及时的进行治疗干预，尽可能的减少患者视力衰退是当前科研人员迫不及待的心愿。技术实现要素：有鉴于此，本发明的目的在于提供一种nf1新突变致病基因，以便更加完善nf1致病变异基因，在临床发现前期能通过生物基因筛查手段更及时的发现nf1病变的可能性，及时的进行治疗干预，让患者早日康复。为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：1、一种nf1新突变致病基因，所述新突变致病基因的核酸样本与nf1基因如seqidno：1所示的核苷酸序列相比，核苷酸变化：c.738dela。进一步，所述突变致病基因的核酸样本指人工分离或合成的单链dna、双链dna、rna或dna与rna的聚合物。2、本发明还提供一种视网膜变性疾病的nf1新突变体多肽，所述多肽的氨基酸序列与seqidno：2所示的氨基酸序列相比，氨基酸变化：p.e247kfster34。进一步，所述多肽由权利要求1所述的基因编码的。3、本发明还提供一种nf1新突变致病基因在制备检测或筛选nf1病变的试剂盒中的应用。所述新突变致病基因的核酸样本与nf1基因如seqidno：1所示的核苷酸序列相比，核苷酸变化：c.738dela。4、本发明还提供一种筛选nf1病变的试剂盒，所述试剂盒包含检测nf1新突变致病基因的试剂，所述新突变致病基因与nf1基因如seqidno：1所示的核苷酸序列相比，具有核苷酸变化：c.738dela。进一步，所述试剂盒检测的核酸样本指人工分离或合成的单链dna、双链dna、rna或dna与rna的聚合物。进一步，所述检测nf1新突变致病基因的试剂是核酸探针。进一步，所述试剂盒还包括序列如seqidno：15和/或seqidno：16的引物。进一步，所述试剂盒还包括序列如seqidno：3-seqidno：94的一个或多个引物。进一步，所述检测nf1新突变致病基因的试剂是检测致病基因所编码的蛋白。进一步，所述蛋白的氨基酸与seqidno：2所示的氨基酸序列相比，具有p.e247kfster34突变。本发明的有益效果在于：本发明首次提供了nf1基因一个新的突变位点，与nf1野生型基因相比，核苷酸c.738dela位点突变，且与nf1疾病密切相关，并以此设计出直接检测该突变基因的试剂盒。本发明所提供了nf1基因一个新的突变位点更加完善nf1致病变异基因，为在临床发现前期能通过生物基因筛查手段更及时的发现nf1病变提供更多更有力的检测工具，能及时的进行治疗干预，让患者早日康复创造福音。本发明所提供了nf1基因一个新的突变位点，可以单独的开发直接检测该突变基因的试剂盒，也可以联合检测其他已知突变基因开发试剂盒。本发明所述的试剂盒可以直接通过一代测序，减少繁琐程序，跳过高通量筛选，直接针对目的基因外显子全长测序，也可以直接针对28号外显子测序。本发明所提供的引物设计，pcr扩增加上一代测序对基因外显子突变进行检测，操作简单，技术成熟，成本极低，不受突变大小(20bp)影响，可对外显子纯合缺失及大片断缺失插入进行检测。附图说明为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：图1为患者面部、胸部和腹部的牛奶咖啡斑，其中上图为患者胸部牛奶咖啡斑图，下图为患者腹部牛奶咖啡斑图。图2为患者眼科检查结果，其中a和b分别为患者左眼和右眼眼底彩照，c和d分别为患者左眼和右眼nir双眼近红外光眼底扫描。图3为该患者右眼九方位眼底彩照和眼底血管荧光造影检查图。图4为该患者父亲眼科检查结果，其中a和b分别为患者父亲左眼和右眼眼底彩照，眼底彩照显示双眼眼底未见明显异常；图4中c和d分别为患者父亲左眼和右眼nir，nir显示双眼后极部和中周部视网膜多灶团状和斑块状强反射。图5为患者父亲背部照片。图6为患者外显子8一代测序部分结果。图7为该患者父亲在外显子8位点的验证。图8为该患者母亲在外显子8位点的验证。图9为该患者家系图，其中m为突变体，n为野生型。具体实施方式下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。实施例1获取生物样品2018年，门诊收取一患者，临床表型为：新生血管性青光眼，视网膜血管增生性肿瘤，皮肤有牛奶咖啡斑，临床怀疑神经纤维瘤病1型。父亲及外婆皮肤有牛奶咖啡斑，视力正常，母亲和妹妹表型正常，样本为疾病患者及其父母的外周静脉血。所有参与本发明研究的家系成员均签署了知情同意书。(男孩，年龄7岁，(2011年)，父亲，年龄32岁，(1986年)；母亲：年龄29岁(1990年)；妹妹：年龄，4岁(2015)；外婆：57岁，(1962年)。该患者面部、胸部和腹部均有大小不等的牛奶咖啡斑，如图1所示，其中上图为患者胸部牛奶咖啡斑图，下图为患者腹部牛奶咖啡斑图。图2为该患者眼科检查结果，其中a和b分别为患者左眼和右眼眼底彩照，患者眼底彩照显示左眼眼底未见明显异常，患儿右眼因玻璃体浑浊眼底图像显示不清。图2中c和d分别为患者左眼和右眼nir双眼近红外光眼底扫描(near-infraredreflectance,nir)，显示左眼后极部和中周部视网膜多灶团状和斑块状强反射，右眼显示不清。图3为该患者右眼九方位眼底彩照和眼底血管荧光造影检查图，如图3左边图所示，右眼颞上方周边视网膜见灰白色斑块状结节样改变，融合成片，边界不清，其间隐约见形态异常血管。如图3右边图所示，ffa(眼底血管荧光造影)显示右眼颞上方周边部分视网膜血管轻微扩张，后期部分管壁荧光染色。图4为该患者父亲眼科检查结果，其中a和b分别为患者父亲左眼和右眼眼底彩照，眼底彩照显示双眼眼底未见明显异常；图4中c和d分别为患者父亲左眼和右眼nir，nir显示双眼后极部和中周部视网膜多灶团状和斑块状强反射。该患者父亲全身皮肤散在斑块状及椒盐状色素沉着改变(咖啡斑)，面部、颈部和背部均有，涉及患者隐私，只显示该患者父亲背部照片，如图5所示。实施例2dna提取利用高盐沉淀法提取各血液样本中基因组dna，利用分光光度计测量dna的浓度及纯度，所得的每个标本基因组dna的od260/od280均位于1.7-2.0之间，浓度不少于200ng/微升，总量不少于30微克。实施例3引物设计及pcr反应参考人类基因组序列数据库，设计得nf1基因1-58号外显子序列分别对应的pcr特异性引物对，具体内容如表1所示，1-58号外显子所对应的序列如表2所示。表1nf1基因1-58号外显子序列分别对应的pcr特异性引物对表21-58号外显子所对应的基因接着，分别按照以下配比配制各基因组dna样本的pcr反应体系以及进行pcr反应，其中pcr使用的promga品牌的gogreenmastermix，lot号000242981。按照表1针对nf1基因1-58号外显子序列，按表3配比分别配制各基因组dna样本的各pcr反应体系，pcr反应体系为40ul。按照表1针对nf1基因1-58号外显子序列，按表3配比分别配制各基因组dna样本的各pcr反应体系，pcr反应体系为40ul。表3：pcr反应体系(40ul)再将以上配置好的各反应体系按照表4的反应条件进行pcr反应。表4：pcr程序实施例4sanger法测序验证将所获得的pcr扩增产物直接进行sanger法测序验证。pcr产物纯化：实施例3中得到的pcr产物经1％的琼脂糖凝胶电泳，160v,40-60min。紫外透射仪下割下目的条带。切取的胶块质量应小于3g，于96孔板中按照胶块质量：buffergl＝1:3加入buffergl,盖上封口膜，65℃水浴12min，揭开封口膜，用连续加液器每孔加入100μl已经混匀的磁珠，磁珠吸附目的dna。在磁力的作用下固定磁珠，eluent或无菌水洗脱磁珠表面上目的dna。目的条带于96孔pcr板中进行测序pcr扩增：测序反应pcr：采用正向或反向引物扩增表4：测序pcr反应体系(5ul)bdt(bdt原液:5xbuffer＝1:3)1ul正向/反向引物(10p)1uldna模板(200ng/μl)2ulddh2o1ul(addupto5ul)表5：pcr程序测序扩增后的产物移至abi3730测序仪，测序分析。使用codoncodealigner软件读取测序峰图，并将测序结果与参考序列比对。结果如下：患者及患者父亲发现了核苷酸变异：738dela，导致后面的序列移码，对应氨基酸变化：p.e247kfster34。患者母亲核苷酸没有突变，为野生型。图6为患者外显子8一代测序部分结果，其中在序列510位(核苷酸738位)碱基a丢失，由正常序列gcaga变为gc_ga。图7为该患者父亲在外显子8位点的验证；父亲验证在510位(核苷酸738位)碱基a丢失，由正常序列gcaga变为gc_ga。图8为该患者母亲在外显子8位点的验证；母亲验证在510位(核苷酸738位)为野生型。图9为该患者家系图，其中m为突变体，n为野生型。此方法可直接通过一代测序，直接针对目的基因外显子全长测序，能清楚知道外显子的情况，继而清楚nf1基因的突变情况可能导致的病变，简单直接有效。最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。序列表<110>中国人民解放军陆军军医大学第一附属医院<120>一种nf1新突变致病基因及应用和试剂盒<160>2<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>12381<212>dna<213>homosapiens<400>1aatctctagctcgctcgcgctccctctccccgggccgtggaaaggatcccacttccggtg60gggtgtcatggcggcgtctcggactgtgatggctgtggggagacggcgctagtggggaga120gcgaccaagaggccccctcccctccccgggtccccttcccctatccccctccccccagcc180tccttgccaacgccccctttccctctccccctcccgctcggcgctgaccccccatcccca240cccccgtgggaacactgggagcctgcactccacagaccctctccttgcctcttccctcac300ctcagcctccgctccccgccctcttcccggcccagggcgccggcccacccttccctccgc360cgccccccggccgcggggaggacatggccgcgcacaggccggtggaatgggtccaggccg420tggtcagccgcttcgacgagcagcttccaataaaaacaggacagcagaacacacatacca480aagtcagtactgagcacaacaaggaatgtctaatcaatatttccaaatacaagttttctt540tggttataagcggcctcactactattttaaagaatgttaacaatatgagaatatttggag600aagctgctgaaaaaaatttatatctctctcagttgattatattggatacactggaaaaat660gtcttgctgggcaaccaaaggacacaatgagattagatgaaacgatgctggtcaaacagt720tgctgccagaaatctgccattttcttcacacctgtcgtgaaggaaaccagcatgcagctg780aacttcggaattctgcctctggggttttattttctctcagctgcaacaacttcaatgcag840tctttagtcgcatttctaccaggttacaggaattaactgtttgttcagaagacaatgttg900atgttcatgatatagaattgttacagtatatcaatgtggattgtgcaaaattaaaacgac960tcctgaaggaaacagcatttaaatttaaagccctaaagaaggttgcgcagttagcagtta1020taaatagcctggaaaaggcattttggaactgggtagaaaattatccagatgaatttacaa1080aactgtaccagatcccacagactgatatggctgaatgtgcagaaaagctatttgacttgg1140tggatggttttgctgaaagcaccaaacgtaaagcagcagtttggccactacaaatcattc1200tccttatcttgtgtccagaaataatccaggatatatccaaagacgtggttgatgaaaaca1260acatgaataagaagttatttctggacagtctacgaaaagctcttgctggccatggaggaa1320gtaggcagctgacagaaagtgctgcaattgcctgtgtcaaactgtgtaaagcaagtactt1380acatcaattgggaagataactctgtcattttcctacttgttcagtccatggtggttgatc1440ttaagaacctgctttttaatccaagtaagccattctcaagaggcagtcagcctgcagatg1500tggatctaatgattgactgccttgtttcttgctttcgtataagccctcacaacaaccaac1560actttaagatctgcctggctcagaattcaccttctacatttcactatgtgctggtaaatt1620cactccatcgaatcatcaccaattccgcattggattggtggcctaagattgatgctgtgt1680attgtcactcggttgaacttcgaaatatgtttggtgaaacacttcataaagcagtgcaag1740gttgtggagcacacccagcaatacgaatggcaccgagtcttacatttaaagaaaaagtaa1800caagccttaaatttaaagaaaaacctacagacctggagacaagaagctataagtatcttc1860tcttgtccatggtgaaactaattcatgcagatccaaagctcttgctttgtaatccaagaa1920aacaggggcccgaaacccaaggcagtacagcagaattaattacagggctcgtccaactgg1980tccctcagtcacacatgccagagattgctcaggaagcaatggaggctctgctggttcttc2040atcagttagatagcattgatttgtggaatcctgatgctcctgtagaaacattttgggaga2100ttagctcacaaatgcttttttacatctgcaagaaattaactagtcatcaaatgcttagta2160gcacagaaattctcaagtggttgcgggaaatattgatctgcaggaataaatttcttctta2220aaaataagcaggcagatagaagttcctgtcactttctccttttttacggggtaggatgtg2280atattccttctagtggaaataccagtcaaatgtccatggatcatgaagaattactacgta2340ctcctggagcctctctccggaagggaaaagggaactcctctatggatagtgcagcaggat2400gcagcggaacccccccgatttgccgacaagcccagaccaaactagaagtggccctgtaca2460tgtttctgtggaaccctgacactgaagctgttctggttgccatgtcctgtttccgccacc2520tctgtgaggaagcagatatccggtgtggggtggatgaagtgtcagtgcataacctcttgc2580ccaactataacacattcatggagtttgcctctgtcagcaatatgatgtcaacaggaagag2640cagcacttcagaaaagagtgatggcactgctgaggcgcattgagcatcccactgcaggaa2700acactgaggcttgggaagatacacatgcaaaatgggaacaagcaacaaagctaatcctta2760actatccaaaagccaaaatggaagatggccaggctgctgaaagccttcacaagaccattg2820ttaagaggcgaatgtcccatgtgagtggaggaggatccatagatttgtctgacacagact2880ccctacaggaatggatcaacatgactggcttcctttgtgcccttgggggagtgtgcctcc2940agcagagaagcaattctggcctggcaacctatagcccacccatgggtccagtcagtgaac3000gtaagggttctatgatttcagtgatgtcttcagagggaaacgcagatacacctgtcagca3060aatttatggatcggctgttgtccttaatggtgtgtaaccatgagaaagtgggacttcaaa3120tacggaccaatgttaaggatctggtgggtctagaattgagtcctgctctgtatccaatgc3180tatttaacaaattgaagaataccatcagcaagttttttgactcccaaggacaggttttat3240tgactgataccaatactcaatttgtagaacaaaccatagctataatgaagaacttgctag3300ataatcatactgaaggcagctctgaacatctagggcaagctagcattgaaacaatgatgt3360taaatctggtcaggtatgttcgtgtgcttgggaatatggtccatgcaattcaaataaaaa3420cgaaactgtgtcaattagttgaagtaatgatggcaaggagagatgacctctcattttgcc3480aagagatgaaatttaggaataagatggtagaatacctgacagactgggttatgggaacat3540caaaccaagcagcagatgatgatgtaaaatgtcttacaagagatttggaccaggcaagca3600tggaagcagtagtttcacttctagctggtctccctctgcagcctgaagaaggagatggtg3660tggaattgatggaagccaaatcacagttatttcttaaatacttcacattatttatgaacc3720ttttgaatgactgcagtgaagttgaagatgaaagtgcgcaaacaggtggcaggaaacgtg3780gcatgtctcggaggctggcatcactgaggcactgtacggtccttgcaatgtcaaacttac3840tcaatgccaacgtagacagtggtctcatgcactccataggcttaggttaccacaaggatc3900tccagacaagagctacatttatggaagttctgacaaaaatccttcaacaaggcacagaat3960ttgacacacttgcagaaacagtattggctgatcggtttgagagattggtggaactggtca4020caatgatgggtgatcaaggagaactccctatagcgatggctctggccaatgtggttcctt4080gttctcagtgggatgaactagctcgagttctggttactctgtttgattctcggcatttac4140tctaccaactgctctggaacatgttttctaaagaagtagaattggcagactccatgcaga4200ctctcttccgaggcaacagcttggccagtaaaataatgacattctgtttcaaggtatatg4260gtgctacctatctacaaaaactcctggatcctttattacgaattgtgatcacatcctctg4320attggcaacatgttagctttgaagtggatcctaccaggttagaaccatcagagagccttg4380aggaaaaccagcggaacctccttcagatgactgaaaagttcttccatgccatcatcagtt4440cctcctcagaattcccccctcaacttcgaagtgtgtgccactgtttataccaggtggtta4500gccagcgtttccctcagaacagcatcggtgcagtaggaagtgccatgttcctcagattta4560tcaatcctgccattgtctca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