人类MTHFR基因多态性检测试剂盒的制作方法

本发明涉及生物技术领域，具体涉及人类mthfr基因c677t位点和a1298c位点多态性检测试剂盒及其制备方法与应用。

背景技术：

叶酸是一种水溶性的b族维生素(维生素b9)，它不存在于自然界中也无生物活性，但为具有生物活性的叶酸盐(folate)的前体，其在体内的活性形式是5-甲基四氢叶酸，能传递一碳基团(甲基或甲酰)给脱氧尿苷酸，使之变为脱氧胸苷酸，进而合成dna，是合成核酸所必须的元素，是细胞生长和组织修复所必需的物质，更是胚胎发育过程中不可缺少的营养素。近年来大量研究已经证实，叶酸是胎儿生长发育不可缺少的营养素，有助于预防神经管缺陷，包括脊柱裂和无脑儿等非常严重的出生缺陷的发生。叶酸的临床功能除了预防胎儿神经管缺陷外，还能降低孕妇妊娠高血压、自发性流产和胎儿宫内发育迟缓、早产以及新生儿低体重、唇腭裂、心脏缺陷等发病率。

亚甲基四氢叶酸还原酶(methylenetetrahydrofolateredμctase,mthfr)是细胞内叶酸平衡和代谢的关键酶，在嘌呤和胸腺嘧啶存在的条件下不可逆催化5-甲酸基四氢叶酸合成5-甲基四氢叶酸，后者参与dna的合成与甲基化作用。mthfr基因常见的突变有两种：677位点c/t多态性与1298位点a/c多态性。其中，c677t位点是到目前为止发现的mthfr最为常见的突变位点，在中国的发生率为45.2％。研究表明，677位点由c突变为t后，其编码的丙氨酸被缬氨酸替代，导致mthfr酶的热稳定性与酶活性降低，进而会使同型半胱氨酸(hcy)代谢受阻，在体内积聚引起高同型半管氨酸血症。高同型半管氨酸血症与多发性流产、子痫前期、胎盘早剥、胎儿生长受限、胎儿畸形、死胎有关，且与早产密切相关。另外，1298位点a变为c后，谷氨酸被丙氨酸取代，同样使mthfr的酶活性下降，引起血浆同型半胱氨酸水平的升高和叶酸水平的降低，该位点在中国突变的频率高达18.6％。在使用甲氨蝶呤抑制二氢叶酸还原酶的活性时，如果患者存在该变异，将造成严重的毒副反应。因此mthfr基因多态性的检测对于个体化合理用药具有重要的指导意义。

目前对基因突变和基因多态性的检测，常见的有高分辨熔解曲线分析技术(hrm法)、直接测序法、dna芯片技术、pcr-rflp法、taqman探针法等。由于高分辨率溶解曲线法对设备要求比较特殊，在临床推广存在一定的困难；pcr-pflp技术依赖限制性内切酶消化、电泳分析等原因，往往出现结果误判现象，影响其检测准确率，另外其检测周期长、通量较低，亦不适用于大量人群的快速筛选。作为基因检测金标准的dna直接测序法，由于其费用较低，但操作耗时长且灵敏度低，难以实现大规模推广。dna芯片技术由于高通量、操作简便快速等优点在snp检测中得到大量应用，但该技术成本昂贵、复杂、重复性差、灵敏度低，不利于大规模推广。荧光定量pcr-taqman探针法采用荧光淬灭及双末端标记技术，针对snp位点变异设计特异性的探针灵敏度高、准确性强，2-3个小时内即可得出结果，因此得到大规模运用和推广。

技术实现要素：

本发明的目的在于，克服现有技术的不足，提供单管反应同时检测人类mthfr基因c677t位点和a1298c位点多态性的试剂盒，从对样本核酸的提取到给出检测结果，只需要2～3小时，同时还具有结果判读简单，检测通量大，检测成本低的优点。因此可在一般的分子实验室和医院检验科完成相应的检测；在临床检验进行使用，可大大增加临床诊断的准确性，缩短患者就医的时间，也可医疗保健系统成本降低。

本发明的一种基于taqman探针法的单核苷酸多态性检测方法，包括：

(1)在同一pcr扩增体系中，设计两对低退火温度的富集引物，能通过pcr对分别包含677和1298两个snps位点目标靶模板进行扩增，其退火温度为45～55℃，所述富集引物的核苷酸序列如seqidno.14和seqidno:15所示；

(2)在同一pcr扩增体系中，设计2组特异性引物序列，利用这两组特异性引物，进行对677和1298两个snps位点基因型进行位点特异性区分的as-pcr扩增；特异性引物的核苷酸序列如seqidno.1-6所示；

(3)在同一pcr扩增体系中，设计2组snp特异性探针来特异性检测目的模板，所述2组特异性探针的核苷酸序列分别为seqidno:7与seqidno:8，seqidno:9与seqidno:10，且所述特异性探针的5’端修饰分别为fam与hex，cy3与cy5，3’端修饰有nfq-mgb；

(4)在同一pcr扩增体系中，同时引入内标系统和ung酶防污染系统，能更加准确、稳定地对样品进行分型检测。

(5)优选的，本发明引入的内标系统为保守的gapdh基因，设计的内标探针5’端修饰为rox，3’端修饰有nfq-mgb。

本发明人类mthfr基因多态性检测试剂盒涉及到的序列表如下：

seqidno:15’-tctgcgggagccgatttca-3’

seqidno:25’-tctgcgggagtcgatttca-3’

seqidno:35’-caaagcggaagaatgtgtca-3’

seqidno:45’-agctgaccagtgaagaaagtgt-3’

seqidno:55’-agctgaccagtgaagcaagtgt-3’

seqidno:65’-gaaccagggtccccactccag-3’

seqidno:75’-fam-tgcgggagccgatttca-nfq-mgb-3’

seqidno:85’-hex-tgcgggagtcgatttca-nfq-mgb-3’

seqidno:95’-cy3-cagtgaagaaagtgtctttga-nfq-mgb-3’

seqidno:105’-cy5-cagtgaagcaagtgtctttga-nfq-mgb-3’

seqidno:115’-catcgctcagacaccatgg-3’

seqidno:125’-gcaaggctcgtagacgcggttc-3’

seqidno:135’-rox-tcggagtcaacgggtgagtt-nfq-mgb-3’

seqidno:145’-cagcctctcctgactgtcatc-3’

seqidno:155’-gagcaagtcccccaaggag-3’

本发明基于taqman探针法，采用arms引物特异性扩增目的模板与snp探针特异性检测目的模板方法，建立了在同一反应管检测同一基因两种不同多态性的多重荧光定量pcr检测方法，同时引入内标系统和ung酶防污染系统，其中ung(μracil-n-glycosylase)酶为尿嘧啶-n-糖基化酶，其特点是最佳活性温度为50℃，95℃灭活，其作用原理是选择性水解断裂含有du的双链或单链dna中的尿嘧啶糖苷键，形成的有缺失碱基的dna链。在pcr反应中，使用ung酶可预防非特异性pcr扩增和污染，为特异性检测同一基因两种多态性提供双重保证。

附图说明

图1为677c/c1298a/a纯合野生样本；

图2为677c/c1298a/c杂合突变样本；

图3为677c/t1298a/c杂合突变样本；

图4为677c/t1298a/a杂合突变样本；

图5为677t/t1298a/a纯合突变样本；

图6为677t/t1298c/c纯合突变样本。

具体实施方式

为了使本发明要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

荧光定量pcr仪：lightcycler480(罗氏公司，巴塞尔，瑞士)、abi7500(美国应用生物系统公司，纽约，美国)、abi7500fast(美国应用生物系统公司，纽约，美国)、abi7900htfast(美国应用生物系统公司，纽约，美国)、qiagenrotor-gene6000(德国qiagen公司，杜塞尔多夫，德国)、idaholightscanner(美国idaho公司，爱达荷州，美国)。

dna聚合酶：abi(美国)，takara(日本)。

本发明为同时检测人类mthfr基因677和1298两个snps位点的多态性设计了2组特异性引物，其中，所述特异性引物的核苷酸序列如seqidno.1-6所示。2组arms特异性引物在3’末端碱基分别与待扩增类型的碱基配对，同时在其3’末端倒数第2-3位引入一个或者两个碱基错配，以增强扩增时的特异性。

各特异性引物序列列举如下：

677carms引物：5’-tctgcgggagccgatttca-3’

677tarms引物：5’-tctgcgggagtcgatttca-3’

677下游引物：5’-caaagcggaagaatgtgtca-3’

1298aarms引物：5’-agctgaccagtgaagaaagtgt-3’

1298carms引物：5’-agctgaccagtgaagcaagtgt-3’

1298下游引物：5’-gaaccagggtccccactccag-3’

本发明为同时检测人类mthfr基因677和1298两个snps位点的多态性还设计了2组特异性探针，特异性探针的5’端修饰分别为fam、hex、cy3和cy5，3’端修饰有nfq-mgb。该基团本身不产生荧光，因此可以大大降低本底信号的强度，同时该特异性探针上还连接有mgb修饰基团，可以将该探针的tm值提高10℃左右，因此同样的tm值，mgb探针可以比普通taqman探针设计的更短，使得探针在识别具有单个核苷酸多态性位点时，特异性更强。

优选地，所述2组特异性探针的核苷酸序列分别为seqidno:7与seqidno:8，seqidno:9与seqidno:10

各探针序列列举如下：

677c检测探针5’-fam-tgcgggagccgatttca-nfq-mgb-3’

677t检测探针5’-hex-tgcgggagtcgatttca-nfq-mgb-3’

1298a检测探针5’-cy3-cagtgaagaaagtgtctttga-nfq-mgb-3’

1298c检测探针5’-cy5-cagtgaagcaagtgtctttga-nfq-mgb-3’

在本发明的一种实施方式中，使用内标系统监测该荧光定量pcr反应是否存在抑制、仪器误差以及人为因素造成的假阴性结果。由于待检测的样品中的某些成分可能含有导致pcr出现部分或完全抑制；扩增仪可能存在高于允许范围的孔间差，导致不同管间扩增效率差异；人为加样错误也可能导致假阴性结果的出现，因此本发明实施例中采用内标系统来消除上述隐患，保证了检测结果的准确性。该内标系统优选包含内标引物、内标探针。

优选地，所述内标系统包含内标引物和内标探针。所述内标引物是针对人类基因组中相对保守的基因gapdh基因的保守区域设计的，其核苷酸序列如seqidno:11和seqidno:12所示，所述内标探针序列为seqidno:13；所述内标探针5’端修饰有rox，3’端修饰有nfq-mgb。

内标正向引物f：5’5’-catcgctcagacaccatgg-3’

内标反向引物r：5’-gcaaggctcgtagacgcggttc-3’

内标探针5’-rox-tcggagtcaacgggtgagtt-nfq-mgb-3’优选地，本发明的检测试剂盒还包括阳性标准对照品和阴性对照品，设置阳性标准对照品和阴性对照品可监测实时定量pcr反应的正常进行，所述阳性对照品中含有本发明中涉及的mthfr基因两种多态性mthfr677、mthfr1298和gapdh基因的5种质粒混合液；所述阴性对照品为无菌水。

本发明实施例的另一目的在于提供一种同时检测人类mthfr和mtrr基因多态性的方法，该法包括以下步骤：

(1)获得待测样品基因组dna；

(2)利用所述特异性引物、特异性探针、内标系统、富集引物、pcr反应缓冲液、taq酶、ung酶等进行荧光定量pcr反应，单一反应管即可同时检测每个样品的mthfr基因c677t位点和a1298c多态性。

优选地，以25μl反应体系为例，向反应管中加入待检测样品后得到的混合物中各组分终浓度及含量如表1：

上述体系仅为例证性，在实际应用中可以按照比例扩大或缩小该混合物体积及其中各组分含量。

具体地，所述荧光定量pcr反应的程序为：

第一步：50℃2min，95℃10min；

第二步：95℃15s，45℃～55℃1min，5个循环；

第三步：95℃15s，58℃～62℃1min，40个循环；

且在第三阶段58℃～62℃时采集探针所对应通道fam、hex、cy3、cy5、rox的荧光信号；

程序运行完毕，将pcr薄壁反应管或八联管取出放入凹凸袋，将封口封严，按污染源处理。

优选的，所述荧光定量pcr反应的程序为：

第一步：50℃2min，95℃10min；

第二步：95℃15s，48℃～53℃1min，5个循环；

第三步：95℃15s，60℃～62℃1min，40个循环；

且在第三阶段60℃～62℃时采集探针所对应通道fam、hex、cy3、cy5、rox的荧光信号；

程序运行完毕，将pcr薄壁反应管或八联管取出放入凹凸袋，将封口封严，按污染源处理。

在上述pcr反应后，所得结果按表2进行结果判定：

以下通过具体实施例对本发明进一步阐述。

实施例1

1、引物及探针合成：

设计并合成2组特异性引物seqidno:1、seqidno:2、seqidno:3；seqidno:4、seqidno:5；seqidno:6；2组特异性探针seqidno:7、seqidno:8；seqidno:9、seqidno:10，并在5’端标记fam、hex、cy3和cy5荧光基团，3’端标记nfq-mgb不发光淬灭基团；2条富集引物seqidno:14、seqidno:15。将引物、探针分别制备成100μm的母液储存。

1、制备内标系统：设计并合成针对人类基因组设计的1对内标引物，该引物对序列为seqidno:11和seqidno:12；设计并合成内标探针，该探针为seqidno:13。将引物、探针分别制备成100μm的母液储存。

2、制备其他试剂：制备pcr缓冲液，其中含有1.0mm的mgcl2，datp、dutp、dgtp和dctp各1.0mm；制备酶混合液，其中含有taq酶0.5×103μ/ml，ung酶0.1×103μ/ml。

4、制备阳性标准对照品和阴性对照品，所述阳性对照品中含有本发明中涉及的mthfr基因两种多态性mthfr677、mthfr1298和gapdh基因的5种质粒混合液；所述阴性对照品为无菌水。

5、pcr反应液配制：按照下表3进行pcr反应体系配制：

6、组装试剂盒：试剂盒中包含四个组分，pcr缓冲液、酶混合液、阳性对照品和阴性对照品，根据pcr反应体系各成分使用量，计算12人份和24人份两种规格各成分使用量，配制试剂盒各管中成分并组装。

实施例2

用实施例1制备的人类mthfr基因多态性检测试剂盒对待侧样品进行检测。

1、血液样品基因组dna提取

用血液基因组柱式提取试剂盒，按照说明书操作步骤，提取人类血液基因组。用紫外分光光度计检测所得样品dna溶液的浓度，然后将样品dna稀释到10ng/μl，分别取2μl-5μl加入至实施例1中制得的试剂盒中并进行下一步的pcr反应。

2、将步骤1中稀释后的dna样品依次取2μl分别加入到23μl的实施例1的试剂盒的反应体系中，并放入荧光定量pcr仪，按如下所示设置pcr反应程序后进行扩增反应：

50℃2min，95℃10min；

95℃15s，48℃～53℃1min，5个循环；

95℃15s，60℃～62℃1min，40个循环；每个循环后收集fam、hex、cy3、cy5、rox的荧光信号。

样本的检测结果分析：18例样品的检测结果如下：

677c/c1298a/a纯合野生样本3例，其中一个检测结果如图1所示；

677c/c1298a/c杂合突变样本1例，其中一个检测结果如图2所示；

677c/t1298a/c杂合突变样本5例，其中一个检测结果如图3所示；

677c/t1298a/a杂合突变样本4例，其中一个检测结果如图4所示；

677t/t1298a/a纯合突变样本3例，其中一个检测结果如图5所示；

677t/t1298c/c纯合突变样本1例，其中一个检测结果如图6所示。

上述18例样本荧光定量pcr检测结果与测序结果一致。以上结果表明本发明实施例提供的检测试剂盒用于人类mthfr基因多态性检测结果可靠，与直接测序一致率达到100％，且本发明检测方法灵敏度高于传统测序方法，操作简单快速，利于大规模推广。

序列表

<110>江苏正大天创生物工程有限公司

<120>人类mthfr基因多态性检测试剂盒

<160>15

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>19

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

tctgcgggagccgatttca19

<210>2

<211>19

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

tctgcgggagtcgatttca19

<210>3

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

caaagcggaagaatgtgtca20

<210>4

<211>22

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>4

agctgaccagtgaagaaagtgt22

<210>5

<211>22

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>5

agctgaccagtgaagcaagtgt22

<210>6

<211>21

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>6

gaaccagggtccccactccag21

<210>7

<211>17

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>7

tgcgggagccgatttca17

<210>8

<211>17

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>8

tgcgggagtcgatttca17

<210>9

<211>21

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>9

cagtgaagaaagtgtctttga21

<210>10

<211>21

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>10

cagtgaagcaagtgtctttga21

<210>11

<211>19

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>11

catcgctcagacaccatgg19

<210>12

<211>22

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>12

gcaaggctcgtagacgcggttc22

<210>13

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>13

tcggagtcaacgggtgagtt20

<210>14

<211>21

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>14

cagcctctcctgactgtcatc21

<210>15

<211>19

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>15

gagcaagtcccccaaggag19