一种耐热漆酶及其基因与应用的制作方法

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种耐热漆酶及其基因与应用。

背景技术：

漆酶（laccase，ec1.10.3.2）又名苯二酚双氧氧化还原酶（para-benzenediol：dioxygenoxidoreductase），属于蓝色多铜氧化酶（bluemulti-copperoxidase）家族。漆酶在催化底物的过程中，不需要h2o2，产物只生成h2o，因此被称为“绿色催化剂”。漆酶具有广泛的底物范围，因此在纺织、造纸、食品、有机物合成、生物降解、环境修复等领域具有广阔的应用前景。

漆酶广泛存在于真菌中，担子菌门的白腐真菌是主要的漆酶生产菌，如栓菌属（trametes）、侧耳属（pleurotus）和齿毛菌属（cerrena）。几乎所有的真菌分泌一种以上的漆酶同工酶；不同漆酶在表达调控、催化特性、热稳定性、对酸碱、有机溶剂及抑制剂耐受性等方面存在差异，而这些性质与实现漆酶的工业化应用紧密联系。现有的研究表明，真菌漆酶一般在50℃以下的稳定性好，而在60℃及以上则容易失活。例如，齿毛菌（cerrenasp.）hyb07的主要漆酶lac7在60℃及以下较为稳定，但在70℃保温20min，酶活力完全丧失。cerrenaunicolorc-139的漆酶在70℃的半衰期为15min，在70℃保温60min后只有5%的酶活力剩余。来源于cerrenaunicolorstrain137的两种漆酶lacci和laccii，lacci在70℃保温20min后酶活力完全丧失，laccii在70℃保温60min后仅剩余10%的酶活力。

尽管漆酶在各领域都具有很重要的用途，但漆酶的稳定性仍是限制其工业化应用的主要因素。要实现漆酶的应用价值，必须寻找出更多稳定性好的酶源，如高温下的应用需要耐热漆酶。

技术实现要素：

本发明的目的在于主要提供一种耐热型漆酶及其基因与应用，扩展漆酶基因资源库，为实现漆酶在工业上的应用提供更有价值的酶源。

本发明提供的一种耐热漆酶，其氨基酸序列如seqidno.3所示。

本发明提供的一种编码耐热漆酶的基因，所述的编码耐热漆酶的基因为lac2，该基因的cdna序列如seqidno.2所示。

所述的lac2基因全长序列如seqidno.1所示。

本发明还提供了所述的耐热漆酶的制备方法：发酵培养包含lac2基因的细胞，收集包含lac2耐热漆酶的发酵液，并通过硫酸铵沉淀、离子交换层析等纯化方法分离出所述的耐热漆酶。

本发明的具体的技术方案详述如下：

本发明涉及从白腐真菌一色齿毛菌(cerrenaunicolor)中克隆lac2基因，该菌株购于中国普通微生物菌种保藏管理中心，菌株保藏编号为cgmcc5.1011。

本发明涉及从一色齿毛菌中克隆的lac2的基因和cdna序列。实施方式之一，提取一色齿毛菌的基因组dna和总rna，以总rna为模板形成cdna第一链。提取的一色齿毛菌的总rna送往北京诺禾致源进行高通量转录组测序，分析转录组测序结果，获取漆酶基因信息，根据转录组预测的漆酶开发阅读框的cdna序列信息，设计引物，通过rt-pcr获得lac2的cdna序列，以基因组为模板，pcr扩增得到lac2的基因序列。所述的基因序列包含seqidno.1所示的核苷酸序列。所述的cdna序列包含seqidno.2所示的核苷酸序列。seqidno.1中的dna序列由2265个碱基组成，该基因的读码框为自5’端第一位到2265位碱基，包含2265个碱基对。该序列包含了12个内含子，分别为5’端第181位到第235位碱基，第304位到第353位碱基，第476位到第528位碱基，第642位到第693位碱基，第758位到第813位碱基，第907位到第963位碱基，第1121位到第1183位碱基，第1385位到第1438位碱基，第1496位到第1554位碱基，第1768位到第1816位碱基，第1934位到第1991位碱基，第2110位到第2169位碱基。其cdna序列如seqidno.2所示，由1599个碱基组成。

seqidno.3由532个氨基酸组成，自n’第1-15位氨基酸残基是信号肽序列；成熟酶为517个氨基酸。

本发明还涉及了所述漆酶的制备方法，发酵培养一色齿毛菌，收集发酵液后，进行硫酸铵沉淀和阴离子交换层析柱等步骤得到其主要漆酶，并通过maldi-tofms/ms鉴定该纯酶为上述的lac2漆酶。

本发明所述的漆酶以abts、邻苯二酚及愈创木酚为底物，最适反应ph分别为3.0、5.5、5.5，最适反应温度为55、45、60℃。在ph5.0-9.0条件下保温24h及48h，其剩余活力仍能够保持在80-96%之间，ph稳定性好。同时具有很好的热稳定性，其t1/2,60℃为7.792h，t1/2,70℃为1.673h。其还能够耐受多种金属离子，ca²⁺、k⁺、mn²⁺、pb²⁺和zn²⁺对其活力有促进作用，而cu²⁺和co²⁺对其活力没有明显影响。其还能够耐受多种有机溶剂，10%的甲醇、乙醇、二甲基亚砜、异丙醇、丙酮和乙腈对其活力影响不大，与无有机溶剂时相似。有机溶剂浓度升高到25%时，其酶活力仍保持在50%以上。其对l-cys、edta、sds和triton-x100的耐受性好，0.1mm和1mm的l-cys对其酶活力几乎没有影响，在0.05mmsds和0.5、1mm的triton-x100中，其剩余酶活力在84%以上。本发明所述的lac2漆酶在70℃时仍能对100mg/l孔雀石绿进行高效脱色。

本发明的优点在于：本发明所述的耐热漆酶（lac2漆酶）是一种新型的耐热性漆酶兼具良好的ph、有机溶剂和抑制剂耐受性，能够为漆酶的工业化应用提供稳定的新型漆酶酶源，减低成本，实现较好的经济效益和社会效益。

附图说明

图1发酵培养基碳源优化。

图2发酵培养基最佳碳源（甘油）量优化。

图3发酵培养基氮源优化。

图4发酵培养基最佳氮源（蛋白胨）浓度优化。

图5lac2漆酶纯化结果的sds-page电泳图。m：蛋白质marker；1：齿毛菌5.1011发酵液总蛋白；2：deae阴离子交换柱分离出的lac2；3：经过n-glycopeptidasef去糖基化酶（takara）处理后的lac2漆酶。

图6lac2漆酶与abts、catechol（邻苯二酚）、guaiacol（愈创木酚）反应的最适ph。

图7lac2漆酶与abts、catechol（邻苯二酚）、guaiacol（愈创木酚）反应的最适温度。

图8lac2漆酶的ph稳定性。

图9lac2漆酶的温度稳定性。

图10金属离子对lac2漆酶活性的影响。

图11有机溶剂对lac2漆酶活性的影响。

图12抑制剂等对lac2漆酶活性的影响。

图13不同温度下lac2漆酶、hyb07漆酶、trametes漆酶对孔雀石绿的脱色情况。图中mg表示未加漆酶处理的孔雀石绿，b1、b2、b3分别表示30℃下lac2、hyb07漆酶、trametes漆酶对孔雀石绿的脱色情况，c1、c2、c3分别表示50℃下lac2、hyb07漆酶、trametes漆酶对孔雀石绿的脱色情况，其中c2颜色为粉色；d1、d2、d3分别表示70℃下hyb07漆酶、lac2、trametes漆酶对孔雀石绿的脱色情况，其中d1颜色为较深的蓝色，d3颜色为紫色。

图14不同温度下lac2漆酶、hyb07漆酶、trametes漆酶对孔雀石绿的脱色率。

图15-a30℃温度下lac2漆酶、hyb07漆酶、trametes漆酶对孔雀石绿脱色的全波长扫描。

图15-b50℃温度下lac2漆酶、hyb07漆酶、trametes漆酶对孔雀石绿脱色的全波长扫描。

图15-c70℃温度下lac2漆酶、hyb07漆酶、trametes漆酶对孔雀石绿脱色的全波长扫描。

具体实施方式

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

以下根据具体的实施例充分说明本发明，但本发明不仅限于此。

1.菌株和载体

一色齿毛菌（cerrenaunicolor）5.1011菌株购于中国普通微生物菌种保藏管理中心（编号为cgmcc5.1011），以下将其命名为齿毛菌5.1011。大肠杆菌top10，克隆载体pmd18-t购自takara公司。cerrenasp.hyb07菌株来源于福州大学生物科学与工程学院。

2.试剂

2×easytaqpcrsupermix、cdna合成试剂盒（transscriptone-stepremovalandcdnasynthesissupermix）和蛋白marker购自transgenbiotech公司，fungaldnakit、gelextractionkit购自omega公司，abts（2,2’-联氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二铵盐）和孔雀石绿购自sigma公司，rapidpngasef购自takara公司，其他试剂购自上海生工或者进口。

3.漆酶

hyb07漆酶：由cerrenasp.hyb07发酵制备所得（yangetal.(2014)purificationandcharacterizationofanovellaccasefromcerrenasp.hyb07withdyedecolorizingability.plosone,9(10):e110834）。

trametes漆酶（laccasefromtrametesversicolor，casno.80498-15-3）：购自sigma-aldrich。

4.培养基

lb培养基参照invitrogen毕氏酵母操作手册。

一色齿毛菌5.1011产漆酶发酵培养基中含有（1l）：甘油20g；蛋白胨15g；kh2po46g；mgso4·7h2o4.14g；cacl20.3g；nacl0.18g；cuso4·5h2o0.0625g；znso4·7h2o0.018g和维生素b10.015g。

齿毛菌hyb07产漆酶发酵培养基（1l）：糊精60g、蛋白胨10g、酒石酸铵1.6g、kh2po46.0g、mgso4.7h2o4.2g、cacl20.3g、nacl0.2g、cuso4.5h2o62.5mg、znso4.7h2o18.0mg、vb115.0mg。

5.本发明中所用到的生物化学技术均为本领域中的常规技术。在以下实施例中，除非特殊说明，所有实验操作均按照以下实验手册或文献中的相关章节或部分进行，包括：[美]j.莎姆布鲁克等，分子克隆实验指南；赵永芳等，生物化学技术原理及其应用（第二版）；朱检等，生物化学实验[m]。

6.本发明所有相关的酶活、酶活力、酶活性均指漆酶活性，均采用以下方法之一检测：

（1）、abts为底物，在2.0ml的反应体系中含0.975ml0.1mol/l醋酸-醋酸钠缓冲液（ph3.0），1.00ml0.5mmol/labts和25µl适当稀释的酶液。55℃恒温水浴锅中准确反应5min后，测定反应体系在420nm处吸光值的变化量。酶活力的定义：每分钟催化1µmolabts氧化所需酶量为1个酶活力单位(u)。

（2）、guaiacol（愈创木酚）为底物，2.0ml反应体系含1.86ml0.05mol/l柠檬酸-磷酸盐缓冲液、100µl20mmol/l愈创木酚溶液和40µl适当稀释的酶液。40℃恒温水浴锅中准确反应5min后，测定反应体系在465nm处吸光值的变化量。以灭活的酶液作为空白。酶活力的定义：在ph4.5，40℃条件下，每分钟催化1µmol愈创木酚氧化所需酶量为1个酶活力单位（u）。

（3）、catechol（邻苯二酚）为底物，反应体系2.0ml，其中含0.9ml0.05mol/l柠檬酸-磷酸盐缓冲液（ph4.5）、1.0ml5mmol/l邻苯二酚溶液和100µl适当稀释的酶液。40℃恒温水浴锅中准确反应10min后，测定反应体系在400nm处吸光值的变化量。以灭活的酶液作为空白。酶活力的定义：在ph4.5，40℃条件下，每分钟催化1µmol邻苯二酚氧化所需酶量为1个酶活力单位（u）。

实施例1产酶培养基碳氮源优化

（1）齿毛菌的培养与漆酶发酵

从4℃保藏的斜面培养基上挑取一色齿毛菌5.1011的菌丝在pda固体培养基平板上划线，26℃恒温培养箱中培养4d。用直径1cm打孔器打孔，取5个菌饼至50ml/150mlpda液体培养基中，200rpm，30℃，摇床培养2d，制备一级种子液。按8%的接种量，取4ml一级种子液至100ml/250ml液体pda培养基中，200rpm，26℃，摇瓶培养2d，制备二级种子液。按8%（v/v）的比例将二级种子液接种到发酵培养基中，培养条件不变，进行产酶发酵培养。

（2）发酵培养基碳源优化

以2%（w/v）的碳源浓度进行发酵培养基的碳源种类优化，其他培养基成分保持不变。选择的碳源有：非糖类（甘露醇、甘油）、单糖（葡萄糖），二糖（乳糖、蔗糖）和多糖（纤维素、麦芽糊精、玉米糊精、β-糊精、可溶性淀粉、玉米淀粉）。在所测试碳源中，甘油为最佳碳源。以甘油为碳源发酵，在15d可以达到最高酶活121.76u/ml，明显高于其它碳源的最高酶活力。其次是麦芽糊精，在第9d达到最高酶活力为36.95u/m。以甘露醇为碳源时，该齿毛菌在第17d达到最高酶活力为38.74u/ml，在玉米淀粉为碳源的培养基中13d达最高酶活力为18.51u/ml，在玉米糊精为碳源的培养基11d达最高酶活力为17.57u/ml，而在其他碳源中的最高酶活力均较低。因此，确定甘油为该齿毛菌发酵的最佳碳源。

以甘油为最佳碳源，以1%、2%、3%和5%(w/v)浓度进行碳源浓度的优化，确定最佳碳源浓度。该齿毛菌在不同甘油浓度下，漆酶酶活在第9d均能大幅度提升。在1%甘油在第11d能达到最高酶活力为40u/ml，第15d酶活开始下降，而3%和5%甘油中在第17d达到最大酶活力，分别为63和34u/ml，因此确定2%甘油为发酵产酶的最佳碳源。

（3）发酵培养基氮源优化

以2%甘油为最佳碳源，进行发酵培养基的氮源优化。改变发酵培养基的氮源种类，保持氮源浓度1.5%的含量不变。选择的氮源有：无机氮源（硝酸铵、硫酸铵）、简单有机氮源（酒石酸铵）和复杂有机氮源（蛋白胨、酵母粉、牛肉膏，豆饼粉）。总的来说，该齿毛菌在有机氮源中产酶情况较好，无机氮源最差，以蛋白胨为氮源时，漆酶产量最高，其次是牛肉膏，因此选择蛋白胨为该齿毛菌的最佳氮源。

以0.5%、1%、1.5%以及2%（w/v）浓度进行蛋白胨浓度的优化，绘制出产酶曲线，确定最佳氮源浓度。蛋白胨含量为1.5%时，产酶量最高，为123.5u/ml，其次是氮源含量为1%，最高酶活力为66.8u/ml，因此选择选择1.5%的蛋白胨为该齿毛菌的最佳氮源。

实施例2转录组测序

（1）总rna的提取分离

收集一色齿毛菌5.1011在产酶发酵培养基发酵到第六天的菌丝，抽滤干后立即加入液氮充分研磨，利用rneasyplantminikit试剂盒（qiagen公司）提取齿毛菌5.1011的总rna。用2%的琼脂糖电泳检测所提取rna的降解程度，用nanodrop2000测od260/280比值，检测rna的纯度。

（2）转录组的建库与测序

样品检测合格后，送往北京诺禾致源公司进行无参转录组测序。用有oligo(dt)的磁珠与mrna的ploya进行a-t碱基配对，分离出mrna。加入fragmentationbuffer使原先平均长度为几kb的完整mrna随机断裂成200bp左右的小片段。在逆转录酶的作用下，利用随机引物，使mrna为反转形成稳定的双链结构。将双链cdna纯化后进行末端修复、加a尾并连接测序接头，再用ampurexpbeads进行片段大小选择。pcr扩增，保证大部分片段在150~200bp使用ampurexp系统纯化pcr产物，获得最终文库。随后进行库检，经过定量后将文库稀释到1.5ng/ul，再运用agilent2100检测文库的insertsize，insertsize符合预期后，运用qpcr方法准确定量文库的有效浓度。文库有效浓度大于2nm，库检合格。根据有效浓度和目标下的机数据量需求将不同的文库pooling后进行illuminahiseq测序。

（3）illuminahiseq测序分析

illumina原始数据处理与质量评估：测序reads错误率会随着测序的进行而升高，是由测序过程中化学试剂的消耗造成，因此需要对测序原始数据进行质量控制。illumina测序得到的原始数据(rawreads)进行带有接头、ploy-n和低质量（质量值qphred≤20的碱基数占整个reads的50％以上的reads）的rawreads的过滤得到cleanreads，并计算出cleanreads的q20、q30%（red数值大于20、30的碱基占总体碱基的百分比）、碱基错误率gc%以及碱基重复水平，进行质量控制，保证后续分析质量。后续分析均基于cleanreads。

转录组本拼接：无参数转录组需要对cleanreads进行拼接以获取后续分析的参考序列。采用trinity对cleanreads进行拼接，然后用corset程序（https://code.google.com/p/corset-proje）对转录本进行层次聚类，以聚类后序列为参考，进行后续分析。

基因功能注释：为了得到全面的基因功能信息，本发明进行了nr、nt、pfam、kog、swiss-prot、kegg、go七大数据库的基因功能注释。

实施例3lac2漆酶基因序列的获得

（1）转录组漆酶基因信息的获取

在测序前完整mrna片段被随机打断后上机测序，测序结束后经质量控制后得到的cleanreads拼接成了不同的clusters。拼接的长度在200～40000bp，长度不一。可能存在不同的cluster注释为同一种基因，但其比对到基因的位置可能有所不同，也可能有重叠部分。因此以注释为同一种漆酶基因为原则，将拼接结果（clusters）进行归类分析。

基于转录组注释结果的归类分析，预测出lac2的cdna序列信息。根据序列信息，设计包括完整开发阅读框在内的引物，引物序列如下。

lac2-f:5’-atgggcgtgggtctactctc-3’；

lac2-r:5’-tcatgatgcactggtctgagc-3’。

（2）pt-pcr获取lac2漆酶cdna序列

以实施例2提取的总rna为模板，用transscriptone-stepremovalandcdnasynthesissupermix（transgenbiotech公司）合成cdna第一链。pcr反应体系（50μl）为2xeasytaqpcrsupermix25μl，cdna第一链模板1μl，正向引物（10μmol/l）1μl，反正向引物（10μmol/l）1μl，ddh2o22μl。pcr程序为为：95℃预变性3min；94℃变性30s，65℃退火30s，72℃延伸2min，循环扩增35次；最后72℃延伸10min。扩增结束后取pcr产物进行电泳检测，用gelextractionkit（omega公司）回收凝胶中的目标基因并克隆到pmd18-t载体上。用化学转化法转化大肠杆菌top10感受态细胞，在含有100μg/mlampicillin的lb平板上37℃培养过夜。通过蓝白斑筛选，挑取白色的单克隆进行菌落pcr验证（pcr反应程序与上述相同），并接种到2ml含有100μg/mlampicillin的lb液体培养基中培养8-10h后抽提质粒进行测序分析(invitrogen公司)，获得lac2的cdna序列(seqidno.2)。

（3）pcr获取lac2基因序列

收集一色齿毛菌5.1011在上述的二级种子液中培养2天的菌丝，抽滤干后立即加入液氮充分研磨，利用fungaldnakit试剂盒（omega公司）提取齿毛菌5.1011的基因组dna。以此为模板，lac2-f/lac2-r为引物，pcr反应体系（50μl）为2xeasytaqpcrsupermix25μl，基因组dna模板1μl，正向引物（10μmol/l）1μl，反正向引物（10μmol/l）1μl，ddh2o22μl。pcr程序为：95℃预变性3min；94℃变性30s，65℃退火30s，72℃延伸10min，循环扩增35次；最后72℃延伸10min。扩增结束后取pcr产物进行电泳检测，回收凝胶中的目标基因并克隆到pmd18-t载体上，进行测序，获得lac2的dna序列（seqidno.1）。

（4）基于cdna序列，预测lac2蛋白由532个氨基酸残基组成(seqidno.3)，自n端第1-15位氨基酸残基是信号肽序列；成熟酶蛋白(除去信号肽序列后)包含517个氨基酸残基。通过blast软件将lac2编码蛋白同已知漆酶蛋白进行序列比对，可知其与其他来源白腐真菌的漆酶同源，其中与cerrenasp.hyb07中的lac4（aid59412.1）的相似性最高，为67%。

实施例4lac2漆酶的制备

（1）漆酶发酵液的制备

一色齿毛菌5.1011在实施例1的发酵条件下培养15天，12000rpm离心10min后取上清并用定性滤纸抽滤得到漆酶粗酶液。

（2）漆酶的分离纯化

将粗酶液按一级0-50%，二级50-90%进行硫酸铵分级沉淀。用50mmol/ltris-hcl缓冲液（ph8.0）溶解硫酸铵沉淀所得的蛋白，置于2l50mmol/ltris-hcl缓冲液（ph8.0）中4℃过夜透析，每隔12h更换50mmol/ltris-hcl缓冲液（ph8.0）。akta系统清洗好后，用50mmol/ltris-hcl缓冲液（ph8.0）的a液充满管路后装上hitrapdeae（5ml）的阴离子交换层析柱并平衡柱子。将透析后的粗酶液用0.20µm的滤膜进行抽滤后上样于deae平衡好的交换柱。待完全进样后，用a液平衡柱子，用b液含1mol/lnacl的50mmol/ltris-hcl缓冲液（ph8.0）洗脱蛋白，设置b液含量为15%，流速为1ml/min，收集有酶活的洗脱液。对每管洗脱液进行酶活测定，将高酶活组分置于4℃冰箱中保存备用。

按照说明书使用easyⅱproteinquantitativekit（bca）试剂盒（transgen）测定蛋白浓度。测出每一步纯化前后的漆酶酶活力和蛋白浓度后，计算出比活力和纯化倍数，结果如表1所示。漆酶经过硫酸铵和阴离子交换柱（deae）后比活力为521.6u/mg，纯化倍数为8.69，回收率为29.53%。sds-page分析结果如图5所示，经deae分离后得到分子量在58.4-74.0kda之间的蛋白条带，按照说明书使用n-glycopeptidasef去糖基化酶（takara）对该蛋白去糖基化处理后得到一条分子量约为50.0kda的蛋白，证实deae纯化后达到电泳纯，纯化漆酶的糖基化程度为16.8-48.0%，糖基化程度较高。

（3）lac2漆酶的鉴定

将纯化后漆酶单一的胶条割胶后，将样品送至中科新生命(aptbio)，利用maldi-tofms/ms鉴定为lac2漆酶。

表1一色齿毛菌5.1011漆酶分离纯化步骤及结果

实施例5lac2的酶学性质分析

（1）最适ph和温度

以abts、guaiacol、catechol为底物，测定lac2的最适反应ph。lac2对上述三种底物的最适反应ph分别为3.0、5.5、5.5。以abts、guaiacol、catechol为底物，在最适ph条件下测定温度（20-70℃）对lac2催化上述三种底物的活力。结果表明lac2与三种底物反应的最适温度分别为55、45、60℃。

（2）ph稳定性和温度稳定性

将lac2酶液与ph2.5-8.7柠檬酸-na2hpo4缓冲液以体积比1:10混合后，置于30℃水浴锅中处理24-48h，以abts为底物，在最适的ph和温度下测定其剩余酶活，探究漆酶的ph稳定性。在ph5.0-9.0条件下保温24h及48h，其剩余活力仍能够保持在80-96%之间，ph稳定性好。将该酶置于40、50、60、70℃水浴锅中保温0~11h，每隔1h以abts为底物，在其最适条件下测定其剩余酶活，探究漆酶的热稳定性，用graphpadprism6软件拟合曲线，计算出热失活常数，结果如表2所示。结果表明，低于60℃时保温11h，该酶仍能保持62%以上的活力。该酶在60℃的半衰期(t1/2)为7.792h，70℃的半衰期(t1/2)为1.673h，具有很好的热稳定性。相比而言，hyb07的主要漆酶lac7在70℃保温20min，酶活力完全丧失。

表2lac2的热失活参数

（3）金属离子、有机溶剂以及抑制剂对酶活力的影响

在abts为底物的测定酶活的反应体系中加入金属离子（al³⁺、ca²⁺、cd²⁺、ce³⁺、co²⁺、k⁺、cu²⁺、fe²⁺、hg²⁺、li⁺、mg²、mn²⁺、ni²⁺、pb²⁺、zn²⁺），终浓度为10mm，以探究金属离子对该酶活力的影响，以未添加金属离子的酶活力为参照，在最适反应条件下测定其剩余酶活。结果表明该酶能够耐受多种金属离子，ca²⁺、k⁺、mn²⁺、pb²⁺和zn²⁺对其活力有促进作用，而cu²⁺和co²⁺对其活力没有明显影响。

在abts反应体系中加入终浓度为10%、25%的有机溶剂（甲醇、乙醇、丙酮、异丙醇、乙腈和二甲亚砜），以未添加有机溶剂的酶活力为参照，在最适反应条件下测定其剩余酶活力，以探究有机溶剂对该酶活力的影响。结果表明，该酶具有较强的有机溶剂耐受性，10%的甲醇、乙醇、二甲基亚砜、异丙醇、丙酮和乙腈对其活力影响不大，与无有机溶剂时相似。有机溶剂浓度升高到25%时，其酶活力仍保持在50%以上。

在反应体系中添加终浓度为0.1mm、1mm的nan3、l-cys，1mm、10mm的edta，20mm、50mm、100mm的nacl，0.05mm、0.2mm的sds，0.5mm、1mm的tritonx-100，以未添加上述试剂的酶活为参照，最适反应条件下测定该酶的剩余酶活，探究其对该酶活性的影响。结果表明，该酶对l-cys、edta、sds和triton-x100的耐受性好，0.1mm和1mm的l-cys对其酶活力几乎没有影响，在0.05mmsds和0.5、1mm的triton-x100中，其剩余酶活力在84%以上。

实施例6比较不同漆酶的热稳定性

以下漆酶酶活测定均以abts为底物。本发明中的lac2漆酶其60℃时保温11h后仍能保持62%以上的活力，该温度的半衰期(t1/2)为7.792h，而70℃的半衰期(t1/2)长达1.673h，具有很好的热稳定性。粗毛栓菌lg-9（黄峰等人，一种粗毛栓菌及其培养方法与应用，cn101280277a）与dmp底物反应的最适温度为85℃，但其在75℃时保温300s后完全没有活性。来源于亮菌的重组漆酶（詹洁，亮菌漆酶基因及其重组毕赤酵母工程菌和应用，cn105543250a）以abts为底物时其最适温度为55℃，与本发明所述的lac2漆酶相同，不同的是cn105543250a的漆酶其在30℃或40℃下保温1h后酶活力仅剩余60%左右，而本发明中的lac2漆酶在50℃及以下保温1h剩余酶活力在90%以上，保温11h后其剩余酶活力仍在75%及以上。重组鸡腿菇漆酶（丁少军等人，一种漆酶基因lac6及其表达蛋白的应用，cn103710363a）以abts为底物时其最适温度为65℃，其在50℃以下保温1h的剩余酶活力在80%以上，但60℃时1h后完全失活，70℃保温15min后完全失活。

实施例7比较不同漆酶的抗逆性

lac2与其他漆酶的抗逆性相比较，结果如下：本发明中1mmedta对lac2没有影响，edta浓度升高到10mm时，仍具有较高酶活力为79%，高浓度的edta抑制程度低。ning等人纯化出的lac-04漆酶，edta浓度为1.25mm时相对酶活力为113%，而当浓度为10mm时酶活力仅剩余42%（ning,etal.(2016)anextracellularyellowlaccasewithpotentdyedecolorizingabilityfromthefungusleucoagaricusnaucinuslac-04.internationaljournalofbiologicalmacromolecules,93:837-842）。从thielaviasp.中分离纯化出的talac1漆酶，在10mm的edta中剩余酶活力为63%（mtibaà,etal.(2018)purificationandcharacterizationofafungallaccasefromtheascomycetethielaviasp.internationaljournalofbiologicalmacromolecules,120:1744-1751）。许多报道表明l-cys是漆酶有效的抑制剂，而本研究中0.1mm的l-cys对本研究中的lac2几乎没有影响：l-cys浓度为1mm时，仍对lac2没有抑制作用，表明lac2具有很强的抗l-cys抑制能力。从trametesorientalis分离纯化的漆酶在0.1mm的l-cys中剩余酶活力为30%（zheng,etal.(2017)anovellaccasefromwhiterotfungustrametesorientalis:purification,characterization,andapplication.internationaljournalofbiologicalmacromolecules,102:758-770）绒毛栓菌产的tplac漆酶当抑制剂l-cys浓度为0.05、0.1、1.0mm时，其漆酶剩余酶活力为89.75%、78.74%、38.89%（司静，生产漆酶的菌株、利用菌株生产漆酶的方法和生产的漆酶及其应用，104611235a）。0.1mml-cys对cota漆酶活性几乎没有影响，当l-cys浓度为1mm时，剩余酶活力仅为26.97%（乔雄维，一种cot漆酶及其应用，cn106047827a），而本发明中0.1mm和1mm的l-cys均其酶活力几乎没有影响，具有显著的抗逆性。

实施例8比较不同漆酶对孔雀石绿的脱色

将漆酶应用于染料孔雀石绿（mg）的降解，检验lac2漆酶热稳定性在应用中的价值，同时与hyb07漆酶和trametesveriscolor漆酶相比较。在漆酶介导孔雀石绿的降解过程中，孔雀石绿（mg）逐步去甲基化形成desmethylmg，didesmethylmg，tridesmethylmg和tetradesmethylmg等中间产物，而后被进一步降解（yangetal.(2015)laccase-catalyzeddecolorizationofmalachitegreen:performanceoptimizationanddegradationmechanism.plosone,10(5):e0127714）。

在30、50和70℃条件下，利用lac2漆酶、hyb07漆酶及trametes漆酶分别对孔雀石绿进行脱色。脱色反应体系中含有50mm磷酸柠檬酸缓冲液（ph6.0）、100mg/lmg和20u/ml漆酶。以热灭活漆酶混合物作为阴性对照。6h后，两种漆酶对孔雀石绿的脱色情况如图13所示，用酶标仪测定290~900nm范围的吸收波长，绘制出脱色前后的全波长图谱（图15-a、b、c所示）。并根据mg的最大吸收波长614nm，计算出漆酶对不同染料的脱色率，比较三种漆酶在不同温度下对孔雀石绿的脱色效果。

在30℃下，三种漆酶对mg的脱色效果类似，脱色率均在92%以上，脱色后mg的特征吸收峰消失，且没有新的吸收峰出现（图15-a）。当脱色温度为50℃时，三种漆酶对mg的脱色率均在90%以上，但hyb07漆酶降解mg溶液变成粉色，该粉色物质在560nm处有最大吸收峰（图15-b）。前期研究表明，该现象是由于高温下hyb07漆酶的不稳定而导致mg的降解途径发生了阻断，进而导致粉色脱甲基产物（tetradesmethylmg）积累（yangetal.(2017)immobilizedcerrenasp.laccase:preparation,thermalinactivation，andoperationalstabilityinmalachitegreendecolorization.scientificreports7:16429）。这种现象没有在lac2漆酶和trametes漆酶降解孔雀石绿的过程中观察到。在70℃时，5.1011的lac2漆酶仍能完全降解mg，而hyb07漆酶在高温下很快失活，反应结束后仍具有较深的颜色，最大吸收峰转移至590nm，推测为didesmethylmg的积累（bongsupetal.(2003)synthesisandcharacterizationofn-demethylatedmetabolitesofmalachitegreenandleucomalachitegreen.chemicalresearchintoxicology,16:285-294）。同样地，trametes漆酶反应结束后，溶液为紫色，最大吸收峰也转移至590nm，但是较hyb07漆酶脱色后的最大吸收峰低，说明trametes漆酶的热稳定性虽然较hyb07漆酶高，但其在70℃也容易失活，导致降解孔雀石绿发生了阻断，在该温度下不能使孔雀石绿完全脱色。本申请以高温下漆酶对孔雀石绿的脱色为例，说明lac2的热稳定性使其在高温下较其他漆酶更具优势，更有操作稳定性。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

sequencelisting

<110>福州大学

<120>一种耐热漆酶及其基因与应用

<130>5

<160>5

<170>patentinversion3.3

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