一种多引物oligo探针的制备方法与流程

本发明涉及fish技术探针制备与应用领域，具体涉及一种多引物oligo探针的制备方法。

背景技术：

荧光原位杂交技术(fish)兴起于1982年，经过三十多年的发展已经成为植物分子细胞遗传学研究中最重要的手段之一。其原理是将已知序列制备成带有标记物的探针，基于碱基互补配对的原则，与细胞或组织中的核酸进行杂交，通过特定波长光激发标记物实现对已知序列的精准定位。目前，fish技术在植物染色体组学和基因组学研究中应用广泛。但是，在非模式的植物中，可用于研究应用的dna探针是十分少量的，并且其开发工作也是十分困难和耗费人力的。这极大地阻碍了fish技术在植物染色体组学和基因组学研究中的应用。几十年来随着技术的发展革新，其所依赖的dna探针也有了更多可供选择的类型。如重复序列dna、大的插入片段bacs和单拷贝基因序列等。探针类型的多样化扩大了fish技术在植物染色体组学和基因组学研究中的应用范围。但是对于倍性较高、染色体数目较多的植物物种，开发可用于实验研究的dna探针仍是十分艰难的。近年来由于dna合成技术的迅速发展，数以万计的寡核苷酸(oligos)大规模合成变为了可能。人工合成带有标记的寡核苷酸(oligos)探针结合fish技术已经广泛应用于小麦、水稻、土豆和黄瓜等重要农作物的染色体识别、核型进化和基因检测等研究中。oligo探针具有灵敏度高、特异性强等特点，并且可以根据研究需要从重复序列或者单拷贝dna序列进行定向设计，这极大的加强了fish技术在植物分子细胞遗传学研究领域的应用能力。但是，目前oligo探针的制备方式是每个oligo序列库采用单一引物对扩增制备，其缺点在于每个oligo序列库只能制备成一个探针，探针的无法拆分性极大的限制了oligo-fish技术在植物分子细胞遗传学研究中更精细的应用。

现代植物染色体组学和基因组学的深入研究需要更为精细的fish技术作为支撑。本发明开发了一种多引物oligo探针制备方法，可将一个大的oligo探针序列库拆分为8个小探针分别合成。这极大的加强了oligo-fish技术在更为精细的植物分子细胞遗传学研究中的应用能力。

技术实现要素：

本发明的首要目的是克服上述现有技术的不足和缺点，提供了一种多引物oligo探针的制备方法，提高fish技术在更为精细的分子细胞遗传学研究中的应用能力。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种多引物oligo探针的制备方法，利用生物信息学技术设计oligo序列并在所有oligo序列的5’端加上引物序列f1，不同探针中oligo序列的3’端加上不同的引物序列r1-r8，通过不同引物对组合将1个oligo探针序列库的8个oligo探针区分扩增，其引物序列分别为seqidno.1-9所示。

一种多引物oligo探针的制备方法，包括如下步骤：

(1)以基因组为基础去除重复序列并将剩余序列设计成59bp的oligo序列。

(2)将oligo序列比对回基因组去除含有多个比对位点的序列，并将剩余序列根据区间划分为独立探针。

(3)每个oligo探针中oligo序列的5’端加上引物序列f1，在3’端加上不同引物序列r1-r8，所有oligo序列混合构建为1个oligo探针序列库。

(4)以oligo探针序列库为模板，引物序列f分别与8个不同的反向引物序列r1f-r8f组成8个不同引物对，通过pcr的方式将1个oligo探针序列库拆分扩增为8个dna探针，再体外转录成rna，再用带有荧光标记的反向引物r1f-r8f反转录成dna/rna杂链，最终水解掉rna链，得到带有荧光标记的单链oligo探针。

上述步骤(4)中，所述的pcr扩增反应体系为：30ul5xhfbuffer,3ul50mmmgcl2，3ul10mmdntp，7.5ul10ug/ulbsa，1ul2u/ulphusionpolymerase，0.5ul1mmf引物，0.5ul1mmr引物，4ngoligo探针序列库。

上述步骤(4)中，所述的pcr扩增条件为；98℃预变性2min；98℃变性15s，60℃退火30s,72℃延伸30s，35个循环；72℃终延伸5min，10℃保存。

本发明的优点在于：

本发明开发了一种多引物oligo探针的制备方法，该方法打破了传统oligo探针制备无法拆分的局限性，通过8种不同引物对组合将一个oligo探针序列库拆分扩增为8个oligo探针，极大的提高了oligo-fish技术在更为精细的分子细胞遗传学研究的应用能力，有利于fish技术的进一步发展。

附图说明

图1：割手密ses208基因组1-8号染色体上设计的oligo探针在割手密ses208的杂交结果，a：有丝分裂中期染色体，b：oligo探针信号图，c：合成图。(探针1-8分别是割手密1-8号染色体上设计的特异探针)

具体实施方法

实施例1：多引物oligo探针的制备方法

1.初步设计oligo序列：以已测序的甘蔗属割手密ses208基因组为基础，首先通过repeatmasker软件过滤掉基因组重复序列将剩余序列设计为59bp的oligo序列，将序列比对回基因组去除有多个比对位点(同源性>75％)的oligo序列，用primer5计算剩余每个oligo序列的tm值和发卡tm值，两者相差>10℃的被保留下来。

2.oligo序列两端加引物：分别在割手密1-8号染色体上取一个2mb区间作为独立探针，并在每个独立探针的oligo序列的5’端加上相同引物序列f1，在不同探针的oligo序列的3’端加上不同引物序列r1-r8，8个区间的oligo序列组成一个oligo序列库送苏州泓迅生物科技股份有限公司合成。

3.oligo探针制备：以合成的oligo序列库为模板，引物序列f与引物序列r1f-r8f组成8种不同引物对，通过pcr的方式一次将一个oligo序列库中8个探针dna区分并扩增，再体外转录为rna，再用带有标记的引物序列r1f-r8f反转录生成dna/rna杂链，最终水解rna链得到带标记的单链oligo探针。

实施例2：多引物oligo-fish技术

多引物oligo-fish技术指设计oligo序列时在不同探针的oligo序列的3’端加上不同的引物序列r1-r8用以探针的制备和区分再与荧光原位杂交技术相结合，该方法可将1个oligo探针序列库拆分为8个小探针，提高fish技术在更为精细的分子细胞遗传学研究中的应用能力

本发明多引物oligo-fish的应用步骤为：

1.中期染色体制备：取割手密ses208幼嫩根尖放入2mm8-羟基喹啉溶液预处理两个小时富集中期细胞；再用乙醇：乙酸(3:1)固定液固定根尖，去除根冠和伸长区，将分生区置于37℃2％纤维素酶+1％果胶酶的混合液中酶解1.5h，采用“火焰干燥法”制备中期染色体。

2.杂交：配制杂交液，包含7.5ul去离子甲酰胺、3ul50％硫酸葡聚糖、1.5ul20xssc、400ng带标记的单链oligo探针共15ul；将染色体玻片放置在70℃70％的去离子甲酰胺溶液中变性1min后放置在-20℃的75％、90％和100％乙醇中梯度脱水；将杂交液滴到变性的染色体玻片上并盖上盖玻片，放置在湿盒中37℃杂交过夜。

3.洗脱与抗体孵育：将染色体玻片放置到室温的2xssc溶液中洗脱三次，再放入1xpbs溶液中洗脱一次，以上洗脱时间均为5min；将能与地高辛和生物素特异结合的抗体滴到染色体玻片上，37℃孵育1h；再将染色体玻片防入1xpbs中洗脱三次，每次五分钟；最后室温干燥玻片滴加dapi，盖上盖玻片进行染色体复染。

4.图像采集：利用荧光显微镜进行图像采集，呈现出oligo探针在染色体上的分布情况。

从图1中可以看到，本发明制备的割手密1-8号染色体特异oligo探针1-8在8倍体割手密ses208的染色体上均可产生8个清晰且强度一致的荧光信号，证明了多引物oligo探针制备方法是有效的。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

序列表

<110>福建农林大学

<120>一种多引物oligo探针的制备方法

<130>2019

<160>10

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>25

<212>dna

<213>artificial

<400>1

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<210>2

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<212>dna

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<212>dna

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<212>dna

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