一种用于猪赛内卡病毒巢式RT-PCR检测的引物组、试剂盒及应用的制作方法

本发明涉及病毒分子生物学检测
技术领域：
，尤其涉及一种用于猪赛内卡病毒巢式rt-pcr检测的引物组、试剂盒及应用。
背景技术：
：猪赛内卡病毒(senecavalleyvirus,svv)属于小rna病毒科猪赛内卡病毒属成员，最早发现于胚胎视网膜细胞(per.c6)上。svv病毒呈二十面体，直径30nm，基因组约7.2kb，编码4个结构蛋白(vp1-4)和7个非结构蛋白(2a-c，3a-d)。svv的寄主范围较窄，主要感染猪。该病毒侵染猪后可以产生多种症状，典型症状包括鼻镜、口腔和蹄部水泡或溃疡等，危害猪的正常生长，影响养殖场的经济效益。全球多个国家确诊了猪svv疫情。目前，建立快速、有效的检测方法对预防和控制该病毒的发生具有重要意义。针对svv，目前可应用的检测方法主要有电镜观察、血清学和分子生物学检测方法。电镜观察不仅需要大量病毒株材料进行病毒纯化，而且操作繁锁、时间长。血清学方法使用前提是需要有病毒相应的抗体，而svv至今尚无商品化的抗体。因此电镜观察、血清学检测方法不适于企业生产研发和农业生产快速检测。基于核酸水平的rt-pcr分子检测方法可以克服以上弊端，具有特异性强、灵敏度高、检测用时短等优点。但到目前为止，尚未见专门用于svv检测的巢式rt-pcr检测方法，更未见专门用于该病毒检测的巢式rt-pcr检测试剂盒。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种用于猪赛内卡病毒巢式rt-pcr检测的引物组、试剂盒及应用，以快速、准确地检测猪赛内卡病毒。为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：本发明提供了一种用于猪赛内卡病毒巢式rt-pcr检测的引物组，所述引物组包括外侧上游引物、外侧下游引物、内侧上游引物和内侧下游引物；所述外侧上游引物、外侧下游引物、内侧上游引物和内侧下游引物的核苷酸序列分别如seqidno：1～seqidno：4所示。本发明还提供了一种用于猪赛内卡病毒巢式rt-pcr检测的试剂盒，所述试剂盒包括上述方案所述引物组。优选的，所述试剂盒还包括rtbuffer、rna酶抑制因子、反转录酶、mgcl2、pcrbuffer、dntps和taqdna聚合酶。优选的，所述试剂盒还包括阳性对照品和阴性对照品。优选的，所述阳性对照品包括猪赛内卡病毒；所述阴性对照品包括depc水。本发明还提供了上述方案所述的引物组或上述方案所述的试剂盒在非诊断目的的猪赛内卡病毒巢式rt-pcr检测中的应用，所述应用包括以下步骤：1)提取待测样品总rna，以待测样品总rna为模板，进行反转录反应，得到待测样品cdna；2)以待测样品cdna为模板，利用上述方案所述外侧上游引物和外侧下游引物进行第一轮rt-pcr扩增反应，得到第一轮rt-pcr扩增产物；3)以第一轮rt-pcr扩增产物为模板，利用上述方案所述内侧上游引物和内侧下游引物进行第二轮rt-pcr扩增反应，得到第二轮rt-pcr扩增产物；4)用琼脂糖凝胶电泳对第二轮rt-pcr扩增产物进行检测，在523bp处出现扩增条带表示待测样品中含有猪赛内卡病毒；在523bp处未出现扩增条带表示待测样品中不含有猪赛内卡病毒。优选的，步骤2)中所述第一轮rt-pcr扩增反应使用的反应体系以25μl计包括：待测样品cdna4μl，浓度为2.5u/μltaqdna聚合酶0.5μl、浓度为10mmol/ldntps0.5μl、10×pcrbuffer2.5μl、浓度为25mmol/lmgcl22μl、浓度为10μmol/l外侧上游引物2μl、浓度为10μmol/l外侧下游引物2μl和depc水11.5μl。优选的，步骤2)中所述第一轮rt-pcr扩增反应的程序为：95℃5min，[94℃1min、55℃1min、72℃1min，30个循环]，72℃7min，反应结束。优选的，步骤3)中所述第二轮rt-pcr扩增反应使用的反应体系以25μl计包括：第一轮rt-pcr扩增产物0.2μl，浓度为2.5u/μltaqdna聚合酶0.5μl、浓度为10mmol/ldntps0.5μl、10×pcrbuffer2.5μl、浓度为25mmol/lmgcl22μl、浓度为10μmol/l内侧上游引物1μl、浓度为10μmol/l内侧下游引物1μl和depc水17.3μl。优选的，步骤3)中所述第二轮rt-pcr扩增反应的程序为：95℃5min，[94℃1min、52℃1min、72℃1min，30个循环]，72℃7min，反应结束。本发明的有益效果：本发明提供了一种用于猪赛内卡病毒巢式rt-pcr检测的引物组、试剂盒及应用，所述引物组包括外侧上游引物、外侧下游引物、内侧上游引物和内侧下游引物；所述外侧上游引物、外侧下游引物、内侧上游引物和内侧下游引物的核苷酸序列分别如seqidno：1～seqidno：4所示。本发明所提供的猪赛内卡病毒巢式rt-pcr检测试剂盒及其检测方法有益效果在于：1)特异性强：由于使用外侧、内侧2对特异性引物，大大提高了rt-pcr扩增的特异性，有效避免了非目的片段的扩增；本发明能够从感染猪塞内卡病毒的样品上扩增到大小为523bp的特异性目的片段，而从其他病毒样品上未扩增到相应的目的片段；2)灵敏度高：与普通rt-pcr相比，本发明经过2轮rt-pcr反应，检测灵敏度得到了显著提高。本发明使整个rt-pcr检测灵敏度提高了104倍(第一轮、第二轮rt-pcr的检测下限分别为10-8和10-4倍稀释的cdna)，这对于猪赛内卡病毒含量低的样品检测具有极其重要的意义；3)检测用时短：本发明检测时间快，能够克服电镜观察和血清学检测方法存在的不足，实现对猪赛内卡病毒的快速、准确和高效检测。由此来看，本发明利用巢式rt-pcr技术对猪赛内卡病毒进行检测，具有特异性强、灵敏度高、检测用时短的优点，能够满足企业生产研发及农业生产的需要，同时为猪塞内卡病毒病的监测和防控提供新思路。附图说明图1为实施例2的猪赛内卡病毒检测结果；其中m：dna分子量标准(2000bp)；1：阳性对照；2：携带有猪赛内卡病毒的样品；3：阴性对照；4：空白对照；图2为实施例3的特异性测定结果；其中m：dna分子量标准(2000bp)；1：猪塞内卡病毒(svv)；2：阴性对照；3：中国农业科学院兰州兽医研究所口蹄疫病毒多重rt-pcr检测试剂盒中口蹄疫病毒(fmdv)阳性对照样品；4：空白对照；5：猪瘟活疫苗中猪瘟病毒(csfv)样品；6：猪繁殖障碍与呼吸综合征病毒(prrsv)样品；图3为实施例4的第一轮rt-pcr灵敏度测定结果；其中m：dna分子量标准(2000bp)；1：cdna原液；2：10-2稀释；3：10-4稀释；4：10-6稀释；5：10-8稀释；6：10-10稀释；7：10-12稀释；8：阴性对照；9：空白对照；图4为实施例4的第二轮rt-pcr灵敏度测定结果；其中m：dna分子量标准(2000bp)；1：cdna原液；2：10-2稀释；3：10-4稀释；4：10-6稀释；5：10-8稀释；6：10-10稀释；7：10-12稀释；8：10-14稀释；9：空白对照；10：阴性对照。具体实施方式本发明提供了一种用于猪赛内卡病毒巢式rt-pcr检测的引物组，所述引物组包括外侧上游引物、外侧下游引物、内侧上游引物和内侧下游引物；所述外侧上游引物、外侧下游引物、内侧上游引物和内侧下游引物的核苷酸序列分别如seqidno：1～seqidno：4所示；所述seqidno：1所示的核苷酸序列具体为：5’-cgagaccggggttattgagg-3’；所述seqidno：2所示的核苷酸序列具体为：5’-taccgaatgtacacggccac-3’；所述seqidno：3所示的核苷酸序列具体为：5’-cgggtaacactgacaccgat-3’；所述seqidno：4所示的核苷酸序列具体为：5’-gagttccaagggagcacgaa-3’。本发明所述引物组根据猪赛内卡病毒基因序列设计得到；所述猪赛内卡病毒基因由ncbi获得，具体参见【senecavalleyvirusisolatesvv-001polyproteingene,completecds；genbank:dq641257.1；https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/dq641257.1】。本发明还提供了一种用于猪赛内卡病毒巢式rt-pcr检测的试剂盒，所述试剂盒包括上述方案所述引物组；优选的，所述试剂盒还包括rtbuffer、rna酶抑制因子、反转录酶、mgcl2、pcrbuffer、dntps和taqdna聚合酶。本发明中，所述引物组中外侧上游引物和外侧下游引物的使用浓度优选的独立为10μmol/l；所述引物组中内侧上游引物和内侧下游引物的使用浓度优选的独立为10μmol/l。在本发明的具体实施过程中，所述引物组中的引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。在本发明中，所述rtbuffer优选为10×的rtbuffer；所述rna酶抑制因子的使用浓度优选为40u/μl；所述反转录酶的使用浓度优选为200u/μl；所述mgcl2的使用浓度优选为25mmol/l；所述pcrbuffer优选为10×的pcrbuffer；所述dntps的使用浓度优选为10mmol/l；所述taqdna聚合酶的使用浓度优选为2.5u/μl。在本发明中，所述试剂盒优选的还包括阳性对照品和阴性对照品；所述阳性对照品包括猪赛内卡病毒；所述阴性对照品包括depc水。本发明还提供了上述方案所述的引物组或上述方案所述的试剂盒在非诊断目的的猪赛内卡病毒巢式rt-pcr检测中的应用，所述应用包括以下步骤：1)提取待测样品总rna，以待测样品总rna为模板，进行反转录反应，得到待测样品cdna；2)以待测样品cdna为模板，利用上述方案所述外侧上游引物和外侧下游引物进行第一轮rt-pcr扩增反应，得到第一轮rt-pcr扩增产物；3)以第一轮rt-pcr扩增产物为模板，利用上述方案所述内侧上游引物和内侧下游引物进行第二轮rt-pcr扩增反应，得到第二轮rt-pcr扩增产物；4)用琼脂糖凝胶电泳对第二轮rt-pcr扩增产物进行检测，在523bp处出现扩增条带表示待测样品中含有猪赛内卡病毒；在523bp处未出现扩增条带表示待测样品中不含有猪赛内卡病毒。本发明首先提取待测样品总rna，以待测样品总rna为模板，进行反转录反应，得到待测样品cdna；本发明对所述待测样品总rna的提取方法没有特殊限制，采用本领域常规提取方法即可；本发明具体实施过程中，所述待测样品总rna由天根生化科技(北京)有限公司的病毒rna提取试剂盒(dp315-r)提取；所述反转录反应使用的反应体系以20μl计包括待测样品总rna2μl、浓度为10μmol/l的外侧下游引物0.5μl和depc水8.5μl，浓度为25mmol/lmgcl24μl；10×rt缓冲液2μl、浓度为10mmol/ldntps2μl、浓度为200u/μl反转录酶0.5μl、浓度为40u/μlrna酶抑制因子0.5μl；所述外侧下游引物的核苷酸序列如seqidno：5所示，具体为5’-taccgaatgtacacggccac-3’；所述反转录反应的程序为：25℃10min，42℃15min，70℃15min。本发明得到待测样品cdna后，以待测样品cdna为模板，利用上述方案所述外侧上游引物和外侧下游引物进行第一轮rt-pcr扩增反应，得到第一轮rt-pcr扩增产物；所述第一轮rt-pcr扩增反应使用的反应体系以25μl计包括：待测样品cdna4μl，浓度为2.5u/μltaqdna聚合酶0.5μl、浓度为10mmol/ldntps0.5μl、10×pcrbuffer2.5μl、浓度为25mmol/lmgcl22μl、浓度为10μmol/l外侧上游引物2μl、浓度为10μmol/l外侧下游引物2μl和depc水11.5μl；所述第一轮rt-pcr扩增反应的程序为：95℃5min，[94℃1min、55℃1min、72℃1min，30个循环]，72℃7min，反应结束。本发明得到第一轮rt-pcr扩增产物后，以第一轮rt-pcr扩增产物为模板，利用上述方案所述内侧上游引物和内侧下游引物进行第二轮rt-pcr扩增反应，得到第二轮rt-pcr扩增产物；所述第二轮rt-pcr扩增反应使用的反应体系以25μl计包括：第一轮rt-pcr扩增产物0.2μl，浓度为2.5u/μltaqdna聚合酶0.5μl、浓度为10mmol/ldntps0.5μl、10×pcrbuffer2.5μl、浓度为25mmol/lmgcl22μl、浓度为10μmol/l内侧上游引物1μl、浓度为10μmol/l内侧下游引物1μl和depc水17.3μl；所述第二轮rt-pcr扩增反应的程序为：95℃5min，[94℃1min、52℃1min、72℃1min，30个循环]，72℃7min，反应结束。本发明得到第二轮rt-pcr扩增产物后，用琼脂糖凝胶电泳对第二轮rt-pcr扩增产物进行检测，在523bp处出现扩增条带表示待测样品中含有猪赛内卡病毒；在523bp处未出现扩增条带表示待测样品中不含有猪赛内卡病毒；所述523bp对应的核苷酸序列如seqidno：6所示，具体为：cgggtaacactgacaccgatttctctggtgaactggcggctcctggctctaaccacactaatgtcaagttcctgtttgatcgatctcgattattgaatgtaatcaaggtactggagaaggacgccgttttcccccgccctttccctacacaagaaggtgcgcagcaggatgatggttacttttgtcttctgaccccccgcccaacagtcgcttcccgacccgccactcgtttcggcctgtacgccaatccgtccggcagtggtgttcttgctaacacttcactggacttcaatttttatagcttggcctgtttcacttactttagatcggaccttgaggttacggtggtctcactagagccggatctggaatttgctgtagggtggtttccttctggcagtgaataccaggcttccagctttgtctacgaccagctgcatgtgcccttccactttactgggcgcactccccgcgctttcgctagcaagggtgggaaggtatctttcgtgctcccttggaactc。下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。实施例1猪赛内卡病毒巢式rt-pcr检测试剂盒的配置(10次检测量)1)rtbuffer：10×，1管(30μl)；2)rna酶抑制因子：40u/μl，1管(20μl)；3)反转录酶：200u/μl，1管(20μl)；4)mgcl2：25mmol/l，1管(60μl)；5)depc水：1管(1ml)；6)pcrbuffer：10×，1管(30μl)；7)外侧上游引物：10μmol/l，1管(30μl)；8)外侧下游引物：10μmol/l，1管(30μl)；9)内侧上游引物：10μmol/l，1管(30μl)；10)内侧下游引物：10μmol/l，1管(30μl)；11)taqdna聚合酶：2.5u/μl，1管(10μl)；12)dntps：10mmol/l，1管(20μl)；13)猪赛内卡病毒的阳性对照样品，1管(5μl)；14)不含猪赛内卡病毒的阴性对照样品，1管(50μl)。实施例2猪赛内卡病毒巢式rt-pcr检测试剂盒的检测方法上述猪赛内卡病毒巢式rt-pcr检测试剂盒的检测方法，包括以下步骤：1)反转录反应：在pcr管中加入待测样品总rna2μl、浓度为10μmol/l的外侧下游引物0.5μl和depc水8.5μl，浓度为25mmol/lmgcl24μl；10×rt缓冲液2μl、浓度为10mmol/ldntps2μl、浓度为200u/μl反转录酶0.5μl、浓度为40u/μlrna酶抑制因子0.5μl，在25℃孵育反应物10min，然后在42℃反转录15min，70℃延伸15min合成cdna。2)第一轮rt-pcr反应：在pcr管中加入待测样品cdna4μl，按每管加浓度为2.5u/μltaqdna聚合酶0.5μl、浓度为10mmol/ldntps0.5μl、10×pcrbuffer2.5μl、浓度为25mmol/lmgcl22μl、浓度为10μmol/l外侧上游引物2μl、浓度为10μmol/l外侧下游引物2μl、depc水11.5μl，使反应总体积为25μl；混合后的反应液，95℃预变性5min，然后94℃变性1min、55℃退火1min、72℃延伸1min，如此共30个循环，最后一个循环结束后72℃继续延伸7min，反应结束；3)第二轮rt-pcr反应：取第一轮rt-pcr反应产物0.2μl，按每管加浓度为2.5u/μltaqdna聚合酶0.5μl、浓度为10mmol/ldntps0.5μl、10×pcrbuffer2.5μl、浓度为25mmol/lmgcl22μl、浓度为10μmol/l内侧上游引物1μl、浓度为10μmol/l内侧下游引物1μl、depc水17.3μl，使反应总体积为25μl；混合后的反应液，95℃预变性5min，然后94℃变性1min、52℃退火1min、72℃延伸1min，如此共30个循环，最后一个循环结束后72℃继续延伸7min，反应结束；4)rt-pcr扩增产物电泳检测：第二轮rt-pcr反应结束后，取产物7μl用1.5％琼脂糖凝胶电泳进行检测，ultragelred染色后在凝胶成像系统上观察并记录实验结果；含有猪塞内卡病毒样品的电泳检测结果为在523bp处出现扩增条带(图1)，否则无。实施例3：猪赛内卡病毒巢式rt-pcr检测试剂盒的特异性测定1)rna的提取：分别以携带有猪赛内卡病毒(svv)、口蹄疫病毒(fmdv)、猪繁殖障碍与呼吸综合征病毒(prrsv)、猪瘟病毒(csfv)的样品为材料，各取140μl样品加入560μlcarrierrna工作液，充分混匀，室温孵育15min，期间轻轻摇动混匀；加入560μl无水乙醇，充分混匀，室温孵育5min，将管内液体全部转移至吸附柱内8000rpm离心1min弃废液，加入500μl缓冲液gd，8000rpm离心1min弃废液，加入500μl洗脱液rw，8000rpm离心1min弃废液，再次加入500μl洗脱液rw，8000rpm离心1min弃废液，将吸附柱放回收集管中，12000rpm离心3min，使吸附膜完全变干，弃废液，室温放置3min，使吸附膜完全变干，将吸附柱放入1.5mlrnase-free离心管中，小心打开吸附柱的盖子，向吸附膜的中间部位悬空滴加40μlrnase-freeddh2o，盖上盖子，室温放置5min，8000r/min离心1min，即得rna。2)反转录反应：在pcr管中加入待测样品总rna2μl、浓度为10μmol/l的外侧下游引物0.5μl和depc水8.5μl，浓度为25mmol/lmgcl24μl；10×rt缓冲液2μl、浓度为10mmol/ldntps2μl、浓度为200u/μl反转录酶0.5μl、浓度为40u/μlrna酶抑制因子0.5μl，在25℃孵育反应物10min，然后在42℃反转录15min，70℃延伸15min合成cdna。3)第一轮rt-pcr反应：在pcr管中加入待测样品cdna4μl，按每管加浓度为2.5u/μltaqdna聚合酶0.5μl、浓度为10mmol/ldntps0.5μl、10×pcrbuffer2.5μl、浓度为25mmol/lmgcl22μl、浓度为10μmol/l外侧上游引物2μl、浓度为10μmol/l外侧下游引物2μl、depc水11.5μl，使反应总体积为25μl；混合后的反应液，95℃预变性5min，然后94℃变性1min、55℃退火1min、72℃延伸1min，如此共30个循环，最后一个循环结束后72℃继续延伸7min，反应结束；4)第二轮rt-pcr反应：取第一轮rt-pcr反应产物0.2μl，按每管加浓度为2.5u/μltaqdna聚合酶0.5μl、浓度为10mmol/ldntps0.5μl、10×pcrbuffer2.5μl、浓度为25mmol/lmgcl22μl、浓度为10μmol/l内侧上游引物1μl、浓度为10μmol/l内侧下游引物1μl、depc水17.3μl，使反应总体积为25μl；混合后的反应液，95℃预变性5min，然后94℃变性1min、52℃退火1min、72℃延伸1min，如此共30个循环，最后一个循环结束后72℃继续延伸7min，反应结束；5)rt-pcr扩增产物电泳检测：第二轮rt-pcr反应结束后，取产物7μl用1.5％琼脂糖凝胶电泳进行检测，ultragelred染色后在凝胶成像系统上观察并记录实验结果(图2)。从图2可见，仅猪赛内卡病毒样品在523bp处出现扩增条带，其他病毒样品无扩增条带，表明本发明试剂盒具有很强的特异性。实施例4：猪赛内卡病毒巢式rt-pcr检测试剂盒的灵敏度测定将猪赛内卡病毒(svv)样品的cdna按100倍梯度稀释后，分别作为模板，按实施例2方法进行检测，试验同时设置阴性对照和空白对照。从图3和图4可见，第二轮rt-pcr的检测灵敏度比第一轮rt-pcr高104倍，即巢式rt-pcr使检测灵敏度提高了104倍，表明本发明试剂盒具有很高的灵敏度。实施例5：猪赛内卡病毒的临床样本检测以5个不同猪场60份临床血液样本为材料，按实施例3方法进行检测，试验同时采用普通rt-pcr方法进行检测作对比。结果表明，采用本发明能够从60份临床血液样本中检测出猪赛内卡病毒(svv)25份(检出率为42％)，比普通rt-pcr检出率高12％(表1)。表1临床血液样本的检测结果检测方法阳性样本数检出率(％)巢式rt-pcr21份35普通rt-pcr14份23上述实施例1～5中所使用的各物质的浓度与本发明技术方案中所列出的各物质的浓度对应相同。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本
技术领域：
的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。序列表<110>派生特（福州）生物科技有限公司<120>一种用于猪赛内卡病毒巢式rt-pcr检测的引物组、试剂盒及应用<160>6<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>1cgagaccggggttattgagg20<210>2<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>2taccgaatgtacacggccac20<210>3<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>3cgggtaacactgacaccgat20<210>4<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>4gagttccaagggagcacgaa20<210>5<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>5taccgaatgtacacggccac20<210>6<211>523<212>dna<213>猪赛内卡病毒(swinesenecavirus)<400>6cgggtaacactgacaccgatttctctggtgaactggcggctcctggctctaaccacacta60atgtcaagttcctgtttgatcgatctcgattattgaatgtaatcaaggtactggagaagg120acgccgttttcccccgccctttccctacacaagaaggtgcgcagcaggatgatggttact180tttgtcttctgaccccccgcccaacagtcgcttcccgacccgccactcgtttcggcctgt240acgccaatccgtccggcagtggtgttcttgctaacacttcactggacttcaatttttata300gcttggcctgtttcacttactttagatcggaccttgaggttacggtggtctcactagagc360cggatctggaatttgctgtagggtggtttccttctggcagtgaataccaggcttccagct420ttgtctacgaccagctgcatgtgcccttccactttactgggcgcactccccgcgctttcg480ctagcaagggtgggaaggtatctttcgtgctcccttggaactc523当前第1页12