一种与冠状动脉狭窄相关的血清miRNA检测试剂盒及其应用的制作方法

本发明属于分子生物学
技术领域：
，具体涉及mir-19a的检测试剂盒和其作为分子标记物在诊断冠状动脉狭窄中的应用。
背景技术：
：冠状动脉狭窄是指冠状动脉粥样硬化引起的冠状动脉血管狭窄，它严重威胁着人类健康疾病包括：冠心病，脑中风，及外周血管疾病。这些疾病占心血管疾病发病和死亡的绝大多数，越来越多的证据表明，冠状动脉粥样硬化是冠状动脉狭窄的病理基础。动脉粥样硬化是一种慢性炎症性疾病，其特征表现为动脉壁中大量脂质和炎症细胞的累积。目前认为这一过程是由低密度脂蛋白在内膜积聚开始，当动脉血管壁受到物理和化学刺激或损伤，内皮细胞活化，产生趋化因子并表达黏附分子，促使外周血中的单核细胞聚集，黏附于受损内皮并移行至内皮下，在巨噬细胞集落刺激因子(m-csf)作用下分化为巨噬细胞；在活性氧的氧化修饰下，内皮下累积的低密度脂蛋白氧化形成氧化型低密度脂蛋白(oxldl)，其具有抗原性，可刺激巨噬细胞借助于细胞膜上的清道夫受体(sr)以及cd36受体无限制的大量吞噬氧化型低密度脂蛋白，而氧化型低密度脂蛋白可导致巨噬细胞内胆固醇外流受阻，从而造成大量胆固醇在巨噬细胞内蓄积，形成动脉粥样硬化早期标志性的泡沫细胞。微rna(microrna)是物种进化上保守的，小的(平均长约18-24个核苷酸)单链非编码rna。它通过与目标mrna3’utr不完全互补结合，剪切并降解目标mrna，从而抑制蛋白质的翻译和生成，达到基因转录后的调节作用。最近的研究表明microrna参与了动脉粥样硬化中的炎症反应，胆固醇的逆向转运，细胞粘附，增殖，凋亡，氧化应激等病理过程的调控，并起到重要的调节作用，由于microrna在人体体液和组织中均能稳定的检测到，故其成为疾病诊断和预后判断的一种生物标志物，同时也是治疗的靶标。有报道显示，mir-19a有可能参与了动脉粥样硬化的发生发展。专利2010800635211公开了一种用于心血管疾病的诊断和分类的生物标记物，其通过多种预测模型以及auc、nri和cnri特征，通过训练模型等来预测多种mirna在预测心血管疾病，但是其并没有公开本申请的试剂盒组成，以及具体的mirna在血浆及旁组织中的表达水平含量，以及mirna表达水平与冠状动脉狭窄症状之间的特定关系。目前国内外研究mirna的检测手段主要是芯片技术、测序技术以及实时荧光定量pcr反应，芯片技术可以进行大规模的检测筛选，但由于成本较高且对检测标本要求严格，所以芯片技术仅用于大规模的筛选；测序技术能够通过检测碱基种类从而精确确认mirna的种类，但也存在成本花费高、耗时长且无法精准定量，故也不将其采纳为mirna检测的常规方法；实时荧光定量pcr技术具有能够简单方便的进行操作，并能相对定量mirna的含量，成本花费少等优点，使得其成为检测mirna的常规手段，但纵观市面上大部分检测mirna的pcr试剂盒，都需额外制定特殊的mirna逆转录引物和定量pcr检测用上游和下游引物，从而带来的检测不方便。技术实现要素：本发明的目的是针对现有技术存在的问题，提供一种与冠状动脉狭窄相关的血清mirna检测试剂盒及其应用，本发明提供了完整的能够方便快捷的检测mir-19a的试剂盒，无需另外订制特殊引物序列。另一方面通过本试剂盒检测冠状动脉狭窄患者血清中循环mir-19a的表达水平和斑块组织中mir-19a的表达水平，探讨mir-19a在冠状动脉狭窄中表达以及临床意义，为冠状动脉狭窄的辅助诊断提供新的思路。为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：本发明提供一种mirna检测试剂盒，由逆转录试剂、qpcr试剂组成，所述逆转录试剂包括：10μmmirna逆转录引物、10μmu6逆转录引物、无核酸酶水、5×逆转录缓冲液、酶制剂；所述qpcr试剂包括：10μmmirnaqpcr上游引物、10μmmirnaqpcr下游引物、10μmu6qpcr上游引物、10μmu6qpcr下游引物、2×ultrasybrmixture、双蒸水。所述逆转录试剂中10μmmirna逆转录引物、10μmu6逆转录引物、无核酸酶水、5×逆转录缓冲液、酶制剂的体积比为1-2:1-2:20-30:8-10:2-3。所述逆转录试剂中，10μmmirna逆转录引物、10μmu6逆转录引物、无核酸酶水、5×逆转录缓冲液、酶制剂的体积比为1:1:20:8:2。所述qpcr试剂中，10μmmirnaqpcr上游引物、10μmmirnaqpcr下游引物、10μmu6qpcr上游引物、10μmu6qpcr下游引物、2×ultrasybrmixture、双蒸水的体积比为1:1:1:5:5。本发明还提供一种mirna检测试剂盒在诊断冠状动脉狭窄中的应用，通过mirna检测试剂盒检测血清中mir-19a的表达水平，作为识别冠脉狭窄程度的独立危险因素。判断依据为，当mir-19a的表达水平大于8.56时提示冠状动脉狭窄超过50％，当mir-19a的表达水平大于27.2时提示冠状动脉狭窄超过70％。与现有技术相比，本发明的有益效果是：1、本发明提供了完整的能够方便快捷的检测mir-19a的试剂盒，无需另外订制特殊引物序列。2、本发明公开了mir-19a在冠状动脉狭窄中表达以及临床意义，可成为冠状动脉狭窄的辅助诊断以及治疗的靶点。通过本发明中mir-19a检测试剂盒检测mir-19a的表达水平，证实了mir-19a在冠状动脉狭窄患者血清和斑块组织中表达升高，使得将mir-19a应用于诊断冠状动脉狭窄具有一定的临床意义，为冠状动脉狭窄的辅助诊断提供新的思路。附图说明图1为冠状动脉狭窄患者与正常对照组对比血清及斑块中mir-19a相对表达量；图2为不同程度冠状动脉狭窄患者血清中mir-19a的相对表达量；图3为中重度冠状动脉狭窄患者斑块与血清mir-19a相对表达量对比；图4为roc分析mir-19a对中重度冠状动脉狭窄患者的诊断能力。具体实施方式下面将结合本发明中的附图，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动条件下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。实施例1:本发明提供一种mirna检测试剂盒，包括以下组份：上述试剂盒组成可用于荧光定量pcr反应100次，在-20℃下保存，以上试剂来源由上述各试剂公司提供。本发明还提供了上述试剂盒在诊断冠状动脉狭窄中的应用，具体实施方式为：1、病例资料分析1.1.实验方法：收集经血管造影确诊为冠状动脉狭窄患者血清66例，根据血管造影检查管腔狭窄程度25％-49％患者12例，狭窄程度50％-69％患者31例，狭窄程度70％-100％患者23例。冠状动脉血管造影具体诊断指标按照中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会发布的《ws319冠状动脉粥样硬化性心脏病诊断标准2010》和2016年国际心血管ct协会scct发布的cad-rads系统，造影结果均显示边缘光滑的充盈缺损和向心性狭窄，内膜表面完整的斑块或管壁增厚，冠状动脉狭窄25％-49％为cad-rads2级，为轻度狭窄，冠状动脉狭窄程度50％-69％为cad-rads3级，为中度狭窄，冠状动脉狭窄程度70％-100％为cad-rads4-5级为重度及完全狭窄。同时选取50例无动脉粥样硬化临床表现的体检者作为正常对照组，所有外周血标本均在空腹采血完4小时之内经4℃1600g离心10分钟、4℃16000g离心10分钟分离血清后快速置于液氮速冻后储存于-80℃。1.2实验结果：66例冠状动脉狭窄组比较50例正常对照组的临床生化指标中甘油三酯(triglyceride，tg)、总胆固醇(totalcholesterol，tc)、低密度脂蛋白(lowdensitylipoproteincholesterol，ldl-c)、载脂蛋白b(apolipoproteinb，apob)均有明显升高，高密度脂蛋白(highdensitylipoproteincholesterol，hdl-c)明显降低，但载脂蛋白a(apolipoproteina，apoa)无明显差异(见表1)。表1：对照组与动脉粥样硬化病人组临床生化指标比较2、冠状动脉狭窄病人血清和斑块组织中mir-19a相对表达量1.实验方法1.1rna提取：病人组和对照组血清中mirna、斑块组织中的rna通过以下方法提取：①取出-80℃超低温冰箱保存的患者血清置于室温溶解，充分溶解后4℃；斑块组织经研磨器研碎。②吸取300μl血清/斑块组织，加入1mltrizolls溶液，迅速震荡摇匀30s，充分混匀样品。③加入200μl氯仿，强烈震荡20s后静置3min；④在4℃，12000g离心10min，样品会分成三层：黄色的有机相，中间层和无色的水相，rna主要在水相中。⑤小心将上层水层移至另一个新的离心管；⑥加入0.5ml异丙醇，充分混匀，静置10min，然后在4℃，12000g离心10min；⑦吸弃上清，加入用75％乙醇1ml，振荡器上剧烈摇荡离心管15s，充分混匀，在4℃，7500g离心5min；⑧吸弃上清，室温下干燥5min，加入25μldepc水溶解rna。1.2rna浓度检测和标化：分光光度计260nm和280nm波长下检测吸光度，并计算比值，确定rna的纯度及浓度，并按照检测结果取适量rna定量至1μg，备后续实验。1.3逆转录：反应条件：37℃条件下进行15分钟的逆转录反应，在98℃条件下进行5分钟酶失活反应。1.4定量pcr反应：反应条件：1.5real-timepcr结果分析：mirna的相对表达水平结果采用相对定量方法(2-δct)表示。同一样本的ct值减去其内参u6的ct值，获得δct值(△ctsample＝ctsample-ctu6sample)，每个样本重复三次。2.实验结果：qrt-pcr结果显示mir-19a在对照组和冠脉狭窄患者血清中相对表达量分别为2.94±1.06；17.59±3.77，mir-19a在对照组和冠脉狭窄患者斑块中相对表达量分别为3.14±2.36；22.59±4.58，冠脉狭窄患者血清及斑块中mir-19a的表达量明显高于对照组(图1)。mir-19a在冠状动脉狭窄程度25％-49％，50％-69％，70％-100％时相对表达量分别为2.14±0.92，5.88±2.21，25.5±24.1，mir-19a的表达量随着冠状动脉狭窄的严重程度明显升高。(图2)。检测14例有配对的血清和斑块组织的中重度冠状动脉狭窄的患者的mir-19a表达水平显示，两者之间无明显差异，p＝0.3(图3)。冠状动脉狭窄诊断的“金标准”为冠状动脉造影，而在临床上没有很好的血清学检测指标，在表1中比较了冠状动脉狭窄患者与对照组的临床指标看出ldl-c，tc，tni在两组间有显著性差异，根据这个线索针对中重度冠状动脉狭窄的患者绘制了mir-19a，ldl-c，tc，tni的roc曲线(图4)，mir-19a，ldl-c，tc，tni诊断冠状动脉狭窄的auc面积分别为0.816，0.688，0.538，0.564(表2)。mir-19a对于冠状动脉狭窄的诊断能力最强。通过应用mir-19a检测试剂盒检测不同程度的冠状动脉狭窄患者血清中循环mir-19a的表达水平和斑块组织中mir-19a的表达水平，66名确诊为冠心病的病人血清与50名体检结果正常的健康体检者的血清做对照，用qpcr方法检测mir-19a的表达，结果显示确诊为冠状动脉狭窄患者血清中mir-19a表达较健康体检者升高；进一步机制研究发现mir-19a通过mir-19a-hbp1-mif这一细胞内信号通路，促进巨噬细胞分泌炎症因子，趋化因子和吞噬脂质，具有促炎，促动脉粥样硬化形成作用。且在细胞和动物模型中证实。目前在临床上检测冠状动脉狭窄程度仍然只能依赖冠状动脉造影技术，但是此检测不仅有侵入性，而且价格昂贵难以对患者进行随访，通过检测不同程度的冠状动脉狭窄患者的mir-19a我们发现随着冠状动脉狭窄程度的增高，mir-19a的表达也随之升高，表明mir-19a可成为预测冠状动脉狭窄的辅助诊断分子标志物。具体的，当mir-19a的表达水平大于8.56时提示冠状动脉狭窄超过50％，当mir-19a的表达水平大于27.2时提示冠状动脉狭窄超过70％。表2.roc曲线分析血清mir-19a对冠状动脉狭窄患者鉴别诊断的能力auc下面积95％ci敏感性(％)特异性(％)p值mir-19a0.8160.690-0.94175.676.63.97×10-5ldl-c0.6880.554-0.82368.351.20.014tc0.5380.374-0.70263.643.30.62tni0.5640.411-0.71752.657.20.411尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。当前第1页12