植物作为宿主在表达重组人粒细胞集落刺激因子中的应用的制作方法

本发明涉及生物技术领域，特别涉及植物作为宿主在表达重组人粒细胞集落刺激因子中的应用。

背景技术：

粒细胞集落刺激因子(g-csf)是一种糖蛋白，主要由内毒素、tnf-a和ifn-r可活化单核细胞和巨噬细胞成熟，促进成熟细胞向外周血释放，并能促进巨噬细胞集嗜酸性细胞的多种功能。

粒细胞集落刺激因子(granulocytecolonystimulatingfactor，g-csf)基因全长2.5kb，包括5个外显子和4个内含子，人g-csf基因位于17号染色体，与小鼠g-csf基因约有73％同源性，与il-6无论在基因水平以及氨基酸水平上都有很高同源性，包括外显子、内含子组成，cys数目，两对二硫键位置以及分子的三级结构等。g-csf主要作用于中性粒细胞系造血细胞的增殖、分化和活化。在体外g-csf刺激骨髓造血祖细胞中中性粒细胞集落的形成，延长成熟中性粒细胞的存活时间，活化中性粒细胞如促进adcc，超氧阴离子的产生和碱性磷酸酶的合成。g-csf还具有对人粒细胞、单核细胞、成纤维细胞、平滑肌细胞以及成肌纤维细胞的趋化作用肿瘤患者注射g-csf后可提高血循环中中性粒细胞的水平，这种作用可能与缩短某些骨髓细胞进入s期的时间以及增加生成粒细胞的祖细胞数量有关。

因此，提供一种高效表达重组人粒细胞集落刺激因子的方法具有重要的现实意义。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明提供了植物作为宿主在表达重组人粒细胞集落刺激因子中的应用。本发明利用植物尤其是生菜作为重组蛋白生产的高效平台技术，表达了重组人粒细胞集落刺激因子。并且在温和的条件下成功分离出有活性的外源蛋白，证明植物尤其是生菜表达平台可以成功用来生产重组人粒细胞集落刺激因子蛋白。时间短(4d)，纯化简单，生产便捷。消除基因污染，消除感染人体的潜在病虫害等。大大降低生产成本，提高产品安全性。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了植物作为宿主在表达重组人粒细胞集落刺激因子中的应用。优选的，所述植物选自生菜、菠菜、番茄、萝卜、白菜、玉米、大豆、小麦或烟草；所述植物的器官选自种子、叶、根茎或整株植物。

本发明还提供了一种表达载体，包括重组人粒细胞集落刺激因子的序列以及载体。

在本发明的一些具体实施方案中，所述重组人粒细胞集落刺激因子的序列为将重组人粒细胞集落刺激因子的密码子优化为植物偏好的密码子，获得的优化重组人粒细胞集落刺激因子序列。

在本发明的一些具体实施方案中，所述优化的重组人粒细胞集落刺激因子的氨基酸序列如seqidno.1所示；所述优化的重组人粒细胞集落刺激因子的核苷酸序列如seqidno.2所示。

在本发明的一些具体实施方案中，所述载体为双元植物载体。

在本发明的一些具体实施方案中，所述表达载体的构建方法包括如下步骤：

步骤1：将重组人粒细胞集落刺激因子的密码子优化为植物偏好的密码子，获得：优化的重组人粒细胞集落刺激因子的序列；

步骤2：在所述优化的重组人粒细胞集落刺激因子的序列的5’末端加入xbal限制性酶切位点，在3’末端加入saci位点；

由金斯瑞克隆到puc57载体中，获得pcsf克隆载体；

步骤3：通过xbal/sacl从步骤2所得的克隆载体中获得基因片段，克隆至双元植物载体pcam35s，获得表达载体p35s-csf。

具体的，为了提供外援蛋白在植物中的高效表达，本发明将人类重组人粒细胞集落刺激因子氨基酸序列利用反翻译软件(https://www.ebi.ac.uk/tools/st/emboss_backtranseq/)得到核苷酸序列，并将其密码子优化为植物偏好的密码子，由金斯瑞公司(南京，中国)合成。在优化的重组人粒细胞集落刺激因子序列5’末端加入xbal限制性酶切位点，在3’末端加入sacl位点。并由金斯瑞克隆到puc57载体中，获得pcsf克隆载体(图1)。基因片段通过xbai/sacl从克隆载体中分离，并克隆到双元植物载体pcam35s，产生植物表达载体p35s-csf(图2)。

本发明还提供了所述的表达载体在表达重组人粒细胞集落刺激因子中的应用。

此外，本发明还提供了一种植物作为宿主表达重组人粒细胞集落刺激因子的方法，将本发明提供的表达载体转化到农杆菌中，通过农杆菌介导真空渗透入植物组织后，提取、分离蛋白质，获得重组人粒细胞集落刺激因子。

具体的，将植物表达载体p35s-csf通过用multiporator(eppendorf，hamburg，germany)电穿孔转化到根癌土壤杆菌gv3101中。将所得菌株均匀地铺展在含有卡那霉素抗生素(50mg/l)的选择性lb平板上。在黑暗中28℃孵育2d后，挑取单菌落接种到0.5lyeb(酵母提取物肉汤，5g/l蔗糖，5g/l胰蛋白胨，6g/l酵母提取物，0.24g/lmgso4，ph7.2)并补充抗生素液体培养基(50mg/l卡那霉素)。将接种的培养物在振荡器(220rpm)中以25～28℃孵育72h。通过添加yeb培养基测量od600值并调节至3.5～4.5。然后收集培养液，离心(4500转速)10min。将农杆菌细胞重悬在渗透培养基(10mmmes，10mmmgso4)中至o.d.600为0.5。

将制备好的含有p35s-csf农杆菌等量混匀至o.d.600为0.5；将培养悬浮液置于2l烧杯，并置于干燥器中。将本实验室保存的生菜倒置(核心向上)并轻轻地旋转于细菌悬浮液中，将干燥器密封。将真空泵(welchvacuum，niles，il，usa)打开以抽空，并且可见渗透液在叶片组织中。保持压力状态30～60s。快速打开该系统以释放压力，使渗透液渗入组织内的空间。该过程重复2～3次，直到清晰可见渗透液在生菜组织中扩散明显。然后将生菜组织从渗透液中轻轻取出，并用蒸馏水连续冲洗三次，然后转移到塑料膜覆盖的容器中。将处理的样品在黑暗中保持4d。

在本发明的一些具体实施方案中，所述农杆菌介导真空渗透包括如下步骤：

步骤1：抽真空25～45s；

步骤2：保持真空(-95kpa)压力30～60s；

步骤3：释放压力使得渗透液渗入所述植物组织；

重复上述步骤2～3次，避光处理4d。

在本发明的一些具体实施方案中，农杆菌具体为根癌土壤杆菌gv3101。本发明所述克隆pcsf基因片段，并且构建双元植物表达载体p35s-csf(图2)，在完成构建体后，用特异性限制酶消化证实基因片段是完整的。渗透后，绝大多数生菜组织在真空浸润过程中淹没，除了坚固的中肋区域外，其余部分均在真空渗透4天后显示淡黄褐色区域。

提取、分离蛋白质具体为：将经农杆菌真空渗透的生菜样品用搅拌器搅拌，并用体积比为1:1比例的提取缓冲液(100mmkpi，ph7.8；5mmedta；10mmβ-巯基乙醇)搅拌机中高速匀浆1～2min。将匀浆物调节至ph8.0，用纱布过滤，过滤物在4℃以10,000g离心15min以除去细胞碎片。收集上清液，与硫酸铵(50％)混合，并在冰上摇动孵育60min。通过离心机(10,000g)在4℃下再次分离15min。将得到的上清液进行第二轮硫酸铵(70％)沉淀，冰上摇动悬浮60min，再次在4℃下以10,000g离心15min。然后，弃去上清液，将处理样品沉淀蛋白质溶于5ml缓冲液(20mmkpi，ph7.8；2mm

edta；10mmβ-巯基乙醇)中并在4℃下储存。

sds-page凝胶电泳具体为：收集从农杆菌真空渗透生菜提取的纯化蛋白质，取样品(5μl)热变性(95℃)加载缓冲液(biorad，hercules，ca，usa)在4-12％bis-trisplussds-变性凝胶(thermofisherscientific，waltham，ma，usa)跑电泳。同样，在非变性凝胶电泳中检测抗体的亲和程度。然后用考马斯蓝g250(biorad)染色后再次对凝胶进行拍照。

植物来源的重组蛋白质的下游加工通常难于并且昂贵，因为纤维素细胞壁难以裂解以及次级植物代谢产物。我们用搅拌机搅拌匀浆，大大节省匀浆成本以及工艺。重组重组人粒细胞集落刺激因子经过变性凝胶sds-page分离我们在泳道中观察到估计分子量大约为22.3kda(图3)的条带，符合重组人粒细胞集落刺激因子蛋白分子量。基于bradford测定法和光密度测定对照组测定纯化样品的蛋白含量大约为1.81mg/g。

植物瞬时表达技术是在植物生长到一定阶段，利用多种不同的技术方式将含有目标蛋白的质粒转移到植物细胞中，在植物细胞中建立高效、可控的表达系统，获得该基因短暂的可控表达的技术。与稳定表达相比，瞬时表达所需时间短，不需要将外源基因整合到宿主植物染色体中，仅需几天的时间就可拿到实验结果。与细菌表达系统相比，植物表达系统可以对所表达的蛋白进行正确的折叠、加工、修饰，所生产的蛋白活性高于细菌表达系统；与动物细胞表达系统相比，植物表达系统的成本非常低，仅为其千分之一到千分之二。

本发明利用生菜来瞬时表达重组人粒细胞集落刺激因子，在较短的时间内(4d)可产生高含量的蛋白质。生菜是高等植物，可以进行翻译后修饰过程，即表达的蛋白自动具有活性。而且这种方法最大限度地减少了生物安全问题，因为处理过的生菜组织通常是在完全封闭的设施或容器中开发，不存在生物污染问题。生菜不含有植物有毒物质，而且其本身蛋白含量少，利于下游的蛋白纯化。利用生菜系统生产重组人粒细胞集落刺激因子，可以大大缩短生产周期和生产成本。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1示克隆载体pcsf示意图；

图2示重组人粒细胞集落刺激因子植物双元表达载体p35s-csf构建流程；利用限制性内切酶(xbal/saci)双酶切，从图1克隆载体切下重组人粒细胞集落刺激因子，连接入pcam35s的xbal/saci位点，生成植物双元表达载体p35s-csf；

lbandrb:ti质粒左右边界；35s，具有烟草花叶病毒(tmv)5‘utr的camv35s启动子；nptii，用于卡那霉素抗性的编码nptii基因的表达；nos3’，终止子；

图3示sds-page凝胶电泳结果；泳道1：非侵染生菜；泳道2：生菜表达的重组人粒细胞集落刺激因子；泳道3：重组人粒细胞集落刺激因子商业化产品；

图4示生菜表达的g-csf具有剂量依赖性刺激nfs-60细胞增殖的作用。

具体实施方式

本发明公开了植物作为宿主在表达重组人粒细胞集落刺激因子中的应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明通过实验发现，植物系统尤其是生菜系统是更加经济、高效的表达平台，是一种快速的瞬时表达重组蛋白质的方法。本发明描述的真空农杆菌渗透方法简单，快速，而且可以提高重组蛋白产量。生菜可以通过承受真空压力而增加蛋白质产量，并允许每片叶子更完整的渗透。由于生菜易于生长并且可商业上大量生产，因此比其他瞬时表达植物，如烟草等更容易获得并且更便宜，并且由于不需要复杂的特殊生产设备，成本可显著降低。综上所述，本发明可以利用生菜系统短时间内大规模生产重组人粒细胞集落刺激因子。

本发明提供的植物作为宿主在表达重组人粒细胞集落刺激因子中的应用中所用原料及试剂均可由市场购得。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1植物瞬时表达载体的构建

为了将外源蛋白在植物中的高效表达，将重组人粒细胞集落刺激因子氨基酸序列利用反翻译软件(https://www.ebi.ac.uk/tools/st/emboss_backtranseq/)得到核苷酸序列，并将其密码子优化为植物偏好的密码子，由金斯瑞公司(南京，中国)合成。在优化的重组人粒细胞集落刺激因子序列5'末端加入xbal限制性酶切位点，在3'末端加入sacl位点。并由金斯瑞公司克隆到puc57载体中，获得pcsf克隆载体(图1)，基因片段通过xbal/sacl从克隆载体中分离，并克隆到双元植物载体，pcam35s，产生植物表达载体p35s-csf(图2)。将植物表达载体通过用multiporator(eppendorf，hamburg，germany)电穿孔转化到根癌土壤杆菌gv3101中。将所得菌株均匀地铺展在含有卡那霉素抗生素(50mg/l)的选择性lb平板上。在黑暗中28℃孵育2d后，挑取单菌落接种到0.5lyeb(酵母提取物肉汤，5g/l蔗糖，5g/l胰蛋白胨，6g/l酵母提取物，0.24g/lmgso4，ph7.2)并补充抗生素液体培养基(50mg/l卡那霉素)。将接种的培养物在振荡器(220rpm)中以25～28℃孵育72h。通过添加yeb培养基测量od600值并调节至3.5～4.5。然后收集培养液，离心(4500转速)10min。将农杆菌细胞重悬在渗透培养基(10mmmes，10mmmgso4)中至o.d.600为0.5。

实施例2农杆菌介导的真空渗透

将制备好的含有p35s-csf农杆菌等量混匀至o.d.600为0.5。将培养悬浮液置于2l烧杯，并置于干燥器中。将本实验室保存的生菜倒置(核心向上)并轻轻地旋转于细菌悬浮液中，将干燥器密封。将真空泵(welchvacuum，niles，il，usa)打开以抽空，并且可见渗透液在叶片组织中。保持压力状态30～60秒。快速打开该系统以释放压力，使渗透液渗入组织内的空间。该过程重复2至3次，直到清晰可见渗透液在生菜组织中扩散明显。然后将生菜组织从渗透液中轻轻取出，并用蒸馏水连续冲洗三次，然后转移到塑料膜覆盖的容器中。将处理的样品在黑暗中保持4天。

实施例3蛋白质提取和分离

经农杆菌真空渗透的生菜样品用搅拌器搅拌，并用体积比为1:1比例的提取缓冲液(100mmkpi，ph7.8；5mmedta；10mmβ-巯基乙醇)搅拌机中高速匀浆1-2分钟。将匀浆物调节至ph8.0，用纱布过滤，过滤物在4℃以10,000g离心15分钟以除去细胞碎片。收集上清液，与硫酸铵(50％)混合，并在冰上摇动孵育60分钟。通过离心机(10,000g)在4℃下再次分离15分钟。将得到的上清液进行第二轮硫酸铵(70％)沉淀，冰上摇动悬浮60分钟，再次在4℃下以10,000g离心15分钟。然后，弃去上清液，将处理样品沉淀蛋白质溶于5ml缓冲液(20mmkpi，ph7.8；2mmedta；10mmβ-巯基乙醇)中并在4℃下储存。

植物来源的重组蛋白质的下游加工通常难于并且昂贵，因为纤维素细胞壁难以裂解以及次级植物代谢产物。我们用搅拌机搅拌匀浆，大大节省匀浆成本以及工艺。

实施例4sds-page凝胶电泳

收集从农杆菌真空渗透生菜提取的纯化蛋白质，取样品(5μl)热变性(95℃)加载缓冲液(biorad，hercules，ca，usa)在4～12％bis-trisplussds-变性凝胶(thermofisherscientific，waltham，ma，usa)跑电泳。同样，在非变性凝胶电泳中检测抗体的亲和程度。然后用考马斯蓝g250(biorad)染色后再次对凝胶进行拍照。重组重组人粒细胞集落刺激因子经过变性凝胶sds-page分离我们在泳道中观察到估计分子量大约为22.3kda(图3)的条带，符合重组人粒细胞集落刺激因子蛋白分子量。基于bradford测定法和光密度测定对照组测定纯化样品的蛋白含量大约为1.81mg/g。

实施例5重组人粒细胞集落刺激因子蛋白活性检测

用mtt法测定纯化所得gsf蛋白的促nfs-60细胞增殖活性。将传代培养正常的nfs-60细胞(美国atcc)用rpmi-1640培养基离心洗涤三次，将细胞按1×105个/ml的密度悬浮于富含5％马血清、5％胎牛血清的不含g-csf的rpmi-1640培养基中(v/v)。于96孔板中每孔加入50ul细胞悬液，设6复孔培养，除空白外，每孔中加入不同浓度的待测样品，同事选取商品化g-csf为阳性对照，37℃，5％co2，饱和湿度条件下培养48h后，每孔加入mtt工作液20ul，继续培养4h，每孔加入裂解液100ul，混匀后，放入酶标仪，于波长570nm处测定吸光度，记录测定结果。活性分析结果显示：生菜表达的g-csf具有剂量依赖性刺激nfs-60细胞增殖的作用，如图4。

本发明利用生菜来瞬时表达抗体，在较短的时间内(4d)可产生高含量的蛋白质。生菜是高等植物，可以进行翻译后修饰过程，即表达的蛋白自动具有活性。而且这种方法最大限度地减少了生物安全问题，因为处理过的生菜组织通常是在完全封闭的设施或容器中开发，不存在生物污染问题。生菜不含有植物有毒物质，而且其本身蛋白含量少，利于下游的蛋白纯化。利用生菜系统生产，可以大大缩短生产周期和生产成本。

实施例6

对照组：利用动物细胞生产重组人粒细胞集落刺激因子；

实验组1：本发明提供的植物生产重组人粒细胞集落刺激因子；

实验组2：利用烟叶生产重组人粒细胞集落刺激因子；

表1重组人粒细胞集落刺激因子

^*示与对照组相比p≤0.05；^**示与对照组相比p≤0.01；

^#示与实验组2相比p≤0.05；^##示与实验组2相比p≤0.01；

由表1可知，实验组1与对照组的动物系统相比，本发明提供的生菜瞬时表达重组人粒细胞集落刺激因子，极显著(p≤0.01)缩短了生产周期，极显著(p≤0.01)提高了蛋白含量，显著(p≤0.01)提高了蛋白活性，简化了蛋白纯化的难易程度，极显著(p≤0.01)降低了生产成本。

实验组1与实验组2的烟叶系统相比，生菜瞬时表达重组人粒细胞集落刺激因子，显著(p≤0.05)缩短了生产周期，显著(p≤0.05)提高了蛋白含量，显著(p≤0.05)提高了蛋白活性，简化了蛋白纯化的难易程度，极显著(p≤0.01)降低了生产成本。

实验组2与对照组相比，烟叶瞬时表达重组人粒细胞集落刺激因子比动物系统显著(p≤0.05)缩短了生产周期，简化了蛋白纯化的难易程度，显著(p≤0.05)降低了生产成本。

综合上述试验结果表明，植物系统尤其是生菜系统是更加经济、高效的表达平台。能够快速瞬时表达重组蛋白质，可以在短时间内大规模生产重组人粒细胞集落刺激因子。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110>王跃驹

<120>植物作为宿主在表达重组人粒细胞集落刺激因子中的应用

<130>mp1909371

<160>2

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>207

<212>prt

<213>recombinanthumangranulocytecolony-stimulatingfactor

<400>1

metalaglyproalathrglnserprometlysleumetalaleugln

151015

leuleuleutrphisseralaleutrpthrvalglnglualathrpro

202530

leuglyproalaserserleuproglnserpheleuleulyscysleu

354045

gluglnvalarglysileglnglyaspglyalaalaleuglnglulys

505560

leuvalserglucysalathrtyrlysleucyshisproglugluleu

65707580

valleuleuglyhisserleuglyileprotrpalaproleuserser

859095

cysproserglnalaleuglnleualaglycysleuserglnleuhis

100105110

serglyleupheleutyrglnglyleuleuglnalaleugluglyile

115120125

serprogluleuglyprothrleuaspthrleuglnleuaspvalala

130135140

aspphealathrthriletrpglnglnmetglugluleuglymetala

145150155160

proalaleuglnprothrglnglyalametproalaphealaserala

165170175

pheglnargargalaglyglyvalleuvalalaserhisleuglnser

180185190

pheleugluvalsertyrargvalleuarghisleualaglnpro

195200205

<210>2

<211>624

<212>dna

<213>recombinanthumangranulocytecolony-stimulatingfactor

<400>2

atggccggccccgccacccagagccccatgaagctgatggccctgcagctgctgctgtgg60

cacagcgccctgtggaccgtgcaggaggccacccccctgggccccgccagcagcctgccc120

cagagcttcctgctgaagtgcctggagcaggtgaggaagatccagggcgacggcgccgcc180

ctgcaggagaagctggtgagcgagtgcgccacctacaagctgtgccaccccgaggagctg240

gtgctgctgggccacagcctgggcatcccctgggcccccctgagcagctgccccagccag300

gccctgcagctggccggctgcctgagccagctgcacagcggcctgttcctgtaccagggc360

ctgctgcaggccctggagggcatcagccccgagctgggccccaccctggacaccctgcag420

ctggacgtggccgacttcgccaccaccatctggcagcagatggaggagctgggcatggcc480

cccgccctgcagcccacccagggcgccatgcccgccttcgccagcgccttccagaggagg540

gccggcggcgtgctggtggccagccacctgcagagcttcctggaggtgagctacagggtg600

ctgaggcacctggcccagccctga624