一种EB66细胞株悬浮生长无血清化学成分界定培养基及其制备方法与流程

本发明涉及培养基领域，具体为一种eb66细胞株悬浮生长无血清化学成分界定培养基。

背景技术：

eb66细胞株是由法国生物科技名企valneva从鸭胚胎干细胞中提取并驯化的可传代细胞。valneva总部坐落于法国里昂，致力于疫苗技术研发、生产和商业化创新，在疫苗领域拥有很高的国际影响。valneva选择未检出内源性逆转录酶病毒表达的鸭子，收集鸭胚胎，提取鸭胚胎干细胞，经过驯化传代得到的基因稳定的eb66细胞株，具有胚胎干细胞源性，无致瘤性，不经过任何基因改造，病毒和化学修饰。

eb66细胞株是鸭胚胎干细胞衍生细胞株，具有干细胞的源性，无致瘤性，已在美国fda备案，bmf中包括细胞株全部的历史，在多个国家拥有多项专利，在中国申请了五项专利保护。具有全悬浮无血清培养，倍增时间短，可高密度生长，病毒敏感性广等特性。eb66细胞株病毒易感性。

目前，大多数禽类疫苗如aiv、ndv、ibv、eds等基本依靠鸡胚或鸭胚生产，鸡胚作为病毒培养的基质，需要经过严格工序来保证其品质。首先，合格的鸡胚除了能正常生产禽流感病毒外，还应该是健康鸡群产下的受精卵，例如spf海兰白鸡；其次，生产中一般要求产蛋鸡的年龄不超过1周年；再者，为确保鸡群在生长过程中没有感染任何禽流感等相关疾病，必须经过定期检测，同时要严格确保受精卵内不能带有任何病毒。受到这些因素的限制，导致无特定病原体(spedficpathogenfree,spf)的鸡胚产量小、成本高，往往不能满足大批量生产禽流感疫苗的需求。除此之外，鸡胚培养还存在诸多问题，不同批次的鸡胚质量往往存在差异，难以控制品质，而不同质量的鸡胚会对病毒培养产生不同副作用，且鸡胚的来源容易受到禽流感疫情的影响；此外，鸡胚是许多细菌的天然宿主，容易受到环境中细菌的感染，己有研究者指出由母体遗传给鸡胚所带来的潜在污染比gmp车间无菌环境中人为操作所带来的污染化率大很多，而这也正是鸡胚培养过程中难以控制的地方。另外，在鸡胚的尿囊液中含有大量动物源蛋白，在提取病毒时易被带入病毒液中，导致成品疫苗中有大量动物源蛋白，从而引起过敏反应等副作用。

血清能为细胞提供生长增殖所需的激素、生长因子、转移蛋白和其它营养物质，但其存在诸多缺点：批间差异较大，来源不稳定，需要大量验证工作，价格昂贵，成分不明确，不利于疫苗和单克隆抗体等目的产品的分离纯化，容易被病毒和支原体感染等。无血清培养基是在基础培养基的基础上，加入血清替代成分，制备得到的培养基既能满足细胞的培养要求，又能有效避免因使用血清带来的诸多不利因素。研发一种培养eb66细胞用的无血清培养基，可有效降低后续病毒纯化的分离难度，同时也可有效提高疫苗的安全性。

本公司在多年前就开始了无血清培养基的研究，在专利zl201510965947.0中，公开了一种用于培养病毒的无血清培养基，该培养基由以下重量百分数计的组分制备而成：80-90％培养液、4-10％氨基酸、3-10％血清替代因子和0.05-0.5％抗氧化剂。同时还提供该培养基的制备方法：分别取配方量的培养液、氨基酸、血清替代因子和抗氧化剂，混合，即得。其用于培养病毒的无血清培养基，便于病毒繁殖结束后的病毒液的纯化，降低了疫苗生产成本；此外制备方法简单、易操作。但是上述的培养基经过试验并不能使eb66细胞株达到18*10⁶cells/ml的浓度，即使如该案所述，其氨基酸浓度达到了4-10的状态，其用于培养eb66细胞株，其细胞株峰值浓度低于10*10⁶cells/ml。

目前，国内没有适合eb66细胞株生长的无血清培养基，eb66细胞无血清细胞培养基在中国还是空白。但该细胞株在人用与兽用疫苗领域应用广泛，能够解决禽类疫苗使用鸡胚生产的瓶颈，所以开发出一款适合于eb66细胞生长的无血清化学成分界定的培养基非常重要。因此，本领域主要针对eb66细胞株开发一款无血清细胞培养基。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种eb66细胞株悬浮生长无血清化学成分界定培养基，该培养基支持eb66细胞在无血清、全悬浮的条件下快速增殖，倍增时间短。细胞呈现较高密度，同时，本发明还提供该培养基的制备方法。

在不做特殊说明的情况下，本发明的％、份均为重量百分百和重量份，m代表mol/l。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种eb66细胞株悬浮生长无血清化学成分界定培养基，所述培养基为以dmem：f12＝1:1的dmem/f12培养基为基础培养基添加氨基酸混合组分、添加剂a、pf-68、葡萄糖得到，添加剂a中各物质在所述培养基中浓度为：

胰岛素1-10mg/l；igf-1(胰岛素成细纤维细胞生长因子-1)5-10μg/l；腐胺0.5-2mg；谷胱甘肽0.5-5mg/l；乙醇胺1-5mg/l；β-巯基乙醇10-50μm；卵磷脂1-5mg/l；维生素c10-50mg/l；牛磺酸50-100mg/l；胆固醇2-5mg/l；谷氨酰胺3-6mm；

每1l培养基中所述氨基酸混合组分添加量为1000mg-3000mg；

所述氨基酸混合组分不含谷氨酰胺且各氨基酸比例与基础培养基中各氨基酸比例相同；

培养基中pf-68(嵌段式聚醚f-68)的浓度为1000mg/l；葡萄糖浓度为3000-5000mg/l。

上述基础培养基成分及其比例如下表1：

表1：dmem/f12培养基成分表

氨基酸混合组分参考表1中各除l-谷氨酰胺之外的氨基酸比例。

在上述的eb66细胞株悬浮生长无血清化学成分界定培养基中，所述培养基为以dmem：f12＝1:1的dmem/f12培养基为基础培养基添加氨基酸混合组分、添加剂a、pf-68、葡萄糖、添加剂b得到，添加剂b中各物质在所述培养基中浓度为：

na2seo35-10nm；mnso40.5-5nm；cuso45h2o5-10nm；znso47h2o1-5μm。

在上述的eb66细胞株悬浮生长无血清化学成分界定培养基中，所述培养基的ph为7.0-7.2。

在上述的eb66细胞株悬浮生长无血清化学成分界定培养基中，每1l培养基中所述氨基酸混合组分添加量为1000mg、2000mg或3000mg；

所述培养基中葡萄糖浓度为5000mg/l。

同时，本发明还提出一种如上所述的eb66细胞株悬浮生长无血清化学成分界定培养基的制备方法，包括如下步骤：

步骤1：以dmem：f12＝1:1的dmem/f12培养基为基础培养基，按照基础培养基的组分准备原料1，并按照浓度准备氨基酸混合组分、添加剂a、pf-68、葡萄糖；

步骤2：将步骤1准备的原料1、氨基酸混合组分、添加剂a、pf-68、葡萄糖用纯化水溶解后加入20000mg/l的碳酸氢钠，再用酸或碱调节ph值至7.0-7.2之间，过滤除菌，2-8℃保存。

在上述eb66细胞株悬浮生长无血清化学成分界定培养基的制备方法中，所述步骤1中，还准备添加剂b并加入到步骤2的纯化水中。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

在现有基础培养基dmem/f12中，主要包括氨基酸、维生素、无机盐、葡萄糖以及其他成分。此培养基，不是完全培养液，往往在培养其他细胞时需要额外添加血清才能保证细胞的生长和增殖。要使eb66细胞在基础培养基中能够无血清生长，则需要在基础培养基中额外添加一些血清替代物。如生长因子、激素、微量元素、脂类和肽类等，从而使细胞生长相当于完全培养液。如以上构思，即在dmem/f12培养基中添加化学成分明确的血清替代物和具有细胞保护作用防剪切力、抑制细胞成团的化合物组分等。

本发明培养基支持eb66细胞在无血清、全悬浮的条件下快速增殖，倍增时间短。细胞呈现较高密度。

附图说明

图1为本发明实施案例一至实施案例三、对比案例一、对比案例二的无血清化学成分界定培养基的细胞生长密度曲线图；

图2为本发明实施案例的eb66细胞在无血清化学界定培养基中的生长图片。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施案例一：一种低浓度的eb66细胞株悬浮生长的无血清化学界定培养基。

低浓度的eb66细胞无血清培养基的具体实施方法如：

将dmem/f12培养基(参考表1)中的所有氨基酸取除谷氨酰胺后，配置成一种混合的氨基酸混合物干粉组分即氨基酸混合组分，混合均匀磨细。在实际应用中，也可以按照dmem/f12培养基成分表中的氨基酸组分进行人工配制氨基酸混合物干粉。

再以dmem/f12培养基为基础培养基，在dmem/f12培养基的基础上添加1000mg/l的如上所提取的氨基酸混合组分，配制成低营养的无血清培养基。

其中，无血清培养基中除了具备基础培养基所含各物质外，还具有如下浓度的各物质：

胰岛素2mg/l

igf-15μg/l

腐胺0.5mg

谷胱甘肽1mg/l

乙醇胺1mg/l

β-巯基乙醇10μm

卵磷脂1mg/l

维生素c10mg/l

牛磺酸50mg/l

胆固醇2mg/l

l-谷氨酰胺4mm

pf-681000mg/l

na2seo35nm

mnso41nm

cuso4·5h2o5nm

znso4·7h2o1μm。

将以上组分完全溶解在1000ml的纯化水中，然后添加2000mg/l的碳酸氢钠，再用1n氢氧化钠或1n盐酸调ph值到7.0-7.2之间。

需要说明的是，以上额外添加的各物质用量均为最终得到的无血清培养基中各物质的浓度，在最终得到的无血清培养基中各额外添加的物质浓度如上。

实施案例二：中等浓度的一种eb66细胞株悬浮生长的无血清化学界定培养基。

中等浓度的eb66细胞无血清培养基的具体实施方法如下：

将dmem/f12中的所有氨基酸取除谷氨酰胺后，配置成一种混合的氨基酸混合物干粉组分，混合均匀磨细。

再以dmem/f12培养基为基础培养基，在dmem/f12的基础上添加2000mg/l的氨基酸浓度，配制成中营养的无血清培养基。

其中，无血清培养基中除了具备基础培养基所含各物质外，还具有如下浓度的各物质：

将以上组分完全溶解在1000ml的纯化水中，然后添加2000mg/l的碳酸氢钠，将ph值调节到7.0-7.2之间。

需要说明的是，以上额外添加的各物质用量均为最终得到的无血清培养基中各物质的浓度，在最终得到的无血清培养基中各额外添加的物质浓度如上。

实施案例三：高浓度的一种eb66细胞株悬浮生长的无血清化学界定培养基。

高浓度的eb66细胞无血清培养基的具体实施方法如：

将dmem/f12中的所有氨基酸取除谷氨酰胺后，配置成一种混合的氨基酸混合物干粉组分，混合均匀磨细。

再以dmem/f12培养基为基础培养基，在dmem/f12的基础上添加3000mg/l的氨基酸浓度，配制成高营养的无血清培养基。

其中，无血清培养基中除了具备基础培养基所含各物质外，还具有如下浓度的各物质：

将以上组分完全溶解在1000ml的纯化水中，然后添加2000mg/l的碳酸氢钠，将ph值调节到7.0-7.2之间。

需要说明的是，以上额外添加的各物质用量均为最终得到的无血清培养基中各物质的浓度，在最终得到的无血清培养基中各额外添加的物质浓度如上。

对比案例一：过低浓度的一种eb66细胞株悬浮生长的无血清化学界定培养基。

过低浓度的eb66细胞无血清培养基的具体实施方法如下：

将dmem/f12中的所有氨基酸取除谷氨酰胺后，配置成一种混合的氨基酸混合物干粉组分，混合均匀磨细。

再在dmem/f12的基础上添加1000mg/l的氨基酸浓度，配制成低营养的无血清培养基。其中

胰岛素1mg/l

igf-12.5μg/l

腐胺0.25mg

谷胱甘肽0.5mg/l

乙醇胺0.5mg/l

β-巯基乙醇5μm

卵磷脂0.5mg/l

维生素c5mg/l

牛磺酸25mg/l

胆固醇1mg/l

l-谷氨酰胺2mm

pf-68500mg/l

na2seo32.5nm

mnso40.5nm

cuso4·5h2o0.25nm

znso4·7h2o0.5μm

将以上组分完全溶解在1000ml的纯化水中，然后添加2000mg/l的碳酸氢钠，将ph值调节到7.0-7.2之间。

对比案例二：高浓度的一种eb66细胞株悬浮生长的无血清化学界定培养基。

高浓度的eb66细胞无血清培养基的具体实施方法如：

将dmem/f12中的所有氨基酸取除谷氨酰胺后，配置成一种混合的氨基酸混合物干粉组分，混合均匀磨细。

再在dmem/f12的基础上添加3000mg/l的氨基酸浓度，配制成高营养的无血清培养基。

其中：

胰岛素15mg/l

igf-115μg/l

腐胺3mg

谷胱甘肽7.5mg/l

乙醇胺6mg/l

β-巯基乙醇75μm

卵磷脂7.5mg/l

维生素c75mg/l

牛磺酸150mg/l

胆固醇7.5mg/l

l-谷氨酰胺7.5mm

pf-681500mg/l

na2seo315nm

mnso47.5nm

cuso4·5h2o15nm

znso4·7h2o7.5μm

将以上组分完全溶解在1000ml的纯化水中，然后添加2000mg/l的碳酸氢钠，将ph值调节到7.0-7.2之间。

综上所述五种具体实施案例，测试eb66细胞在营养浓度低、中、高、过低、过高五种培养基中的生长趋势。选择最优选的培养基。

上述具体实施案例一至实施案例三以及对比案例一和对比案例二培养eb66细胞；

培养结果参考图1，图1中我们可以看出，培养基浓度过高则导致细胞过快增值，细胞衰亡过快。

若培养基浓度过低，则细胞增值速度过慢、细胞密度过低。

所以本发明的培养基中各物质浓度的范围选择是合理的。

图2示出了实施案例一在第三天的eb66细胞在无血清化学界定培养基中的生长图片。

综上：eb66细胞株无血清化学成分界定的培养基，够使eb66细胞株在悬浮的状态下增殖快、倍增时间短。培养基不含动物来源成分和植物水解物，培养基化学成分明确，性能稳定。疫苗纯化简单、成本低。

声明：eb66细胞株是鸭胚胎干细胞衍生的传代细胞系，该细胞株的所有权利属于法国valneva公司，甘肃健顺生物科技有限公司拥有该细胞株在中国的独家代理权。本发明仅对eb66细胞无血清培养基的专利，并不是对该细胞株进行任何的修饰后的专利，eb66细胞株所属的任何权利属于法国valneva公司。

对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。