凡纳滨对虾微卫星分子标记特异性引物及其在遗传多样性分析中的应用的制作方法

本发明属于分子生物学dna分子标记技术领域，尤其是一种凡纳滨对虾微卫星分子标记特异性引物及其在遗传多样性分析中的应用。

背景技术：

凡纳滨对虾(litopenaeusvannamei)，又名南美白对虾、万氏对虾、白对虾，隶属于对虾科(penaeidae)、对虾属(penaeus)，原产于中、南美洲太平洋沿岸的温暖水域。因其具有适应盐度范围广、生长速度快、抗病能力强、肉质鲜美等特点，目前已成为中国和世界上最主要的养殖对虾种类。然而，随着高密度养殖及生态环境的恶化，对虾疾病的频繁暴发，给越南、中国、马来西亚等诸多国家的对虾产业带来了巨大的经济损失，严重制约了对虾产业的进一步发展。

微卫星标记(又称简单重复序列，simplesequencerepeats，ssr)，具有多态性高，稳定性好，呈共显性遗传的特点，是一种理想的分子标记。微卫星标记技术已被广泛应用于遗传图谱构建、家系鉴定、遗传多样性分析及分子标记育种等研究领域。目前，已发表的有效的凡纳滨对虾微卫星标记远远不能满足上述研究的需求。因此，亟需加强凡纳滨对虾微卫星标记的开发。

随着高通量测序技术的飞速发展，ncbi上凡纳滨对虾的测序数据显著增多，采用生物信息学方法对已有测序数据进行微卫星标记挖掘，能够大大提高标记开发的效率，节省开发成本。因此，利用ncbi数据库中sra数据获得的微卫星标记特异性引物对于今后凡纳滨对虾的遗传多样性、种质鉴定与评估、功能基因定位、分子标记育种研究具有重要意义。

通过检索，发现如下一篇与本发明专利申请相关的专利公开文献：

1、凡纳滨对虾est微卫星标记的特异引物及其应用(cn101942437b)，其特异引物共5对，核苷酸序列如seqidno：1～10所示。本发明还公开了特异引物在筛选凡纳滨对虾est微卫星标记、凡纳滨对虾种质资源多样性分析、遗传多样性分析、家系鉴定、分子群体遗传学研究、遗传图谱的构建、重要经济性状的定位、功能基因的研究、辅助凡纳滨对虾分子遗传育种或养殖中的应用。与现有技术相比，本发明公开的微卫星标记的特异引物具有高效、简便、快速筛选所需微卫星标记的特点。

(1)数据来源不同，专利cn101942437b利用ncbi数据库中的凡纳滨对虾est数据进行微卫星标记筛选，本发明利用ncbi数据库中的凡纳滨对虾sra数据进行微卫星筛选，

(2)标记的特异性引物序列不同。

(3)检测方法不同：专利cn101942437b利用聚丙烯酰胺凝胶电泳进行检测，本发明用毛细管电泳进行检测，精确度更高。

2、一种用于凡纳滨对虾种质鉴定的分子标记组合及其应用(cn105861729a)，分子标记组合为13对高多态性微卫星位点的引物；利用所述13对高多态性微卫星标记建立了种质鉴定的方法，对现有国外进口种质包括但不限于正大品种、sis品种、科拿湾品种(konabay)、莫洛凯品种(molokai)等，以及国内人工选育种质包括但不限于“科海1号”、“桂海1号”等品种进行微卫星分型，获得的分型数据构建不同种质资源的分子数据库，利用分子标记实现不同种质的鉴定。对于未知来源的凡纳滨对虾可以使用该panel分型后与已建立的不同种质资源的数据库进行比较，鉴定其种质来源。本专利提供了一种利用分子手段准确鉴定凡纳滨对虾不同种质材料的方法，对于不同种质溯源、评价、保护和利用具有重要的意义。

(1)微卫星标记的特异性引物不同。

(2)专利cn105861729a根据13对微卫星标记对于凡纳滨对虾5个群体的分型数据建立种质资源分子数据库，进行种质鉴定。本发明利用11对微卫星标记对5个凡纳滨对虾群体进行遗传多样性分析，并根据遗传距离构建进化分析树。

(3)群体不同，专利cn105861729a的群体为：正大、sis、科拿湾、科海1号及桂海1号，本发明涉及的5个群体为日夜快、普利茂、科海1号、海兴农及天津本地土苗群体。

3、一种凡纳滨对虾lve165微卫星dna标记的检测方法(cn102146460a)，一种利用上述引物的pcr反应体系以及一种凡纳滨对虾lve165微卫星dna标记的检测方法，包括先提取凡纳滨对虾基因组并稀释备用，再利用凡纳滨对虾lve165微卫星dna核心序列，在其序列两端设计特异性引物，然后使用该引物对凡纳滨对虾不同群体或者群体内个体的基因组dna进行pcr扩增，并对产物进行分析，确定每个个体的基因型，从而获得多态性遗传变异图谱。本发明主要应用于凡纳滨对虾种质资源和遗传多样性分析，分子群体遗传学，遗传图谱的构建等。

(1)序列不同，cn102146460a利用ncbi数据库中的凡纳滨对虾est数据进行微卫星标记筛选，本发明利用ncbi数据库中的凡纳滨对虾sra数据进行微卫星筛选。

(2)标记的特异性引物序列不同。

(3)检测方法不同：专利cn102146460a利用聚丙烯酰胺凝胶电泳进行检测，本发明用毛细管电泳进行检测，精确度更高。

4、一种凡纳滨对虾fx151微卫星dna标记鉴定fx151遗传变异图谱的方法(cn101967519a)，包括以下步骤：先提取凡纳滨对虾基因组并稀释备用，再利用凡纳滨对虾fx151微卫星dna核心序列，在其序列两端设计特异性引物，然后使用该引物对凡纳滨对虾不同群体或者群体内个体的基因组dna进行pcr扩增，对pcr产物进行变性聚丙烯酰胺凝胶检测；利用产物出现的条带银染显色后进行分析，确定每个个体的基因型，从而获得凡纳滨对虾在fx151遗传标记基因座位的多态性遗传变异图谱。本发明可快捷的获得凡纳滨对虾fx151遗传标记基因座位呈现高度遗传变异的多态性图谱，方便简单，所得结果可直观检测出凡纳滨对虾每个个体的基因型。

(1)标记的特异性引物序列不同。

(2)检测方法不同：专利cn101967519a利用聚丙烯酰胺凝胶电泳进行检测，本发明用毛细管电泳进行检测，精确度更高。

5、一种凡纳滨对虾comp60701微卫星标记候选序列的筛选方法(cn108467893a)，包括以下步骤：(1)筛选候选序列(2)筛选候选微卫星位点(3)设计特异性引物。本发明在没有已知的凡纳滨对虾全基因组dna微卫星多态性位点的信息下，通过转录组混合样测序，构建转录序列，利用生物信息学分析筛选comp60701微卫星标记多态性位点；为凡纳滨对虾comp60701微卫星标记多态性筛选及检测打下基本，在此基本上可采用软件primer3设计特异性引物，不仅可便捷的通过聚丙酰胺凝胶电泳完成凡纳滨对虾comp60701微卫星标记多态性检测、验证及基因分型，而且筛选检测费用低、操作简便快速。

(1)序列来源不同，专利cn108467893a通过15个凡纳滨对虾混合样本测序获得转录本，而本发明通过ncbi数据库中已经公开的sra序列进行微卫星标记筛选，节约了时间和试验成本。

(2)标记的特异性引物序列不同。

(3)检测方法不同：专利cn108467893a利用聚丙烯酰胺凝胶电泳进行检测，本发明用毛细管点用进行检测，精确度更高。

通过对比，本发明专利申请与上述专利公开文献存在本质的不同。

技术实现要素：

本发明目的在于克服现有技术中凡纳滨对虾选育过程中微卫星标记不足的不足之处，提供一种凡纳滨对虾微卫星分子标记特异性引物及其在遗传多样性分析中的应用，该微卫星标记稳定可靠，可用于凡纳滨对虾种群的遗传多样性分析、种质鉴定与评估、功能基因定位及分子育种研究。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种凡纳滨对虾微卫星分子标记特异性引物，分别命名为lavtf001、lavtf003、lavtf005、lavtf006、lavtf007、lavtf015、lavtf018、lavtf022、lavtf025、lavtf028及lavtf029，包含22个特异性引物序列，具体为：

lvatf001：f：其核苷酸序列为seqidno：1，r：其核苷酸序列为seqidno：2；

lvatf003：f：其核苷酸序列为seqidno：3，r：其核苷酸序列为seqidno：4；

lvatf005：f：其核苷酸序列为seqidno：5，r：其核苷酸序列为seqidno：6；

lvatf006：f：其核苷酸序列为seqidno：7，r：其核苷酸序列为seqidno：8；

lvatf007：f：其核苷酸序列为seqidno：9，r：其核苷酸序列为seqidno：10；

lvatf015：f：其核苷酸序列为seqidno：11，r：其核苷酸序列为seqidno：12；

lvatf018：f：其核苷酸序列为seqidno：13，r：其核苷酸序列为seqidno：14；

lvatf022：f：其核苷酸序列为seqidno：15，r：其核苷酸序列为seqidno：16；

lvatf025：f：其核苷酸序列为seqidno：17，r：其核苷酸序列为seqidno：18；

lvatf028：f：其核苷酸序列为seqidno：19，r：其核苷酸序列为seqidno：20；

lvatf029：f：其核苷酸序列为seqidno：21，r：其核苷酸序列为seqidno：22。

一种如上所述的凡纳滨对虾微卫星分子标记特异性引物在遗传多样性分析中的应用方法，步骤如下：

⑴从genbank数据库搜索并下载凡纳滨对虾的转录组测序sra数据；

⑵将步骤⑴中获得的原始序列数据由sra格式先转化为fastq格式，然后去除接头及低质量序列，利用trinity软件对得到的高质量序列进行装配拼接，得到转录组unigenes；

⑶利用misa软件对转录组unigenes进行检测，选择含有微卫星位点的序列，利用primer3软件针对微卫星侧翼序列进行引物设计；

⑷使用凡纳滨对虾肌肉组织提取基因组dna，用步骤⑶设计的微卫星引物对不同凡纳滨对虾个体的基因组dna模板进行pcr扩增；

⑸对步骤⑷中的pcr产物进行毛细管电泳检测，筛选出具有多态性扩增位点的引物；

⑹利用步骤⑸中筛选的微卫星引物进行凡纳滨对虾群体遗传多样性分析：选取不同地区的人工养殖凡纳滨对虾群体，计算各个微卫星位点的等位基因组成，基因杂合度、遗传距离及多态信息含量pic，并根据遗传距离对所鉴定的凡纳滨对虾群体进行聚类；

⑺根据ssr标记的多态性，选取pic>0.25的位点，即得凡纳滨对虾微卫星分子标记。

而且，所述步骤⑴中genbank数据库为http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank。

而且，所述步骤⑶中设计引物的原则为：①引物序列由18～25个碱基组成；②产物长度在100～200bp之间；③3’端不应超过3个连续的g或c；④正反向引物之间不存在互补或互补性低；⑤引物的gc含量为40％～60％。

而且，所述步骤⑷中pcr扩增的反应体系为：10×buffer2μl，dntps0.5μl，dmso0.5μl，5μm的正反引物分别0.5μl，taq酶1u，50～100ng基因组dna，加纯水至总体积为20μl；

pcr扩增的反应程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环；72℃延伸10min，最后4℃保存。

而且，所述步骤⑸中利用abi3730appliedbiosystems基因分析仪进行毛细管电泳检测，使用3730datacollection和genemapperv4.0软件收集数据。

而且，所述步骤⑹中遗传多样性分析方法为：利用popgene32计算等位基因数、有效等位基因数、观测杂合度、期望杂合度、等位基因频率及遗传距离；

其中，遗传距离利用mega软件构建upgma聚类树，利用等位基因频率计算多态信息含量。

如上所述的凡纳滨对虾微卫星分子标记特异性引物在凡纳滨对虾群体的遗传多样性分析、种质鉴定与评估、功能基因定位、分子标记育种方面中的应用。

本发明取得的优点和积极效果为：

1、本发明的核心是11个微卫星dna标记的特异性引物，在凡纳滨对虾种群中呈现出高度遗传多样性。

2、本发明方法利用已有转录组测序sra数据，采用生物信息学方法进行微卫星标记开发，操作简单，稳定可靠，大大提高了标记开发的效率，降低了传统基因组微卫星标记的开发成本。

3、本发明获得的微卫星标记稳定可靠，可用于今后凡纳滨对虾的种群的遗传多样性分析、种质鉴定与评估、功能基因定位及分子育种研究。

附图说明

图1为本发明中upgma聚类树示意图，即基于nei氏遗传距离构建的5个群体的聚类树。

具体实施方式

下面详细叙述本发明的实施例，需要说明的是，本实施例是叙述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。

本发明中所使用的原料，如无特殊说明，均为常规的市售产品；本发明中所使用的方法，如无特殊说明，均为本领域的常规方法。

一种凡纳滨对虾微卫星分子标记特异性引物，分别命名为lavtf001、lavtf003、lavtf005、lavtf006、lavtf007、lavtf015、lavtf018、lavtf022、lavtf025、lavtf028及lavtf029，包含22个特异性引物序列，具体为：

lvatf001：f：其核苷酸序列为seqidno：1，r：其核苷酸序列为seqidno：2；

lvatf003：f：其核苷酸序列为seqidno：3，r：其核苷酸序列为seqidno：4；

lvatf005：f：其核苷酸序列为seqidno：5，r：其核苷酸序列为seqidno：6；

lvatf006：f：其核苷酸序列为seqidno：7，r：其核苷酸序列为seqidno：8；

lvatf007：f：其核苷酸序列为seqidno：9，r：其核苷酸序列为seqidno：10；

lvatf015：f：其核苷酸序列为seqidno：11，r：其核苷酸序列为seqidno：12；

lvatf018：f：其核苷酸序列为seqidno：13，r：其核苷酸序列为seqidno：14；

lvatf022：f：其核苷酸序列为seqidno：15，r：其核苷酸序列为seqidno：16；

lvatf025：f：其核苷酸序列为seqidno：17，r：其核苷酸序列为seqidno：18；

lvatf028：f：其核苷酸序列为seqidno：19，r：其核苷酸序列为seqidno：20；

lvatf029：f：其核苷酸序列为seqidno：21，r：其核苷酸序列为seqidno：22。

较优地，所述凡纳滨对虾微卫星分子标记特异性引物在遗传多样性分析中的应用方法，步骤如下：

⑴从genbank数据库搜索并下载凡纳滨对虾的转录组测序sra数据；

⑵将步骤⑴中获得的原始序列数据由sra格式先转化为fastq格式，然后去除接头及低质量序列，利用trinity软件对得到的高质量序列进行装配拼接，得到转录组unigenes；

⑶利用misa软件对转录组unigenes进行检测，选择含有微卫星位点的序列，利用primer3软件针对微卫星侧翼序列进行引物设计；

⑷使用凡纳滨对虾肌肉组织提取基因组dna，用步骤⑶设计的微卫星引物对不同凡纳滨对虾个体的基因组dna模板进行pcr扩增；

⑸对步骤⑷中的pcr产物进行毛细管电泳检测，筛选出具有多态性扩增位点的引物；

⑹利用步骤⑸中筛选的微卫星引物进行凡纳滨对虾群体遗传多样性分析：选取5个不同地区的人工养殖凡纳滨对虾群体，计算各个微卫星位点的等位基因组成，基因杂合度、遗传距离及多态信息含量pic，并根据遗传距离对所鉴定的凡纳滨对虾群体进行聚类；

⑺根据ssr标记的多态性，选取pic>0.25的位点，即得凡纳滨对虾微卫星分子标记。

较优地，所述步骤⑴中genbank数据库为http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank。

较优地，所述步骤⑶中设计引物的原则为：①引物序列由18～25个碱基组成；②产物长度在100～200bp之间；③3’端不应超过3个连续的g或c；④正反向引物之间不存在互补或互补性低；⑤引物的gc含量为40％～60％。

较优地，所述步骤⑷中pcr扩增的反应体系为：10×buffer2μl，dntps0.5μl，dmso0.5μl，5μm的正反引物分别0.5μl，taq酶1u，50～100ng基因组dna，加纯水至总体积为20μl；

pcr扩增的反应程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环；72℃延伸10min，最后4℃保存。

较优地，所述步骤⑸中利用abi3730appliedbiosystems基因分析仪进行毛细管电泳检测，使用3730datacollection和genemapperv4.0软件收集数据。

较优地，所述步骤⑹中遗传多样性分析方法为：利用popgene32计算等位基因数、有效等位基因数、观测杂合度、期望杂合度、等位基因频率及遗传距离；

其中，遗传距离利用mega软件构建upgma聚类树，利用等位基因频率计算多态信息含量。

如上所述的凡纳滨对虾微卫星分子标记特异性引物在凡纳滨对虾群体的遗传多样性分析、种质鉴定与评估、功能基因定位、分子标记育种方面中的应用。

具体地，上述凡纳滨对虾微卫星分子标记特异性引物在遗传多样性中的应用方法，步骤如下：

(1)从ncbi(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)数据库搜索并下载凡纳滨对虾的转录组测序sra数据。

(2)获得的原始序列数据由sra格式先转化为fastq格式，然后去除接头及低质量序列，利用trinity软件对得到的高质量序列进行装配拼接，得到转录组unigenes。

(3)利用misa(microsatelliteidentificationtool)软件对转录组unigenes进行检测，选择含有微卫星位点的序列，利用primer3软件针对微卫星侧翼序列进行引物设计。

(4)使用凡纳滨对虾肌肉组织提取基因组dna，用设计的微卫星引物对不同凡纳滨对虾个体的基因组dna模板进行pcr扩增。

(5)对扩增的pcr产物进行毛细管电泳检测，筛选出具有多态性扩增位点的引物。

(6)利用多态性的微卫星引物对凡纳滨对虾5个群体进行遗传多样性分析。计算各个微卫星位点的等位基因组成，基因杂合度、遗传距离及多态信息含量(pic)。

所述遗传多样性分析方法为：利用popgene32计算等位基因数(na)、有效等位基因数(ne)、观测杂合度(ho)、期望杂合度(he)、等位基因频率及遗传距离。根据遗传距离利用mega软件构建upgma聚类树，利用等位基因频率计算多态信息含量(pic)。

(7)根据ssr标记的多态性，选取pic>0.25的位点用于后续凡纳滨对虾种群的遗传多样性分析、种质鉴定与评估、功能基因定位及分子育种研究。

更具体地，上述凡纳滨对虾微卫星分子标记特异性引物在遗传多样性分析中的应用方法，步骤如下：

1、转录组序列的获得

从ncbi(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)数据库搜索并下载凡纳滨对虾的转录组测序sra数据。获得的原始序列数据由sra格式先转化为fastq格式，然后去除接头及低质量序列，利用trinity软件对得到的高质量序列进行装配拼接，得到转录组unigenes。

2、微卫星标记挖掘

利用misa软件对转录组unigenes进行检测，筛选重复单元碱基为2～6bp，重复次数大于5次的微卫星位点，根据微卫星的侧翼序列进行引物设计。

3、微卫星标记的引物设计

利用primer3软件针对选取位点的侧翼序列进行引物设计。设计引物的原则为：(1)引物序列由18～25个碱基组成；(2)产物长度在100～200bp之间；(3)3’端不应超过3个连续的g或c；(4)正反向引物之间不存在互补或互补性低；(5)引物的gc含量为40％～60％，得到的微卫星序列如下表1：

表1所得11对引物的基本信息

4、凡纳滨对虾基因组dna提取

使用海洋动物组织基因组dna提取试剂盒提取凡纳滨对虾肌肉组织dna，将其稀释到50ng/μl使用。

5、引物筛选

(1)pcr扩增

以不同凡纳滨对虾个体的基因组dna模板进行pcr扩增。pcr反应体系为：10×buffer2μl，dntps0.5μl，dmso0.5μl，5μm的正反引物分别0.5μl，taq酶1u，50～100ng基因组dna，加纯水至总体积为20μl。扩增程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环；72℃延伸10min，最后4℃保存。

(2)毛细管电泳检测

加入毛细管电泳所用的gs500lz内标，处理后用abi3730(appliedbiosystems)基因分析仪进行毛细管电泳检测，使用3730datacollection和genemapperv4.0软件收集数据。

6、群体遗传多样性分析

选取具有多态性的11个荧光引物对扩增的pcr产物进行群体遗传多样性分析。根据每个位点扩增产物的等位基因大小确定基因型。将数据整理储存在excel中，转换为txt文档，利用数据格式转化软件convert131转换为popgene32的输入格式，之后利用popgene32计算等位基因数、有效等位基因数、观测杂合度、期望杂合度、等位基因频率及遗传距离，根据等位基因频率计算多态信息含量(pic)。如表2所示，在5个群体样本中这11个微卫星标记遗传多样性分析的结果表明：11个位点中，7个位点表现为高多态信息含量(pic>0.5)，4个位点为中度多态信息含量(0.25<pic<0.5)。11个微卫星位点的平均等位基因数为3.909～5.273个，平均有效等位基因数为2.345～3.272个，平均观测杂合度在0.566～0.634，平均期望杂合度在0.463～0.551。从而证明本发明筛选的微卫星标记具有多态性。根据群体之间的遗传距离利用mega软件构建upgma聚类树。结果如图1所示：5个群体分为两支，kh、ryk、hxn和prm四个群体遗传关系较近，聚为一支，tm与上述四个群体遗传关系较远，单独成一支。第一支中，kh和ryk遗传关系最近，首先聚在一起，然后再与hxn聚在一起，最后与prm聚到一起。本发明的11个微卫星标记能很好的应用于凡纳滨对虾群体的遗传多样性分析、种质鉴定与评估、功能基因定位、分子标记育种等研究。

表25个群体在11个位点中的遗传多样性指数

尽管为说明目的公开了本发明的实施例，但是本领域的技术人员可以理解：在不脱离本发明及所附权利要求的精神和范围内，各种替换、变化和修改都是可能的，因此，本发明的范围不局限于实施例和附图所公开的内容。

序列表

<110>天津市水产研究所

<120>凡纳滨对虾微卫星分子标记特异性引物及其在遗传多样性分析中的应用

<160>22

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>21

<212>dna

<213>lvatf001：f(unknown)

<400>1

acgttcctgtctttctcccag21

<210>2

<211>20

<212>dna

<213>lvatf001：r(unknown)

<400>2

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<210>3

<211>20

<212>dna

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<210>4

<211>20

<212>dna

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<400>4

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<210>5

<211>21

<212>dna

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<400>5

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<210>6

<211>20

<212>dna

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<400>6

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<210>7

<211>20

<212>dna

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<400>7

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<210>8

<211>20

<212>dna

<213>lvatf006：r(unknown)

<400>8

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<211>20

<212>dna

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<211>20

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<211>20

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<211>20

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<210>15

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<211>21

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<210>17

<211>20

<212>dna

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<211>20

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<400>18

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<210>19

<211>20

<212>dna

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<400>19

acctgctgactttccgtgac20

<210>20

<211>23

<212>dna

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<210>21

<211>20

<212>dna

<213>lvatf029：f(unknown)

<400>21

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