一株土壤嗜冷杆菌及其在农业固废低温需氧发酵的应用的制作方法

本发明属于农业微生物
技术领域：
，具体涉及一株土壤嗜冷杆菌及其在农业固废低温需氧堆肥发酵的应用。
背景技术：
：需氧发酵是一个复杂的生物化学反应过程，是将有机物如（纤维素、半纤维素、木质素、蛋白质、氨基酸、脂肪等）分解为无机物，矿物化的过程。低温需氧发酵的微生物过程大致可分为四个阶段：第一个阶段，低温菌株（如芽孢菌）在低温条件下，通过特殊的生理机制降解糖、淀粉、氨基酸等简单的有机物，并提高堆肥温度，从而启动中温菌株（如发酵菌、真菌等）；第二阶段，中温菌株利用可溶性和易降解的有机物作为营养和能量来源，继续分解有机物，迅速增殖，并协同多种酶类分解蛋白质、部分半纤维素和纤维素、木质素，同时释放大量热量，从而使堆肥温度不断上升，高温菌株被激活（如放线菌、真菌等）；第三阶段，高温菌被激活后产生大量胞外淀粉酶、耐高温淀粉酶、纤维素酶和分泌蛋白酶等多种酶类，有机物被大量降解，腐殖质开始形成，高温阶段起到了有效杀灭固废中病原物、寄生虫、草籽，使大量水分蒸发，加快腐熟等重要作用。温度达到70℃以上时，微生物大量死亡或处于休眠状态，在各种酶的作用下，有机质继续分解，热量会由于微生物的死亡或休眠，酶的作用消退而逐渐降低，当温度降至50℃左右时，中温菌又重新活跃起来，分解剩余的纤维素等物质；第四阶段，腐熟阶段，在高温末期，只剩下部分较难分解的有机物和新形成的腐殖质，此时微生物活性下降，热量减少，温度下降，中温菌株又活跃起来，对残留的较难分解的有机物进一步分解，腐殖质不断增多且趋于稳定化，此时发酵进入腐熟阶段。我国是农业大国，畜牧业大国，畜禽粪便的无害化处理已成了迫在眉睫的问题。我国农作物种植面积巨大，植物秸杆产量丰富。植物秸杆是一种富有多种有机物的生物质资源，但我国对秸杆利用程度低下，70%左右直接丢弃与燃烧，不仅在资源上造成严重浪费，而且带来严重的环境污染。我国农业固废70%为畜禽粪便，畜禽粪便是一种碳氮比较低，含有大量有机质和较多水分的n源供体，并具有较快的转化效率。畜禽粪便多为自然堆肥、制作沼气等，但实际效果并不尽理想。在全世界将畜禽粪便作为肥料用于土壤的改良、改造已有着悠久的历史，经过腐熟发酵处理后的畜禽粪便内含有丰富的n、p、k等农作物生长所必需的营养物质，同时还可以减少化肥的使用量，在一定程度上降低了对环境的污染，对土壤的破坏。农业固废需氧发酵的无害化处理有着广阔的发展前景，已得到全世界的广泛关注与应用，需氧发酵可以使农业固废为原料，在一定温度、菌系等作用下转化为无机物，解决农业固废的再利用问题，还可改善土壤。但低温条件下启动需氧发酵相对困难，是发酵过程中仍存在的一个普遍性问题，这就使得发酵周期长，周转慢，生产成本高。需氧发酵是一个极其复杂的需氧消化过程，是各种菌系协同作用的结果，在低温需氧发酵过程中添加适宜的低温菌，对于改善发酵周期具有极大的意义。寻找适宜在低温条件下生的微生物，优化发酵条件，对解决我国北方寒冷季节区域需氧发酵周期长，效率低的问题具有重要意义，并具有可观的经济效益。技术实现要素：为了解决低温条件下农业固废堆肥需氧发酵启动慢，耗时长，生产成本高等问题，本发明提供一种耐低温，可以低温环境下快速启动发酵，快速升温的嗜冷杆菌，低温条件下，提高畜禽粪便堆肥需氧发酵温度是技术关键，它决定着能否快速进入高温期并影响发酵的无害化进程和反应周期。低温菌株在低温条件下通过特殊的生理机制降解糖、淀粉等简单的有机物并提高堆肥温度，从而启动中温菌株，继而高温菌株大量繁殖，完成全部分解腐熟的过程。本发明为实现上述目的所采用的技术方案是：一株土壤嗜冷杆菌，所述菌株为土壤嗜冷杆菌，分离菌株命名为土壤嗜冷杆菌dl1901（psychrobactersp.sod-dl1901），已于2019年6月6日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国武汉，武汉大学；保藏日期为2019年6月6日，保藏号为cctccno:m2019443。上述土壤嗜冷杆菌在农业固体废弃物的需氧堆肥发酵中的应用。其中，所述菌株的筛选方式为：取样品，以100ml/10g的比例加入无菌生理盐水，摇床150r/min，震荡，稀释涂布于初筛培养基低温培养，挑取生长菌落转接纯培养。其中，初筛培养基为：磷酸氢二钾0.1%、半胱氨酸0.025%、酵母粉0.2%、琼脂2%、乙酸钠0.25%、硫酸镁0.01%、葡萄糖0.2%、大豆蛋白胨0.5%，用纯化水配制，ph值7.2，37℃培养24-48h。其中，采集高寒地区冻土层，风干处理后用研钵研磨成粉状得到样品。本发明的有益效果为：解决低温条件下农业固废堆肥需氧发酵启动慢，耗时长，能耗多，生产成本高等问题，可在低温环境下快速启动发酵，快速升温的嗜冷杆菌，所述菌株启动需氧发酵的温度范围为5-25℃。附图说明图1是平板菌落形态图。图2是革兰氏染色镜检结果。图3是与genebank中相关序列blast比对结果。图4是基于16srdna序列的psychrobactersp.sod-dl1901系统发育树。图5是6个监测点升温情况。具体实施方式下面结合具体实施例对本发明作进一步解释说明，应理解这些实施例仅用于说明本发明而不限制本发明的范围，在阅读了本发明之后，本领域技术人员对本发明的各种等价形式的修改均落入本申请所附权利要求所限定的范围。1、样品采集：采集高寒地区冻土层。2、样品做风干处理。3、将风干样品用研钵研磨成粉状后，取10g至100ml无菌生理盐水，摇床150r/min震荡30min，即获得样品悬液，然后依次进行10倍稀释，将稀释液涂布于初筛培养基，10～20℃培养。5、初筛培养基：磷酸氢二钾0.1%（质量百分比，下同）、半胱氨酸0.025%、酵母粉0.2%、琼脂2%、乙酸钠0.25%、硫酸镁0.01%、葡萄糖0.2%、大豆蛋白胨0.5%，用纯化水配制。6、固体培养基中生长菌微隆起，圆润，表面光滑，菌落适中，有粘性，呈奶白色，不透明。革兰氏染色阳性杆菌，如图1-2。7、挑取待检菌分别接种于na液体培养基，37℃振摇培养过夜。dna提取.8、16s基因克隆测序引物：27f：5-agagtttgatcctggctcag-31492r：5-ctacggctaccttgttacga-39、pcr扩增反应体系（25ul）：基因组dna1.0ul，10×buffer(含2.5mmmg2+)2.5ul，taq聚合酶(5u/μl)0.5ul，dntp（10mm）1.0ul，27f(10um)0.5ul，1492r(10um)0.5ul，ddh2o0.5ul。10、pcr反应条件：94℃预变性5min；94℃变性30s，58℃退火45s，72℃延伸80s，共35个循环；72℃延伸7min，最后4℃无限循环。11、在genbank上查找与土壤嗜冷杆菌的同源性在99.67%。12、该分离菌株命名为土壤嗜冷杆菌dl-1901（psychrobactersp.sod-dl1901）。13、实施本发明的土壤嗜冷杆菌在农业固体废弃物处理中的启动低温条件下的好氧发酵。将该土壤嗜冷杆菌在lb液体培养基中培养24h后，以占10%的发酵菌接种到农业固体废弃物发酵反应堆中，此好氧发酵的起步温度为5～20℃，堆成温度为20℃，12h接近30℃，24h即可接近到60℃，48h最高温度达到近70℃，大大缩短了低温条件下好氧发酵要经过4～7d达到最高温度70℃所需要的时间。14、lb培养基:酵母粉5g/l，蛋白胨10g/l，nacl10g/l，琼脂粉15g/l，去离子水1000ml，ph7.0。15、外界温度-24℃，堆体约490m3。设6个温度探头，0-96h温度监测情况见下表及附图4。时间监测点0h12h24h48h72h96h18184959677221021486271753152550607073415257280787952130687776856254752687172。以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本
技术领域：
的技术人员在本发明披露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。序列表<110>大连泰丰昌农业科技有限公司<120>一株土壤嗜冷杆菌及其在农业固废低温需氧发酵的应用<160>1<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>1500<212>dna<213>土壤嗜冷杆菌dl1901(psychrobactersp.sod-dl1901)<400>1ggttaccttgttacgacttcaccccagtcatcaaccacaccgtggtgaacgccttcctta60cggttaggctatccacttctggtgcaatcaactcccatggtgtgacgggcggtgtgtaca120aggcccgggaacgtattcaccgcggcattctgatccgcgattactagcgattcctacttc180atggagtcgagttgcagactccaatctggactacgataggctttttgagattcgcatcac240atcgctgtgtagctgccctctgtacctaccattgtagcacgtgtgtagccctggtcgtaa300gggccatgatgacttgacgtcgtccccgccttcctccagtttgtcactggcagtatcctt360agagttcccggcttaacccgctggtaactaaggacaggggttgcgctcgttgcgggactt420aacccaacatctcacgacacgagctgacgacagccatgcagcacctgtattctaattccc480gaaggcactcccgcatctctgcaggattctagatatgtcaagaccaggtaaggttcttcg540cgttgcatcgaattaaaccacatgctccaccgcttgtgcgggcccccgtcaattcatttg600agttttaaccttgcggccgtactccccaggcggtctacttattgcgttagctgcgtcact660aagtcctcaagggacccaacgactagtagacatcgtttacggcgtggactaccagggtat720ctaatcctgtttgctacccacgctttcgaacctcagtgtcaatatgatgccagaaggctg780ccttcgccatcggtattcctccagatctctacgcatttcaccgctacacctggaattcta840ccttcctctcacctattctagcctaacagtatcagatgcagttcccaggttaagcccggg900gatttcacatctgacttatcaagccacctacgctcgctttacgcccagtaattccgatta960acgcttgcaccctctgtattaccgcggctgctggcacagagttagccggtgcttattctg1020cagctaatgtcatcgtccatgggtattaaccatggagtcttcttcactgcttaaagtgct1080ttacaaccaaaaggccttcttcacacacgcggcatggctggatcagggttgcccccattg1140tccaatattccccactgctgcctcccgtaggagtccgggccgtgtctcagtcccggtgtg1200gctgatcatcctctcagaccagctacagatcgtcgccatggtaggcctttaccccaccat1260ctagctaatccgacttaggctcatctaatagcgagagcaacaagttgccccctttctccc1320gtaggtcgtatgcggtattaattcgagtttccccgagctatcccccactactaggtagat1380tcctaagtattactcacccgtccgccgctcgacgcctgttagcaagctatcatcgtttcc1440gctcgacttgcatgtgttaagcctgccgccagcgttcaatctgagccaggatcaaactct1500当前第1页12