一种生产迷迭香酸的菌株及方法与流程

本发明涉及一种生产迷迭香酸的菌株及方法，属于生物工程技术领域。

背景技术：

迷迭香酸(rosmarinicacid，ra)，是一种天然的多酚类化合物。在结构上，ra是由咖啡酸(caffeicacid)和d-丹参素(d-danshensu)所组成的酯，广泛分布于唇形科、紫草科、葫芦科、椴树科、伞形科等植物中，尤以唇形科和紫草科中含量最高。ra作为迷迭香中最有效的抗氧化成分，已被美国食品药物管理局(fda)认可为“公众安全食品”。早在1998年nakamura等就提出邻二酚羟基是清除自由基活性的物质基础，而c3位的共轭双键具有增效作用(ohtoy,murakamia,nakamuray,etal.superoxidescavengingactivityofrosmarinicacidfromperillafrutescensbrittonvar.acutaf.viridis[j].journalofagriculturalandfoodchemistry,1998,46(11):4545-4550)。近几年的研究表明，迷迭香酸对多种疾病有明显的作用，迷迭香酸在抗氧化、抑制病原微生物、抗癌抗肿瘤、抗炎活性和免疫抑制活性、抗血栓、抗血小板凝集、抗抑郁、防辐射、防止细胞损伤及记忆损伤等方面都具有良好的生物活性。随着人们对迷迭香酸生物学活性及体内代谢特征的不断研究，越来越多的生物活性被开发出来。因此，进一步地合理开发、利用迷迭香酸使其为人类所用，将成为以后的研究热点。

目前迷迭香酸的工业化生产还不成熟，且大都处于实验室阶段。其小量制备主要有以下两种方式：1)通过对唇形科植物进行纤维素酶酶解法、超声法、回流法处理，再进一步获得迷迭香酸；2)利用化学合成的方法制备迷迭香酸。从植物中提取迷迭香酸，方法简便，易于实现，产品质量得到保障。但是此方法需要大量的有机溶剂，提取耗时长并且迷迭香酸的回收率不高。通过化学合成的方法虽然能成功合成迷迭香酸，但由于原料和试剂成本昂贵，反应过程中产生许多副产物，并且合成步骤较长，反应剧烈不易控制等缺点，使得化学合成方法不适合工业化生产。除此之外，由于迷迭香酸是重要的食品、药物、保健品的原材料，因此通过化学方法得到的产品不受人们欢迎。目前市场上的这一类物质主要从植物中提到得到，例如，中国发明专利cn108658769a公开了一种基于响应面法夏枯草迷迭香酸的提取工艺；中国发明专利cn107935855a通过回流法从迷迭香中提取迷迭香酸的方法。由于植物资源及其含量的限制，并且提取过程繁琐、复杂，使得这些产品价格昂贵，因此通过微生物法生产受到了广泛的关注。

2014年，bloch等人提出以大肠杆菌自身代谢产生的酪氨酸和4-羟基苯丙酮酸为底物，在羟基酸脱氢酶的作用下将内源的4-羟基苯丙酮酸转化成4-羟基苯乳酸，随后通过从大肠杆菌克隆的羟化酶hpabc进行间羟基化，得到3,4-二羟基苯乳酸；而在另一边是以内源性的酪氨酸为底物生成咖啡酸，首先以酪氨酸在酪氨酸氨裂解酶作用下生成对香豆酸，然后也是通过从大肠杆菌克隆的羟化酶hpabc进行间羟基化得到咖啡酸，得到咖啡酸后在4-香豆酸-coa连接酶的作用下生成咖啡酰辅酶a，最终咖啡酰辅酶a和3,4-二羟基苯乳酸在迷迭香酸合成酶作用下经过72小时后转化得到1.8±0.3μm迷迭香酸(constructionofachimericbiosyntheticpathwayforthedenovobiosynthesisofrosmarinicacidinescherichiacoli.chembiochem,15(16):2393-2401(2014))。但这些方法中hpabc酶活力较低，导致迷迭香酸的产量极低。也有文献尝采用过表达4-香豆酸-coa连接酶和迷迭香酸合成酶的大肠杆菌来转化咖啡酸和丹参素生成迷迭香酸，但由于缺少辅酶及快速再生体系，产量也极低(synthesisofrosmarinicacidanaloguesinescherichiacoli,biotechnollett38:619–627(2016))。

技术实现要素：

[技术问题]

本发明要解决的技术问题是以酚酸为底物合成迷迭香酸，提高生物法或酶法合成迷迭香酸的产量。同时，克服现有的生物合成法只能合成d-迷迭香酸的问题。

[技术方案]

本发明提供了以酚酸为底物合成迷迭香酸的方法，所述酚酸为咖啡酸和丹参素；咖啡酸被4-香豆酸辅酶a连接酶(4-coumarate:coaligase)与辅酶a(coa)连接生成咖啡酰辅酶a(caffeyl-coa)，迷迭香酸合成酶(rosmarinicacidsynthase)利用atp的能量将咖啡酰辅酶a和丹参素合成为迷迭香酸。在此过程中coa被释放，atp被水解成amp。多聚磷酸激酶2-ii(polyphosphatekinase2-ii，ppk2-ii)将amp生成为adp，进一步adp被多聚磷酸盐激酶2-i(polyphosphatekinase2-i,ppk2-i)实现atp的再生。

在一种实施方式中，所述4-香豆酸辅酶a连接酶为来自于scutellariabaicalensis、ocimumtenuiflorum、ocimumbasilicum、arabidopsisthaliana、penicilliumchrysogenum、streptomycescoelicolora3(2)、rhodococcusjostiirha1。或者，所述4-香豆酸辅酶a连接酶，其氨基酸序列是ncbi上accessionno.为bad90936.1、ado16242.1、agp02119.1、aad47193.1、caa04820.1、cab95894.1、abg96911.1的序列。或者，4-香豆酸辅酶a连接酶的核苷酸序列是ncbi上accessionno.为ab166767.1region:42..1691、hm990148.1region:1..1704、kc576841.1region:1..1704、af106086.1region:67..1737、aj001540.1region:89..1825、al645882region:complement(4799896..4801464)、cp000431.1region:complement(5466961..5468496)的序列。

在一种实施方式中，所述多聚磷酸盐激酶2-i为来自于sinorhizobium_meliloti。或者，所述多聚磷酸盐激酶2-i，其氨基酸序列是ncbi上accessionno.为np_384613.1的序列。或者，多聚磷酸盐激酶2-i的核苷酸序列是ncbi上accessionno.为nc_003047region:complement(564142..565044)的序列。

在一种实施方式中，所述迷迭香酸合成酶为来自于plectranthusscutellarioides、lavandulaangustifolia、melissaofficinalis、salviamiltiorrhiza、coffeacanephora、nicotianatabacum、dianthuscaryophyllus。或者，所述迷迭香酸合成酶，其氨基酸序列是ncbi上accessionno.为cak55166.1、abi48360.1、cbw35684.1、ada60182.1、abo47805.1、cae46932.1、cab06430.1的序列。或者，迷迭香酸合成酶的核苷酸序列是ncbi上accessionno.为am283092.1、dq886904.1region:51..1433、fr670523.1、fj906696.1、ef137954.1region:3..1307、aj582651.1、z84386.1region:137..1477的序列。

在一种实施方式中，所述多聚磷酸盐激酶2-ii为来自于acinetobacterjohnsonii。或者，所述多聚磷酸盐激酶2-ii，其氨基酸序列是ncbi上accessionno.为bac76403.1的序列。或者，多聚磷酸盐激酶2-ii的核苷酸序列是ncbi上accessionno.为ab092983region:339..1766的序列。

在一种实施方式中，所述丹参素是d-丹参素或者l-丹参素。当丹参素是l-丹参素时，迷迭香酸合成酶选择来自coffeacanephora或dianthuscaryophyllus的迷迭香酸合成酶。

本发明还提供了一种能够以酚酸为底物合成迷迭香酸的重组细胞或一种能够以酚酸为底物合成迷迭香酸的重组细胞的组合，所述单个重组细胞表达了4-香豆酸辅酶a连接酶(4-coumarate:coaligase)、迷迭香酸合成酶(rosmarinicacidsynthase)、多聚磷酸激酶2-ii(polyphosphatekinase2-ii，ppk2-ii)、多聚磷酸盐激酶2-i(polyphosphatekinase2-i,ppk2-i)；所述重组细胞的组合包含分别表达4-香豆酸辅酶a连接酶、迷迭香酸合成酶、多聚磷酸激酶2-ii、多聚磷酸盐激酶2-i中的一种或以上的重组细胞，由这多个重组细胞共同配合以实现合成迷迭香酸的目的。

所述重组细胞或者重组细胞的组合可以选择大肠杆菌为宿主，例如escherichiacolibl21(de3)。

所述4种酶可以在宿主中借助载体进行表达融合表达或共表达，或者整合到宿主的基因组上进行表达。所述4种酶借助载体进行表达时，可以选择一个或多个载体表达4种酶中的一种或多种。

特别地，本发明还提供了一种能够以咖啡酸、l-丹参素为底物合成l-迷迭香酸的重组细胞，所述重组细胞表达了coffeacanephora或dianthuscaryophyllus来源的编码迷迭香酸合成酶的基因，以及编码多聚磷酸盐激酶2-i、多聚磷酸盐激酶2-ⅱ、4-香豆酸辅酶a连接酶的基因。所述重组细胞以大肠杆菌为宿主，以prsfduet-1为载体表达编码多聚磷酸盐激酶2-i、多聚磷酸盐激酶2-ⅱ的基因，以ptduet-1为载体表达编码4-香豆酸辅酶a连接酶、迷迭香酸合成酶的基因。每个基因前均包含t7启动子和rbs结合点，每个基因后带有t7终止子。

本发明还提供了一种全细胞催化生产迷迭香酸的方法，是利用本发明的重组细胞或者重组细胞的组合为全细胞催化剂，以咖啡酸和d-丹参素(l-丹参素)为底物合成迷d-迭香酸(l-迭香酸)。所述全细胞催化剂的制备，是培养、繁殖重组细胞或者重组细胞的组合，并使得重组细胞或者重组细胞的组合表达所述4种酶，然后收集重组细胞。使用所述全细胞催化剂时，除了提供底物，还需要维持适当的温度和ph，必要时还提供一些辅酶或者营养物质，以帮助全细胞催化剂更好地发挥催化作用。

在一种实施方式中，所述全细胞转化生产的体系中，包括细胞湿重为1-200g/l，丹参素(d或l)1-100g/l，咖啡酸1-100g/l，atp0-1g/l，coa0-1g/l，六聚偏磷酸钠300g/l，ph5.0-9.0；于15-40℃反应，时间1-48小时。

[有益效果]

本发明构建了强化表达4种酶的基因工程菌应用于迷迭香酸的生产。本发明采用的底物为咖啡酸和丹参素，咖啡酸和丹参素这两种酚酸易于得到。

本发明通过合理的表达策略，在表达4-香豆酸辅酶a连接酶、迷迭香酸合成酶的同时，还表达了多聚磷酸激酶2-ii、多聚磷酸盐激酶2-i，实现了atp和coa的双辅酶再生，有效地保证了酶催化反应的持续进行，并提高了迷迭香酸的产量。

自然界中迷迭香酸的丹参素基团部分均匀为d型，因此，常见的迷迭香酸均是d型的。本发明获得了能够以l-丹参素为底物的迷迭香酸合成酶，在此基础上，以l-丹参素和咖啡酸为原料，通过生物法合成得到了l-迷迭香酸。

附图说明

图1实施例4中合成得到的迷迭香酸的液相图谱。

图2实施例6中合成得到的迷迭香酸的液相图谱。

具体实施方式

1、本发明所涉及的菌株及质粒

购自novagen公司的prsfduet-1、petduet-1、pcdfduet-1、pacycduet-1质粒和escherichiacolibl21(de3)。

2、多基因共表达体系的构建及细胞的培养

目前大肠杆菌多基因共表达的有多种方法(例如：“大肠杆菌多基因共表达策略，中国生物工程杂志，2012，32(4):117-122”这篇文章所记载的方法)，本发明采用刘向磊的博士论文(合成生物学技术改造大肠杆菌生产莽草酸及白藜芦醇，2016，上海医药工业研究院)所记载的方法来构建重组大肠杆菌。下述实施例中，共表达多基因时，每个基因前均包含t7启动子和rbs结合点，每个基因后带有t7终止子。理论上来讲，因为每个基因前都有t7和rbs，因此，基因的表达强度受基因在质粒上的排列次序的影响不大。将构建好的质粒热转导入大肠杆菌感受态细胞中，并涂布于单抗或混合抗生素固体平板上，筛选得到阳性转化子，即得到重组大肠杆菌。

细胞的培养：根据经典的重组大肠杆菌培养及诱导表达方案，将重组大肠杆菌按体积比为2％的量转接到lb发酵培养基(蛋白胨10g/l、酵母粉5g/l、nacl10g/l)中，当细胞od600达到0.6-0.8后，加入终浓度为0.4mm的iptg，在20℃诱导表达培养8h。诱导表达结束后，4℃、8000rpm、20分钟离心收集细胞。

3、相关酶的选择

(1)多聚磷酸盐激酶2-i

选择源于sinorhizobium_meliloti的编码多聚磷酸盐激酶2-i的基因smpkk，基因smpkk在ncbi上accessionno为nc_003047region:complement(564142..565044)，对应的氨基酸序列是np_384613.1。

(2)多聚磷酸盐激酶2-ii

选择源于acinetobacterjohnsonii的编码多聚磷酸盐激酶2-ii的基因ajpkk，基因ajpkkncbi上accessionno.为ab092983region:339..1766的序列，对应的氨基酸序列是bac76403.1。

(3)4-香豆酸辅酶a连接酶

参见实施例1。

(4)迷迭香酸合成酶

参见实施例2。

4、样品的检测分析

迷迭香酸含量测定方法根据文献进行测定(enhancedaccumulationofcaffeicacid,rosmarinicacidandluteolin-glucosideinredperillacultivatedunderreddiodelaserandblueledilluminationfollowedbyuv-airradiation.journaloffunctionalfoods2(2010)66–70)。丹参素、咖啡酸、迷迭香酸的溶解度较低，本发明中的转化过程会加入过量底物，底物会边反应边溶解，产物则在高浓度情况下会边反应边析出，测定时加入纯水使之完全溶解后测定。

迷迭香酸合成酶活力根据文献测定：rosmarinicacidsynthaseisanewmemberofthesuperfamilyofbahdacyltransferases,planta,2006,224:1503–1510.

4-香豆酸辅酶a连接酶活力根据文献测定：4-coumarate:coaligasefromcellsuspensionculturesofpetroselinumhortensehoffm.arch.biochem.biophys.1977,184,237-248

比酶活(umg^-1)定义为每mg酶所具有的酶活力单位。一个酶活力单位(u)定义为1min生成1μmol产物所需的酶量。

实施例1：4-香豆酸辅酶a连接酶的筛选与表达

4-香豆酸辅酶a连接酶广泛各类生物体中，分别根据scutellariabaicalensis、ocimumtenuiflorum、ocimumbasilicum、arabidopsisthaliana、penicilliumchrysogenum、streptomycescoelicolora3(2)、rhodococcusjostiid在ncbi上的4-香豆酸辅酶a连接酶基因信息全合成得到4-香豆酸辅酶a基因sb4cl、ot4cl、ob4cl、at4cl、pc4cl、sc4cl、rj4cl。氨基酸序列在ncbi上accessionno为：bad90936.1、ado16242.1、agp02119.1、aad47193.1、caa04820.1、cab95894.1、abg96911.1。将合成得到的基因连接到petduet-1载体上，并在escherichiacolibl21(de3)中得到诱导表达。诱导表达方法：将重组大肠杆菌按体积比为2％的量转接到lb发酵培养基(蛋白胨10g/l、酵母粉5g/l、nacl10g/l)中，当细胞od600达到0.6-0.8后，加入终浓度为0.4mm的iptg，在20℃诱导表达培养8h。诱导表达结束后，4℃、8000rpm、20分钟离心收集细胞。破胞后histag标签法纯化酶，得到纯酶后测定活性。

当以咖啡酸和辅酶a为底物时，4-香豆酸辅酶a连接酶基因sb4cl、ot4cl、ob4cl、at4cl、pc4cl、sc4cl、rj4cl各自表达的酶的比酶活分别为：152、143、161、179、202、174、88u/mg。

实施例2：迷迭香酸合成酶的筛选与表达

迷迭香酸合成酶主要存在于植物中，根据plectranthusscutellarioides、lavandulaangustifolia、melissaofficinalis、salviamiltiorrhiza、coffeacanephora、nicotianatabacum、dianthuscaryophyllus在ncbi上的迷迭香酸合成酶基因信息全合成了迷迭香酸合成酶基因psras、laras、moras、smras、ccras、ntras、dcras。氨基酸序列在ncbi上accessionno为：cak55166.1、abi48360.1、cbw35684.1、ada60182.1、abo47805.1、cae46932.1、cab06430.1的序列。将合成得到的基因分别连接到petduet-1载体上，与实施例1同样的方法表达纯化。

以咖啡酰辅酶a和d-丹参素为底物时，迷迭香酸合成酶基因psras、laras、moras、smras、ccras、ntras、dcras各自表达的酶的比酶活分别为：410、320、414、233、361、521、371u/mg。

以咖啡酰辅酶a和l-丹参素为底物时，迷迭香酸合成酶基因psras、laras、moras、smras、ccras、ntras、dcras各自表达的酶的比酶活分别为：0、0、0、0、120、0、142u/mg。可见，只有ccras、dcras编码的迷迭香酸合成酶具有以l-丹参素为底物合成迷迭香酸的能力。

实施例3:同时表达4种酶的重组大肠杆菌的构建

重组大肠杆菌构建：

如表1所示，从petduet-1、pacycduet-1、prsfduet-1、pcdfduet-1四种质粒中进行选择，将编码四种酶的基因连接到同一个质粒上，或者分别连接到两个质粒上(每个质粒上表达2个基因)，或者分别连接到四个质粒上(每个质粒上表达1个基因)。每个基因前均包含t7启动子和rbs结合点，每个基因后均带有t7终止子。将构建得到的重组质粒转化入大肠杆菌escherichiacolibl21中，利用混合抗生平板筛选得到阳性转化子，即得到可强化表达4个基因的重组大肠杆菌。

对重组大肠杆菌进行诱导表达，诱导表达完成后收集菌体，于100ml反应体系中，细胞湿重为200g/l，d-丹参素20g/l，咖啡酸20g/l，coa1g/l，atp1g/l，六聚偏磷酸钠60g/l，ph8；于30℃反应，反应时间24小时。丹参素和咖啡酸的溶解度均很小，因此是边转化边溶解，转化结束后将溶液稀释后利用液相色谱测定反应液中迷迭香酸的浓度，结果如表1所示。

表1

实施例4：应用四种酶体外合成迷迭香酸

将smpkk、ajpkk、pc4cl、ntras四个基因分别连接到pedtduet-1载体上，得到4个重组载体，将4个重组载体分别转化到escherichiacolibl21中，得到分别表达4种酶的重组大肠杆菌。采用与实施例1同样的方法表达纯化后得到四种纯酶。然后于100ml反应体系中加入这四种纯酶各2mg，d-丹参素20g/l，咖啡酸20g/l，coa1g/l，atp1g/l，六聚偏磷酸钠60g/l，ph8；于30℃反应5小时，最终液相色谱测定反应液中迷迭香酸浓度为36g/l，其液相图谱如说明书附图1。

实施例5：应用四种酶细胞合成迷迭香酸

将smpkk、ajpkk、pc4cl、ntras四个基因分别连接到pedtduet-1载体上，得到4个重组载体，将4个重组载体分别转化到escherichiacolibl21中，得到分别表达4种酶中的一种的重组大肠杆菌。采用与实施例1同样的方法诱导重组大肠杆菌表达酶。然后于100ml反应体系中加入这四种全细胞各20g/l，d-丹参素20g/l，咖啡酸20g/l，coa1g/l，atp1g/l，六聚偏磷酸钠60g/l，ph8；于30℃反应，时间5小时，最终液相色谱测定反应液中迷迭香酸浓度为23g/l。

实施例6：以重组大肠杆菌全细胞催化合成l-迷迭香酸

自然界中迷迭香酸的丹参素基团部份均匀为d型，本发明进一步以l-丹参素和咖啡酸为原料合成l-迷迭香酸(与迷迭香酸不同之处在于丹参素基团部份为l型)。此前，l-迷迭香酸一直未能以生物法合成得到。

选择coffeacanephora、dianthuscaryophyllus来源的编码迷迭香酸合成酶的基因ccras、dcras，与编码多聚磷酸盐激酶2-i、多聚磷酸盐激酶2-ⅱ、4-香豆酸辅酶a连接酶的基因一起，构建重组菌escherichiacolibl21(de3)/prsfduet-1-smpkk-ajpkk+ptduet-1-pc4cl-dcras。根据实施例1所述的方法，将其诱导表达，然后收集菌体。

于100ml反应体系中，细胞湿重为100g/l，l-丹参素20g/l，咖啡酸20g/l，coa1g/l，atp1g/l，六聚偏磷酸钠60g/l，ph8；于30℃反应，时间24小时。转化结束后液相色谱测定l-迷迭香酸浓度为33g/l，其液相图谱如说明书附图2。采用江苏汉邦科技有限公司的dac-hb50制备色谱柱制备转化样品，制备色谱条件为：流动相50％甲醇、柱温自然、流速3ml/min、进样量5ml。样品达到色谱纯99.9％，反复进样分离得到的产品于50℃下真空旋转蒸干。称取制备得到的样品0.5g，溶于去离子水中并定容至50ml，采用日本爱宕ap-300全自动旋光仪测定旋光度，其旋光度为因此，确认本实施例制备得到的迷迭香酸为l-迷迭香酸。

实施例7：以重组大肠杆菌全细胞催化合成迷迭香酸

构建如下2种重组菌escherichiacolibl21(de3)/prsfduet-1-smpkk-ajpkk(合名为e1)，escherichiacolibl21(de3)/petduet-1-sc4cl-ccras(命名为e2)。

根据实施例1所述的方法，将e1和e2分别诱导表达，然后收集菌体。于100ml反应体系中，e1细胞湿重为30g/l，e2细胞湿重为50g/l、d-丹参素100g/l，咖啡酸10g/l，六聚偏磷酸钠300g/l，coa1g/l，atp1g/l，ph9；于40℃反应，时间48小时。转化结束后液相色谱测定迷迭香酸含量为162g/l。

实施例8：以重组大肠杆菌全细胞催化合成迷迭香酸

构建如下2种重组菌escherichiacolibl21(de3)/prsfduet-1-smpkk-ajpkk-at4cl(合名为e3)，escherichiacolibl21(de3)/pacycduet-1-ccras(命名为e4)。

根据实施例1所述的方法，将e3和e4分别诱导表达，然后收集菌体。于100ml反应体系中，e3细胞湿重为100g/l，e4细胞湿重为100g/l，d-丹参素1g/l，咖啡酸1g/l，coa0.5g/l，atp1g/l，六聚偏磷酸钠3g/l，ph5；于15℃反应，时间48小时。转化结束后液相色谱测定迷迭香酸含量为1.3g/l。

实施例9：以重组大肠杆菌全细胞催化合成迷迭香酸

构建如下2种重组菌escherichiacolibl21(de3)/prsfduet-1-ntras-at4cl(合名为e5)，escherichiacolibl21(de3)/pacycduet-1-smpkk-ajpkk(命名为e6)。

根据实施例1所述的方法，将e5和e6分别诱导表达，然后收集菌体。于100ml反应体系中，e5细胞湿重为100g/l，e6细胞湿重为100g/l，d-丹参素1g/l，咖啡酸1g/l，六聚偏磷酸钠3g/l，coa1g/l，atp0.5g/l，ph7；于15℃反应，时间1小时。转化结束后液相色谱测定迷迭香酸含量为1.5g/l。

实施例10：以重组大肠杆菌全细胞催化合成迷迭香酸

构建重组菌escherichiacolibl21(de3)/prsfduet-1-ntras-at4cl+pcdfduet-1-smpkk-ajpkk。根据实施例1所述的方法，将重组菌诱导表达，然后收集菌体。于100ml反应体系中，细胞湿重为1g/l，d-丹参素1g/l，咖啡酸1g/l，atp1g/l，coa1g/l，六聚偏磷酸钠20g/l，ph8；于40℃反应，时间48小时。转化结束后液相色谱测定迷迭香酸含量为1.6g/l。若该反应体积中的atp和coa浓度为0g/l，则在其他转化条件不变的情况下，迷迭香酸含量为0.4g/l。

实施例11：以重组大肠杆菌全细胞催化合成迷迭香酸

构建如下2种重组菌escherichiacolibl21(de3)/prsfduet-1-smpkk-ajpkk(合名为e1)，escherichiacolibl21(de3)/petduet-1-sc4cl-ccras(命名为e2)。

根据实施例1所述的方法，将e1和e2分别诱导表达，然后收集菌体。于100ml反应体系中，e1细胞湿重为30g/l，e2细胞湿重为50g/l、d-丹参素100g/l，咖啡酸10g/l，六聚偏磷酸钠300g/l，coa1g/l，atp0.1g/l，ph9；于40℃反应，时间48小时。转化结束后液相色谱测定迷迭香酸含量为146g/l。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。