一种利用乙醇生产聚羟基丁酸的重组菌及其构建方法与应用与流程

本发明涉及一种利用乙醇生产聚羟基丁酸的重组菌及其构建方法与应用，属于基因工程技术领域。

背景技术：

可降解塑料的研究是一个环境科学、高分子化学、生物学科交叉的全新领域。可降解塑料以生物资源为原料，取代了不可再生的化石资源，如石油和煤炭等；在生态环境中完全降解为水和二氧化碳，最重要的是可以节约能源、保护环境、实现资源与环境的可持续发展。聚羟基脂肪酸酯(pha)正是在这种情况下发展起来的一类高分子材料。其中聚羟基丁酸(phb)是pha的典型代表。

phb作为一种微生物合成塑料，不仅具有化学合成塑料的特性，而且还有如下特点：密度大、光学活性好、透氧性低、抗紫外线辐射、生物可降解性、生物组织相容性、压电性和抗凝血性等，可望在电子、光学、生物医学等高技术领域获得应用。

目前phb的合成方法主要有化学合成法和微生物发酵法，但是化学合成phb所使用的原料一般比较昂贵而且大部分有毒性，化学反应条件严苛，伴随的副反应较多，反应回收率较低，反应的产物分离困难，还会对环境造成二次污染，这些都是阻碍化学合成phb的问题。自然界中的很多原核微生物都能生产phb，包括光能，化能自养和异养菌共计300多种。天然的phb生产菌株r.eutropha含有pha操纵子，已经被研究工作者广泛应用到不同的工程菌株中以提高phb的产量(aldori,keaslingjd.metabolicengineeringofpoly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate)compositioninrecombinantsalmonellaentericaserovartyphimurium[j].biotechnology&bioengineering,2010,76(2):108-114.)。

随着乙醇产量的增加，目前越来越需要加强利用乙醇加工新产品，实现从低价值产品向高价值产品的转化。然而，目前暂无以乙醇为碳源合成高附加值产品或材料的相关报道。

技术实现要素：

为了解决如何利用乙醇高效合成聚羟基丁酸phb的问题，本发明提供了一种利用乙醇生产聚羟基丁酸的重组菌，所述重组菌过表达突变的乙醇脱氢酶基因adhe，β-酮基硫解酶基因phaa，乙酰乙酰辅酶a还原酶基因phab和聚羟基脂肪酸合成酶基因phac，宿主菌为大肠杆菌。

进一步地限定，所述乙醇脱氢酶基因adhe，来源于大肠杆菌(escherichiacoli)，genbankid:945837；所述突变的乙醇脱氢酶基因adhe，是指乙醇脱氢酶基因adhe编码的氨基酸序列的第267位丙氨酸突变为苏氨酸，第568位的谷氨酸突变为赖氨酸。

进一步地限定，所述β-酮基硫解酶基因phaa，来源于真氧产碱杆菌h16(ralstoniaeutrophah16)，乙酰乙酰辅酶a还原酶基因phab,来源于真氧产碱杆菌h16(ralstoniaeutrophah16)；聚羟基脂肪酸合成酶基因phac，来源于真氧产碱杆菌h16(ralstoniaeutrophah16)。

进一步地限定，所述宿主菌为大肠杆菌w3110。

本发明还提供了上述利用乙醇生产聚羟基丁酸的重组菌的制备方法，步骤如下：

1)以大肠杆菌基因组dna为模板，设计引物克隆乙醇脱氢酶基因adhe，连接到质粒载体上，获得未突变的重组质粒，然后通过定点突变将乙醇脱氢酶基因adhe编码的氨基酸中第267位的丙氨酸突变为苏氨酸，第568位的谷氨酸突变为赖氨酸，得到突变的乙醇脱氢酶基因adhe，记为乙醇脱氢酶基因adhe(a267t，e568k)，获得重组质粒i；

2)克隆获得β-酮基硫解酶基因phaa，乙酰乙酰辅酶a还原酶基因phab和聚羟基脂肪酸合成酶基因phac，将上述3个基因连接到质粒载体上，获得重组质粒ii；

3)将步骤1)所得的重组质粒i和步骤2)所得的重组质粒ii同时导入到宿主细胞，获得重组菌。

进一步地限定，步骤1)所述质粒载体，为质粒pacycduet-1；步骤2)所述质粒载体，为质粒pbad24。

进一步地限定，步骤1)所述克隆乙醇脱氢酶基因adhe所使用的引物如seqidno.1-seqidno.2所示；所述乙醇脱氢酶基因adhe编码的氨基酸中第267位的丙氨酸突变为苏氨酸所利用的引物如seqidno.3-seqidno.4所示；所述乙醇脱氢酶基因adhe编码的氨基酸中第568位的谷氨酸突变为赖氨酸所使用的引物如seqidno.5-seqidno.6所示。

本发明还提供了上述重组菌在发酵生产聚羟基丁酸中的应用。

进一步地限定，所述发酵生产聚羟基丁酸的方法包括：

1)活化重组菌；

2)将步骤1)所得的活化重组菌接种到含有氨苄青霉素和氯霉素的柠檬酸铁铵液体培养基中进行发酵培养。

进一步地限定，步骤2)所述的发酵培养，是按2％(体积分数)的接种量接种，在37℃，180rpm的条件下培养至od600达到0.6时，加入100μm异丙基硫代半乳糖苷和6.6mm阿拉伯糖诱导，诱导后置于30℃，180rpm的条件下继续培养48h后终止发酵。

进一步地限定，所述重组质粒i和重组质粒ii导入宿主细胞采用热激转化法

定义和缩写

在本发明中使用下列的缩写或简称：

乙醇脱氢酶基因：adhe；

β-酮基硫解酶基因:phaa；

乙酰乙酰辅酶a还原酶基因:phab；

聚羟基脂肪酸合成酶基因:phac；

大肠埃希氏杆菌(escherichiacoli)：e.coli；

真氧产碱杆菌h16：ralstoniaeutrophah16。

“热激转化”或“热转化”指分子生物学中转染技术的一种，用来将外来基因整合到宿主基因中并稳定表达，其利用受到热激后，细胞膜出现裂隙，将外来基因导入宿主基因或将外来质粒导入宿主原生质体，又热激转化或热转化等。

“过量表达”或“过表达”指特定的基因在生物体中大量表达，表达量超过正常水平(即，野生型表达水平)，可以通过增强内源表达或引入外源基因来实现。

有益效果

本发明以大肠杆菌这种模式菌株为宿主菌，实现了以乙醇为底物，合成得到聚羟基丁酸，为乙醇的生物利用以及聚羟基丁酸的微生物合成提供了新的技术方法。

本发明通过在大肠杆菌中过表达大肠杆菌的乙醇脱氢酶基因adhe(a267t,e568k)；同时过表达真氧产碱杆菌h16(ralstoniaeutrophah16)的β-酮基硫解酶基因phaa，乙酰乙酰辅酶a还原酶基因phab，聚羟基脂肪酸合成酶基因phac，首次实现以乙醇为碳源，经乙酰辅酶a转化形成聚羟基丁酸的生物合成路径，是一种环境友好型的合成方法。

附图说明

图1为利用乙醇合成聚羟基丁酸的代谢途径示意图；

图2为pacycduet1-adhe(a267t,e568k)载体图谱；

图3为本发明重组菌和对照菌株的生长情况图；

图4为本发明重组菌和对照菌株的phb生产情况图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，但本发明不受实施例的限制。

以下实施例中所用材料、试剂、仪器和方法，未经特殊说明，均为本领域中的常规材料、试剂、仪器和方法，均可通过商业渠道获得。

本领域技术人员应该理解，下述pcr扩增，胶回收、酶切、连接等各个步骤均按照标准的分子克隆技术进行；上述过量表达的4种基因共同克隆到大肠杆菌(e.coli)中，各个步骤均按照标准的分子克隆技术进行。

所用酶试剂购自mbifermentas公司，提取质粒所用的试剂盒和回收dna片段所用的试剂盒购自美国omega公司，相应的操作步骤按照产品说明书进行；所有培养基如无特别说明均用去离子水配制。

质粒pbad24：记载在aldori,keaslingjd.metabolicengineeringofpoly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate)compositioninrecombinantsalmonellaentericaserovartyphimurium[j].biotechnology&bioengineering,2010,76(2):108-114；公众可通过中国科学院青岛生物能源与过程研究所获得。

质粒pacycduet-1购买自emdbiosciences(novagen)；

质粒定点突变试剂盒购买自天根(km101型号)；

β-酮基硫解酶基因phaa，乙酰乙酰辅酶a还原酶基因phab和聚羟基脂肪酸合成酶基因phac，上述3个基因共同组成了pha操纵子(genbank:mh558939.1)，ralstoniaeutrophah16为真氧产碱杆菌h16，上述基因及菌株记载在aldori,keaslingjd.metabolicengineeringofpoly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate)compositioninrecombinantsalmonellaentericaserovartyphimurium[j].biotechnology&bioengineering,2010,76(2):108-114.公众可通过中国科学院青岛生物能源与过程研究所获得。

培养基配方：

1)种子液摇瓶培养基

lb培养基：5g/l酵母粉，10g/lnacl，10g/l蛋白胨，其余为水，121℃，20min灭菌。

2)发酵生产摇瓶培养基

柠檬酸铁铵培养基：9.8g/lk2hpo4·3h2o，2.1g/l一水合柠檬酸，0.3g/l柠檬酸铁铵,3.0g/l硫酸铵，0.2g/lmgso4·7h2o，1000×微量元素。

在实际培养过程中，可向上述培养基中添加一定浓度的抗生素以维持质粒的稳定性，如终浓度100mg/l的氨苄青霉素和终浓度50mg/l的氯霉素。

实施例1.利用乙醇生产聚羟基丁酸的重组菌的构建。

1.重组质粒pacycduet1-adhe(a267t,e568k)的构建

1)以e.coliw3110为模板，利用引物1，其核苷酸序列如seqidno.1所示；引物2，其核苷酸序列如seqidno.2，pcr克隆乙醇脱氢酶基因adhe(geneid:945837)，克隆获得的基因利用胶回收试剂盒回收目的片段。

2)步骤1)克隆所得的乙醇脱氢酶基因adhe与载体pacycduet-1分别经bamhi，saci双酶切后，利用胶回收试剂盒回收酶切后目的片段adhe和载体pacycduet-1，再进行连接，连接产物转化e.colidh5α，筛选阳性克隆，得到重组质粒pacycduet-1-adhe；

3)将步骤2)所得的重组质粒通过质粒定点突变试剂盒，参照试剂盒说明书，利用引物3，其核苷酸序列如seqidno.3所示；引物4，其核苷酸序列如seqidno.4所示，进行定点突变得到重组质粒pacycduet-adhe(a267t)，即第267位丙氨酸突变为苏氨酸；

4)将步骤3)所得的重组质粒通过质粒定点突变试剂盒，参照试剂盒说明书，利用引物5，其核苷酸序列如seqidno.5所示；引物6，其核苷酸序列如seqidno.6进行定点突变得到重组质粒pacycduet-adhe(a267t，e568k)，即第568位的谷氨酸突变为赖氨酸，获得重组质粒i，记为pacycduet-adhe(a267t,e568k)。

2.重组质粒pbad-ae-pha的构建

1)pha操纵子(genbank:mh558939.1)本实施例中所使用的pha操纵子来源于psp2质粒，该质粒记载在aldori,keaslingjd.metabolicengineeringofpoly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate)compositioninrecombinantsalmonellaentericaserovartyphimurium[j].biotechnology&bioengineering,2010,76(2):108-114.公众可通过中国科学院青岛生物能源与过程研究所获得。

2)步骤1)中所述的含有pha操纵子(包含β-酮基硫解酶基因phaa，乙酰乙酰辅酶a还原酶基因phab，聚羟基脂肪酸合成酶基因phac)的质粒psp2与载体pbad24分别经ecori，hindiii双酶切后，利用胶回收试剂盒回收酶切后片段pha和载体pbad24，再进行连接，连接产物转化e.colidh5α，筛选阳性克隆，得到重组质粒ii，记为pbad-ae-pha。

3.重组菌株构建

按照takara感受态制备试剂盒的操作步骤制备野生型对照菌株e.coliw3110感受态，将重组质粒ipacycduet-adhe(a267t,e568k)和重组质粒iipbad-ae-pha通过热激法同时转化至宿主菌株e.coliw3110感受态细胞，得到重组菌，编号为zg-3094；将空载体pacycduet1和重组质粒iipbad-ae-pha通过热激法同时转化至宿主菌株e.coliw3110感受态细胞，得到重组菌，编号为zg-3095。

通过上述方法获得了以大肠杆菌为宿主菌，过表达突变的乙醇脱氢酶基因adhe，β-酮基硫解酶基因phaa，乙酰乙酰辅酶a还原酶基因phab和聚羟基脂肪酸合成酶基因phac的重组菌。

实施例2.重组菌的摇瓶发酵制备聚羟基丁酸。

本实施例共进行三组实验，以说明本发明的重要性。

对照1：重组菌zg-3095，以葡萄糖和乙醇为混合碳源；

对照2：无菌株，以葡萄糖和乙醇为混合碳源；

实验组：重组菌zg-3094，以葡萄糖和乙醇为混合碳源。

(1)将lb试管中过夜活化后的重组菌zg-3095(od600值为2)及重组菌zg-3094(od600值为2)按1:50的体积比例接种到含有50ml的柠檬酸铁铵液体培养基的250ml摇瓶中(内含100mg/l的氨苄青霉素和50mg/l的氯霉素)，三组均加2g/l葡萄糖和10g/l的乙醇。37℃、180rpm条件下振荡培养。od600达到0.6左右时，加入100μm/liptg，6.6mm/lara(阿拉伯糖)诱导表达，诱导后置于30℃、180rpm继续培养48h至发酵结束。培养过程定时用nh3·h2o或koh调节ph。

(2)收集菌体，4℃，8000rpm离心20min，将菌体细胞用纯水和乙醇分别洗两次，最后获得的菌体在60℃烘箱中过夜烘干。烘干的菌体碾碎后用滤纸包裹置于索氏提取器中，加入氯仿，加热萃取12h。氯仿萃取液通过旋蒸浓缩后得到产物。

(3)旋蒸后即可得产物聚羟基丁酸；在250ml摇瓶发酵水平，重组菌zg-3094以葡萄糖和乙醇为混合碳源，聚羟基丁酸的产量为3.298g/l±0.001，转化率为36％；对照菌zg-3095以葡萄糖和乙醇为混合碳源，聚羟基丁酸的产量为0.07±0.005，转化率为4.6％。由此表明，对照菌zg-3095无法利用乙醇合成聚羟基丁酸，其合成的微量的聚羟基丁酸来源于少量的葡萄糖；重组菌zg-3094可以利用乙醇高效的合成聚羟基丁酸，其聚羟基丁酸的产量是对照菌的47倍。本发明是以乙醇为底物合成聚羟基丁酸的一种新型的，高效的代谢途径。

虽然本发明已以较佳的实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明精神和范围内，都可以做各种的改动与修饰，因此，本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

核苷酸序列表

<110>中国科学院青岛生物能源与过程研究所

<120>一种利用乙醇生产聚羟基丁酸的重组菌及其构建方法与应用

<130>

<160>6

<170>patentinversion3.5

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<212>dna

<213>引物1

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<212>dna

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<212>dna

<213>引物3

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