一种嗜低温产香特性突出的美极梅奇酵母及其应用的制作方法

本发明属于微生物应用技术领域，具体涉及一种嗜低温产香特性突出的美极梅奇酵母及其在冰葡萄酒酿造中的应用。

背景技术：

香气是决定葡萄酒品质的关键因素，是多种化合物相互作用的结果。葡萄酒中的香气主要来源有三个：葡萄果实的品种香气，发酵微生物代谢产生的发酵香气，以及在陈酿期间所产生的陈酿香气。葡萄酒香气成分受多种因素影响，如葡萄品种、原料成熟度、酿造工艺、陈酿条件等。

酵母菌在葡萄酒酿造中起着关键性的作用。以冰酒酿造为例，酵母负责在高糖和高渗环境中将糖转化成酒精，最终获得一款香气浓郁、口感独特的浓甜葡萄酒。而酿酒酵母的好坏是决定葡萄酒质量的关键因素，它将葡萄汁中的绝大部分糖转化为酒精和二氧化碳，同时生成甘油、高级醇、酯、醛等代谢产物，直接影响了葡萄酒的色泽、香气及口感。因此酿酒酵母是控制葡萄酒质量的灵魂，不同的酿酒酵母可以赋予葡萄酒不同的感官风味。

冰酒与普通干红葡萄酒相比，其发酵具有原料高糖，高酸环境、且发酵过程要求低温等特殊环境，低温发酵可以促进醋类、醇类、酮类、菇烯类等芳香物质的合成，提高葡萄酒质量，这就需要筛选出对低温的耐受性较好的、发酵快的低温酿酒酵母。

我国在葡萄酒酵母的研究利用方面还处于起步阶段，酿造冰酒的酵母大多从国外引进。为了满足酿酒产业的快速发展，筛选出具有独特发酵特性的酵母已成为当今葡萄酒产业的趋势。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供了一种嗜低温产香特性突出的美极梅奇酵母菌y6(metschnikowiapulcherrimay6)及其在冰葡萄酒酿造中的应用。该酵母菌于2019年4月12日保存于广东省微生物菌种保藏中心(gdmcc)，地址为中国广东省广州市先烈路100号，广东省微生物研究所(510075)，保藏编号为gdmccno：60631，分类命名为metschnikowiapulcherrima。该酵母菌的菌株分离自吉林省集安市冰冻维达尔(维达尔是一种葡萄品种)葡萄的表面。

本发明所述的美极梅奇酵母菌y6(metschnikowiapulcherrimay6)，在15℃下经过ypd固体培养基48h培养后的菌落为圆形、浅红色、有光泽，其边缘整齐，菌体粘稠，易挑起。细胞呈卵圆形，单极出芽。

本发明还提供了该酵母菌在冰葡萄酒酿造中的应用。本发明提供的酵母菌具有在低温下发酵速度快，而且产香特性突出的特点，可应用于冰葡萄酒和其它葡萄酒的酿制。

附图说明

图1为所述美极梅奇酵母菌y6在ypd平板(a)及显微镜(b)下的形态图；

图2为所述美极梅奇酵母菌y6的26srdna序列系统发育树；

图3为所述美极梅奇酵母菌y6的最适生长温度曲线；

图4为所述美极梅奇酵母菌y6的产香分析的离子色谱图；

图5为商品对照酵母菌株r2的产香分析的离子色谱图。

具体实施方式

实施例中的方法，如无特别说明，均为常规方法。

实施例中ypd液体培养基配方如下：葡萄糖(20g/l000ml)，蛋白胨(20g/1000ml)，酵母提取物(10g/1000ml)，去离子水1000ml，ph值自然，121℃灭菌15min。ypd固体培养基是在上述液体培养基中添加琼脂(20g/1000ml)后得到。

实施例1：所述美极梅奇酵母菌y6的获取及鉴定

本发明所述美极梅奇酵母菌的菌株分离自吉林省集安市冰冻维达尔葡萄的表面。分离过程为：采集维达尔葡萄去除葡萄梗等杂物，用生理盐水在15℃下浸泡10分钟，取5ml浸泡液加入100ml富集培养基中(富集培养基配制方式：酵母粉1克，蛋白胨2克，葡萄糖5克，去离子水100ml，ph＝5.0，121℃灭菌20min，冷却后加入氯霉素和链霉素各10mg)，15℃、150转/min培养2天，获得富集培养液。富集培养液再用液体ypd培养基稀释10⁶倍，涂布于ypd固体培养基上，15℃培养3天。选取生长快的、菌落形态及颜色不同的菌落共计22个，进行划线纯化，纯化后的菌落转移至ypd液体培养基中培养至对数期。以2％(v/v)的接种量分别接种于冰冻压榨的维达尔葡萄汁中，在15℃条件下发酵60天。经过感官评判(上述22个菌落均需制备冰酒后，根据香气浓烈程度再经过感官评判)，最终选出标号y6的酵母菌(记为y6菌株)，由该酵母菌发酵制备的冰酒香气最为浓烈。将y6菌株在ypd固体培养基表面15℃条件下培养48小时，菌落颜色呈乳白色、菌落形状为圆形、表面光滑、中心凸起、边缘规则、粘度大且易于挑起(如图1a)所示。y6菌株在显微镜(10x40)下观察(如图1b)，菌体为椭圆形、无分支、可观察到常有大小两个细胞相连，推测该菌株为酵母菌，并以出芽方式生殖。

将培养至对数生长期的y6菌株培养液(使用ypd液体培养基)经过离心(8000转/分)收集菌体。采用酵母基因组dna提取试剂盒(bioteke公司)提取酵母基因组。以所提取的基因组为模板，以酵母菌26srdna基因d1/d2区序列扩增引物nl1和nl417(正向引物为5'-gcatatcaataagcggaggaaaag-3'，反向引物为：5'-ggtccgtgtttcaagacgg-3')为引物，通过pcr的方法(pcr扩增体系为：10xpcrbuffer5ul，dntps4ul，引物f1和r1各1ul，taq酶0.5ul，模板1ul，超纯水补充至50ul；扩增条件为：94℃预变性3min，94℃变性3min，54℃退火1min，72℃延伸1min，30个循环，72℃末端延伸10min)扩增菌株的26srdna基因序列。pcr产物序列的测定由吉林省库美生物科技有限公司完成。测序结果在ncbi数据库中进行blast进行同源比对，选取同源性高的菌株来构建系统发育树。该菌株26srdna基因的核苷酸序列如seqidno.1所示，系统进化树如图2所示(图2说明这个序列与ky108496.1，即与美极梅奇酵母最相似，所以命名这个菌株为美极梅奇酵母菌y6)。该菌与genbank：ky108496.1(metschnikowiapulcherrima-美极梅奇酵母)相似度最高，同源性达到99％。结合菌株的形态学观察结果可初步确定该菌株属于美极梅奇酵母，初步命名该酵母菌株为美极梅奇酵母菌y6(metschnikowiapulcherrimay6)。

实施例2：所述嗜低温酵母菌株最适生长温度测定

将实施例1得到的美极梅奇酵母菌y6(metschnikowiapulcherrimay6)接种于ypd液体培养基中，在15℃条件下培养2天。将上述活化后的菌株以2％(v/v)接种量接种于ypd液体培养基中，分装至5组试管中，分别放入5、10、15、20、25℃的摇床中培养(三组平行)，两天后用紫外可见光光度计在600nm下测定培养物的吸光度，来探究菌株的最适生长温度。如图3所示，所述美极梅奇酵母菌y6(metschnikowiapulcherrimay6)在5℃条件下能够生长，随着温度的增加，其生长速度越快，其最适生长温度为15℃，超过15℃，其生长速度趋缓，说明该菌株是嗜低温酵母菌。

实施例3：所述嗜低温酵母菌株与商业酵母酿造冰葡萄酒的对比实验。

将实施例1得到的美极梅奇酵母菌y6(metschnikowiapulcherrimay6)和商业酿酒酵母r2(由吉林省华信葡萄酒厂赠送)分别在ypd固体和液体培养基上传代，按l0⁵cfu/ml接种于3l在冰冻条件下压榨的维达尔葡萄汁中，15℃条件下静置培养67天。在发酵过程中可观察到所述美极梅奇酵母菌y6(metschnikowiapulcherrimay6)能够更快地达到生长旺盛期，菌体数急速增长，数量超过商业酿酒酵母r2，并在很长一段时间内细胞总数稳定在较高的水平，体现出了很强的环境适应能力和较高的发酵活力。

酯类、高级醇、有机酸等挥发性香气物质含量的测定：用agilent6890气相色谱(gc)和agilent5975质谱(ms)联用仪检测上述获得的酿造葡萄酒中各种挥发性香气物质种类和含量。

挥发性香气物质分析结果如图4和图5所示。在发酵香气的复杂性方面和含量方面，所述美极梅奇酵母菌y6(metschnikowiapulcherrimay6)都超过了商业酿酒酵母。

从挥发性物质种类上比较，所述美极梅奇酵母菌y6(metschnikowiapulcherrimay6)产生了酯类、醇类、酸类、醛类、酮类、烷烃类、萜烯类和酚类8中物质，而商业酿酒酵母不产生酚类物质。

从主要风味物质的种类(图4、图5及表1，以检出挥发物质的总量为100％计算，表1中的数值是挥发物质的相对百分含量)上比较，所述美极梅奇酵母菌y6(metschnikowiapulcherrimay6)产生了商业酿酒酵母所不产生的棕榈酸乙酯、异丁醇和十四酸乙酯；并且美极梅奇酵母菌y6(metschnikowiapulcherrimay6)产生了商业酿酒酵母所没有的一些痕量香气物质，如乙酸庚酯、甲氧基乙酸戊酯、正辛酸异丁酯、8-非酮酸乙酯、乙酸异丁酯、癸基甲酯、顺式-4-辛烯酸乙酯、丙位庚内酯、十五酸乙酯、棕榈酸甲酯、硬脂酸乙酯、3-辛醇、1-氨基-2-丙醇、正丁醇、1-壬醇、2-十一醇、愈创木酚、邻甲酚、间甲酚等，这些成分对酒的香气同样有着突出的贡献。

表1：冰酒中风味物质检测对比结果

从主要风味物质含量上比较，所述美极梅奇酵母菌y6(metschnikowiapulcherrimay6)产生的主要风味物质，如乙酸异戊酯、棕榈酸乙酯、十四酸乙酯、乙酸苯乙酯、反油酸乙酯、己酸异戊酯(果香、新鲜香蕉味)、月桂酸甲酯(干果味)、苯甲醇(花香、玫瑰色气味)，分别是商业酿酒酵母产生量的2.5倍、2.5倍、1.9倍、2.75倍、3.48倍、3.1倍、2倍、3.15倍。此外月桂酸乙酯、乙酸乙酯(果香、酯香)、丁酸乙酯(果香、草莓香)、乙酸己酯等的含量也有大幅的提高。

由此可见，本实验优选得到的嗜低温冰酒酿酒酵母不仅能快速地完成整个冰酒的酿造过程使其符合国家标准，同时能够有效的改善冰酒香气，增加冰酒的香气浓郁性和复杂性。

<110>吉林大学

<120>一种嗜低温产香特性突出的美极梅奇酵母及其应用

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